蓝藻细胞外囊泡的分离和表征

蓝藻菌株是从几个培养物集合中获得的（详见 讨论 ）。 1. 蓝藻培养 按照以下步骤培养海洋蓝藻 原绿球菌 和 同步球菌 。 使用适当的培养基（如Pro99或SN）在聚碳酸酯烧瓶中培养原绿球菌和Synecho球菌菌株（见材料表）。有关详细信息，请参阅以前发布的参考文献23，24。 通过在实验所需的所需温度和辐照度条件下，通过两到三次转移（每次传代将1：20稀释的培养基到新鲜培养基中）来培养培养物，从而适应培养物。注：典型的生长条件23，25包括在8-150μmol光子m-2 s-1辐照度下的温度在15-30°C之间，但单个菌株耐受性和最优度差异很大26 ，需要根据相关培养物收集说明或文献的指导进行设置。使用荧光培养物或流式细胞术计数23监测生长速率，并确保培养物在开始实验之前以一致的稳态指数速率生长。 一旦细胞达到晚期指数期（例如，20 mL <250 mL <2 L < 10 L < 20 L），进行一组从较小体积到较大体积的连续逐渐转移。注意：大容量培养不能从少量起始培养物中直接接种。请注意，较大的培养物可能需要添加缓冲液（例如1 mM HEPES，pH 7.5或3.75 mM TAPS，pH 8），以及补充碳酸氢钠或用无菌空气冒泡24。 培养淡水蓝藻 Synechocystis sp. PCC 6803。 制备集胞藻属PCC 6803的培养物，通过曝气（以1 L / min的鼓泡空气）在30°C下，在16小时光照（光子计数为50μmol m-2 s-1）/ 8小时黑暗状态下培养它，在BG11培养基27中在730nm（OD730）处的光密度高达1.0（指数相）来培养用作接种物。 将30 mL该培养物 的Synechocystis sp. PCC 6803接种在570 mL BG11培养基中至1 L玻璃气体洗涤瓶中0.05的OD 730。 允许细胞在30°C下，在16小时光照（光子计数为50μmol m-2 s-1）/ 8小时黑暗状态下通气生长，直到最终OD 730为1.0-1.5。 2.从小颗粒（囊泡）部分分离蓝藻生物质 注意：首先，建议通过离心造粒细胞从上清液中分离细胞。然而，当培养体积太大而无法实现时，可以跳过离心，直接使用胶囊过滤（步骤2.4）过滤整个培养物。 进行离心分离细胞（最适合容量高达约4 L，具体取决于可用的离心机容量）。 高压灭菌或彻底清洗，使用I型超纯级水（见 材料表）清洗和清洁离心机瓶，确保没有残留的肥皂或其他材料残留。 将培养样品装入适当数量的离心机瓶中并进行平衡。 在4°C下旋转培养>10，000× g 10分钟。如果上清液保持明显浑浊，则以最大速度将离心条件增加到20分钟并重试。 小心地将上清液或移液到干净的容器中，然后进行步骤2.2-2.4中提到的以下过滤选项之一。 选项 1：使用 0.2 μm 过滤器进行注射器过滤（样品体积高达 ~50 mL）。 用基本上无细胞的培养基填充无菌的50 mL注射器，并通过0.2（或0.45）μm聚醚砜（PES）过滤器过滤（参见 材料表）。将滤液收集在干净、无菌的容器中。 重复此步骤，直到过滤器堵塞（例如，使用注射器难以推动）。更换新的过滤器，然后继续操作，直到样品被彻底过滤。 选项 2：执行 0.2 μm 真空过滤（最高约 4 L）。 使用I型超纯级水彻底清洗和清洁真空设备，将其连接到真空疏水阀和泵（见 材料表）。 插入适当直径的0.2μm过滤器并夹紧真空设备。 加入少量培养样品，确保真空压力保持在<10 psi。 继续以小增量过滤培养物，直到完成。如果过滤速度明显减慢，请停止真空并更换过滤器。 将含有囊泡的<0.2μm级分收集到干净的容器中。 选项 3：执行 0.2 μm 胶囊过滤（样品体积为 >~4 L） 用水和温和的洗涤剂清洗适当尺寸的柔性管和收集容器。用蒸馏水和去离子水冲洗材料。注意：在使用之前，应使用I型超纯级水冲洗材料。 将要过滤的培养物放置在安全、高处，最后的收集容器位于下方。将0.2μm胶囊过滤器（参见 材料表）流出口连接到一块管子上，并将其放入收集容器中。 将另一个管子放入样品中，通过用注射器将一些样品拉入管中来开始重力虹吸管，然后将管子连接到胶囊过滤器。使用通风口释放多余的空气，并用上清液填充腔室。 让材料通过胶囊移动，直到样品被彻底过滤。如果流速变得太慢（<~1/10的 起始流速，或与连续流动的流相反，逐渐下降），请等待或用蠕动泵施加轻柔的力，直到背压增加。或者，通过暂时断开过滤器来部分恢复流速，用超净水从流入侧反冲洗积聚的生物质，直到材料不再明显浑浊，然后重新启动过滤过程。 3. 浓缩囊泡样品 选项 1：执行离心超滤以浓缩小体积 （<500 mL） 的样品。 用 I 型超纯级水冲洗 15-20 mL 精选的超滤离心浓缩器。 将浓缩器装入离心机中，并在4°C下以4，400× g 旋转。 丢弃运行，并至少重复此步骤两次。 将上清液样品装入水冲洗的浓缩器中，并在相同条件下旋转。根据实验目标，可以丢弃或收集样品滤液以进行进一步浓缩（使用标称分子量限制为3 kDa的浓缩器）并进行分析。 重复此步骤，直到样品浓缩至最终体积〜15-30 mL。 选项 2：执行切向流过滤 （TFF），以浓缩大量 （>500 mL） 样品。 根据制造商的指南设置TFF设备（参见 材料表）。将蠕动泵连接到进气管路，并在截留管路上放置可调节的夹具。按照制造商的建议对TFF进行消毒，然后用1升I型超纯级水冲洗设备。注意：进气管路和截留管路应放入干净的样品储液槽（玻璃瓶）中。滤液管路应引导至废物容器或水槽中。 将<0.2μm滤液加入样品储液槽中。缓慢提高截留管路上的泵速和背压水平，以增加滤液管路的产量。 继续运行TFF，在去除材料时用培养上清液重新填充储液槽。避免在加工过程中让进气管从样品中出来，以避免引入气泡。确保进料压力不超过~10 psi，并且截留物以一致的速度流出TFF回到储液罐中。 一旦储液槽中的体积达到保持流入进气管路所需的尽可能低的量，就停止浓缩样品，而不会引入气泡。 用夹具关闭流出线。去除截留管路上的背压，并通过过滤器再循环浓缩的上清液约10分钟，将再循环速率降低至20-40mL / min以最大化回收率。 将截留管路移动到干净的容器中，从样品中取出进气管路，然后收集浓缩的材料。使用移液器回收样品储液槽中的任何剩余材料。 通过0.2μm注射器过滤器过滤浓缩的上清液（步骤2.2）以确保没有细胞残留。注意：步骤 3.2.7 是可选的。 如果需要，将最终浓缩物在4°C下储存约3周，然后移至囊泡纯化（步骤4）。 4. 囊泡分离纯化 按照以下步骤通过超速离心直接沉淀。 将浓缩的<0.2μm培养样品置于干净的超速离心管中。根据需要添加干净的培养基或缓冲液，以确保管子完全充满。注意：如果最终培养样品太大而无法放入一个试管中，则在洗涤步骤之前将材料沉淀在多个管中以组合，或者在同一管中连续沉淀。 如果需要，创建天平并在4°C下以~100，000 x g 旋转3小时。 用移液管小心地除去上清液。虽然蓝藻囊泡颗粒可以显示一些颜色，但它们通常是不可见的。 通过向超速离心管中加入新鲜培养基或洗涤缓冲液（例如1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（参见 讨论））来洗涤造粒材料，通过轻柔移液混合，然后像步骤4.1.2中那样再次旋转。再次重复洗涤过程。 用1mL移液管在管底反复但轻轻地上下移液，将最终沉淀重悬于新鲜培养物中。转移到干净的容器中。 执行密度梯度超速离心。 通过制作样品所需的缓冲液背景的4倍浓缩版本来制备碘克沙醇储液（参见 材料表）（参见 讨论）。 将4x缓冲液的一部分与三份60%碘克沙醇储备液混合，制成45%碘克沙醇溶液。 用1x缓冲液的体积稀释45%碘克沙醇，以最终碘克沙醇浓度为40%，35%，30%，25%，20%，15%和10%形成梯度介质的储备。注意：所需的总量将随超速离心机转子/管的容量而变化。 通过将等量的45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%碘二酚等量小心地叠加到超速离心管中，以利用管的整个体积，从而设置超速离心机密度梯度。注意：待纯化的细胞外囊泡样品应作为0%碘氧沙醇层的一部分放置在梯度的顶部。如果囊泡样品的最终体积超过0%层的大小，则将任何多余的囊泡样品与足够的45%碘克沙醇和/或缓冲液混合，以产生所需体积的10%或更高浓度的optiprep储备，并在梯度的相应位置使用这些囊泡。 在4°C下以〜100，000× g 旋转梯度6小时。 通过小心移液或使用馏分收集器收集馏分（通常每个0.5 mL，梯度约为4.5 mL）（参见 材料表）。 使用分析天平和校准的移液器测定每种馏分的密度（以g/ mL为单位），以测量已知体积样品的重量。从试管中取出样品，确定重量，然后直接返回样品。 用干净的缓冲液在新的超速离心管中稀释单个馏分，并按照步骤4.1.2-4.1.4中提到的洗涤材料。或者，使用透析或超滤柱回收颗粒。注意：蓝藻细胞外囊泡通常在碘克沙醇中迁移到~1.14-1.19 g / mL的浮力密度。 如果要在1-3周内使用，则将囊泡储存在4°C。如果囊泡不使用超过该时间，则在-20°C或-80°C下冷冻囊泡。 5. 分离囊泡的表征 进行负染色透射电子显微镜（见 材料表）（TEM;粒度，结构，纯度）。 为了提高图像质量，根据制造商的指南，使用辉光放电系统对以前涂层的TEM网格的表面进行辉光放电（参见 材料表）。 小心地应用〜5μL囊泡样品，静置5分钟。注意：囊泡浓度为>109 mL-1的样品通常将获得最佳结果;更稀释的样品每张图像的囊泡很少。 通过将网格的边缘触摸到一块干净的滤纸上来取出样品。 将20-50μL滴2%乙酸铀酰（见 材料表）滴到由塑料薄膜覆盖的平坦表面上，并将漂浮在其顶部的网格放置2分钟。 使用滤纸去除醋酸铀酰，并短暂漂浮在一滴超纯水上进行洗涤。再次重复水洗。注意：在步骤 5.1.5 之后，最终的干网格已准备好进行可视化。 对TEM（粒度，内部结构）进行超薄切片染色。 将步骤4.1.5中的沉淀与1mL 2.5%戊二醛在0.1M二甲酸钠缓冲液（pH 7）中重悬（参见 材料表），并在4°C下固定样品2小时。 在4°C下以〜100，000× g 旋转1小时。 用0.1M二甲苯酸钠缓冲液（pH 7）仔细洗涤沉淀，然后在4°C下以〜100，000× g 旋转1小时。 用1mL1%四氧化锇（见 材料表）（在0.1M二甲苯酸钠缓冲液中制备）固定沉淀1小时，然后按照步骤5.2.3洗涤。 在4°C下，用1mL上升级系列乙醇（50%，70%，90%，并在无水乙醇中两次）在10分钟中使样品脱水。 向沉淀中加入250μL环氧树脂（见 材料表）与无水乙醇（1：1）混合，并在4°C下孵育过夜。 将沉淀转移到500μL纯树脂中24小时。然后，将树脂在65°C下孵育48小时。注意：树脂现在已准备好按照制造商的说明通过超微球机进行切片（参见 材料表）。 用2%乙酸铀酰（在50%乙醇中）染色含有切片的网格5分钟。在流动的去离子水中轻轻洗涤载玻片10-15秒。放入一滴柠檬酸铅（见 材料表）并再染色5分钟。 像以前一样清洗，通过在滤纸上吸墨网格来除去水，然后风干网格。根据制造商的指南通过TEM进行可视化（参见 材料表）。 执行纳米颗粒跟踪分析（NTA）（粒度，浓度）。 使用透镜纸，小心地擦拭光学平面上的任何灰尘或可见材料。检查所有O形圈和其他密封件是否干净完好无损。打开仪器并启动软件。 使用干净的注射器，用超纯水填充腔室。确保没有气泡。 单击“ 启动相机” ，并可视化腔室中有关“指纹”的最佳区域。根据需要水平或垂直调整显微镜载物台，使信号强度均匀地穿过成像区域。相对于指纹水平移动成像区域（向右，朝向垂直线），查找附近背景信号较弱的区域。 将“ 屏幕增益” 和 “相机级别” 滑块滑动到最大，然后减小到最低级别以查看最暗的粒子。注意：蓝藻囊泡的典型设置使用7的屏幕增益和10-12之间的相机水平。 根据需要调整焦点，以确保粒子在整个视场中大致相等可见。继续将超洁净水推入腔室，直到您目视确认腔室是干净的。 使用不同的注射器从腔室中除去残留的水。 使用干净的1 mL注射器在腔室中填充培养基/缓冲液，检查样品所在的培养基/缓冲液的样品，以确定背景颗粒浓度。 从 SOP 下拉框中选择标准测量。更改设置以收集至少三个 60 秒视频的技术复制。按 “创建并运行脚本” ，然后按照提示操作。在重复之间将〜100μL样品推入腔室中。 采集完成后，用注射器除去残留的缓冲液，通过腔室冲洗3-5mL超纯水，并除去剩余的水。 使用1 mL注射器将囊泡样品加入腔室并确认采集设置。如果颗粒计数不在仪器的线性范围内（通常在20-80个颗粒/框架之间），则需要稀释或浓缩样品。在收集数据之前，将至少500μL样品推入腔室。 按照步骤5.3.8收集视频数据，确保在不同样品之间用超纯水清洁腔室。 使用相同的相机设置从同一生物体/实验中收集所有后续样品，以确保数据的可比性;“相机级别”设置中的更改可能会对获得的最终值产生显著影响。 使用软件的分析部分确定颗粒参数。选择“ 分析”>“打开实验”，然后加载示例文件。选择“ 处理所选文件” 并等待分析完成。确保对来自同一实验的所有后续样本使用相同的 检测阈值 。注意：由于蓝藻囊泡经常变暗，因此通常需要将检测阈值调整到最敏感（最低）值。 执行动态光散射（DLS）（粒度，zeta电位）。 通过0.2 μm孔径过滤器过滤进入DLS的任何样品，以筛选出干扰测量的大颗粒。 将1 mL培养基/缓冲液加入干净的比色皿中，以检查来自培养基的可能聚集体或其他纳米颗粒。将左侧磨砂面的比色皿放入微型取样器中，然后合上盖子。让样品平衡至少5分钟。 输入材质的折射率和材质吸收率（如果它们与水的默认值有很大不同）。注意：如果囊泡小于100nm，则材料特性的影响很小。当测量EV的表面电位（zeta电位）时，囊泡应重悬于原始生长培养基中。 单击 “仪器控制面板” 以检查读数，然后单击绿色图标开始数据采集。如果这些值看起来不错，并且您的培养基/缓冲液不包含聚集体或其他颗粒，您现在可以测量样品了。 将1mL囊泡样品加入干净的比色皿中，并按照步骤5.4.4中提到的收集数据。收集至少三个技术重复，每次10分钟。 进行脂多糖（LPS）分析，以确认样品中存在革兰氏阴性EV。 在95°C下在标准1x Laemmli样品缓冲液中加热变性囊泡样品10分钟（参见 材料表）。 与来自灰霉菌 （见 材料表）的0.2 U XIV型蛋白酶在37°C下孵育30分钟以除去污染的糖蛋白。 按照先前发布的方案16，通过电泳分离处理过的16%（w / v）SDS-聚丙烯酰胺凝胶。 为了检测LPS，用市售染色试剂盒或改良的银染色技术28染色凝胶。根据先前发表的参考文献29，30，通过染色凝胶的密度测定分析来量化相对LPS丰度。 6. 囊泡产率测量 使用步骤5.3中的纳米颗粒跟踪分析或等效技术，测量用于实验的生长培养基中的颗粒浓度。如果发现高颗粒数，请通过0.1μm孔隙过滤器过滤并重新检查。注意：为了最大限度地减少误差，培养基背景颗粒浓度应小于最低密度培养物中发现的颗粒浓度的10%。 通过在步骤1.1.2中实验所需的培养基和环境条件下培养细胞进行至少两次连续的连续转移来适应培养物。培养物需要在仍处于指数生长阶段时进行转移。确保测得的培养物生长速率在转移过程中保持一致;如果没有，请继续转移培养物，直到生长速率可重复。 接种时收集时间过程样品，并定期定时间隔，沿着生长曲线进入早期固定阶段。错开时间点，在整个指数增长范围内至少收集3-4个样本。要在每个时间点进行采样，请执行以下步骤。 通过清洁的，无菌的0.2μm注射器过滤器直接过滤1mL或更多培养物，并保存滤液以测量囊泡浓度，如步骤5.3所示。如果需要，冷冻时间过程样品。使用相对荧光跟踪培养物生长动态。 保存整个培养物的样本，以使用适合生物体的方法（流式细胞术;集落接种;或其他方式）确定种群规模。 在每个时间点获得细胞和囊泡样颗粒（每毫升）的测量值。 确定在指数增长阶段发生的时间点。要计算 r，即指数增长期间（通常是时间过程的开始和结束）期间两点之间每一代细胞产生的囊泡数，请使用 补充文件1中提供的方程。注意：此方法仅在稳态生长条件下有效;参考文献14详细介绍了计算的基本假设和推导。