植物寄生线虫的培养和筛选

用于本工作的 D. dipsaci 菌株G-137是从爱德华王子县的Fish Lake 4 Variety大蒜中收集的，由加拿大农业和农业食品公司提供。如果开始新鲜培养，请咨询Poirier等人的接种方法15。 1. D. 双蚜虫的培养 按照先前报告的工作准备介质和板15. 用23克/ L的NA（见 材料表）和超纯水制备500毫升营养琼脂（NA）培养基。使用无菌技术，将25 mL高压灭菌的NA培养基倒入20个一次性培养皿（直径100 mm x 15 mm深）中。让琼脂在室温（22°C）下凝固，盖上盖子约2小时，并放在一边供以后使用。 准备500 mL Gamborg B-5（GA）培养基，其中含有3.2 g / L的GA基础培养基，含有最少的有机物，20 g / L蔗糖，15g / L琼脂和蒸馏水（参见 材料表）。使用无菌技术，将50 mL高压灭菌的GA培养基倒入10个一次性培养皿（直径100 mm x 25 mm深）中。让琼脂在室温（22°C）下凝固，盖上盖子约5小时，并在室温下直立储存在无菌袋中，直到发芽转移。注：制造多余的培养基板以防发生污染。 按照从以前的工作修改的方法进行种子灭菌15. 用搅拌棒，2个镊子，玻璃培养皿和1升蒸馏水高压灭菌一个2升烧杯。准备200 mL 95%EtOH溶液和200 mL 15%商用漂白剂溶液。 使用豌豆种子（见 材料表）。将150粒种子倒入无菌的2升烧杯中，在实验室工作台上的本生燃烧器火焰附近用搅拌棒搅拌。 向烧杯内的种子中加入200mL 95%EtOH，在搅拌板上剧烈搅拌5分钟，然后在废容器中倒出EtOH。 将漂白剂溶液倒入烧杯中，使种子完全浸入其中。在搅拌板上剧烈搅拌20分钟，然后将漂白剂倒入废物容器中。 将蒸馏水倒入烧杯中浸泡种子，并在搅拌板上剧烈搅拌20分钟。重复水洗三次，每次洗涤后倒入蒸馏水。最后一次水洗后，将灭菌的种子倒入玻璃培养皿中。 为了检查污染，使用灭菌镊子将6个种子转移到层流罩中每个10厘米NA板（在步骤1.1.1中制备）。将种子排列在盘子的圆周周围（丰满的种子效果最好）。将板单独包裹在实验室包装膜中，并在26°C下在黑暗中孵育3天。注意：铺设比需要的更多的种子将允许选择性地使用未受污染的种子。 按照以下步骤执行芽移植。 在层流罩中，使用灭菌镊子在每个GA板上接种2个未受污染的种子（在步骤1.1.2中制备）。将板单独包裹在实验室包装膜中，并在室温下孵育7-10天，以使种子发芽。 按照从以前的工作修改的方法15进行体外饲养。 准备50 mL 20 g / L蔗糖溶液。过滤灭菌蔗糖溶液并放在一边。 在层流罩中，从现有培养板中切下一块含有根组织（〜2cm3）的琼脂。将500μL蔗糖溶液移液到新的GA板上，用豌豆幼苗，并将琼脂块放在蔗糖上。将板分别包裹在实验室包装膜中，并在室温（〜22°C）下将培养物保持在衬有铝箔的盒子中。 每8-9周在新鲜的GA平板上传代培养线虫以维持培养。线虫准备在〜8周后提取。 2. D. dipsaci的提取和收集 按照以下步骤执行 D. dipsaci 的提取。 高压灭菌 50 mL 烧杯、80 mm 漏斗、150 mL 蒸馏水和咖啡过滤器。将漏斗放入烧杯中，并用无菌咖啡过滤器排列漏斗。 在层流罩中，使用无菌手术刀将琼脂和根组织切成1 cm3 。将琼脂块转移到咖啡过滤器衬里的漏斗中，然后慢慢将蒸馏水倒在琼脂上以润湿咖啡过滤器。 从烧杯中取出咖啡过滤器衬里的漏斗，并用蒸馏水填充烧杯，直到更换咖啡过滤器衬里的漏斗后，水位刚好接触到过滤器的底部。 用铝箔覆盖咖啡过滤器衬里的漏斗和烧杯。在台面上放置过夜（16小时），让蠕虫通过咖啡过滤器进入收集烧杯。注意：当用解剖显微镜检查时，当蠕虫爬入琼脂时，线虫培养板已准备好提取。通常，平板在初始接种后6-8周准备提取。 进行 D. dipsaci的收集。注意：第二天， D. dipsaci 蠕虫将沉降到烧杯的底部。 取出咖啡过滤器衬里的漏斗，并从收集烧杯中吸取顶部40mL水;确保不会破坏已定居的蠕虫。使用10 mL塑料血清学移液器，将剩余的液体收集到15 mL锥形离心管中。注意：该集合可以直接用于测定。如果在24小时内不使用，请置于4°C。蠕虫可以在4°C下放置3天，对移动性没有明显影响。移除漏斗可能会干扰收集烧杯中的蠕虫。在收集之前，让它们沉降到底部。 3. 体外 小分子筛选 按照以下步骤准备测定板。 将高压灭菌的蒸馏水倒入无菌槽中，并使用多通道移液器将40μL蒸馏水从槽中分配到平底96孔板的每个孔中。 准备固定工具并添加化学品 在实验室工作台上的本生燃烧器火焰附近设置销钉托盘（参见 材料表）。将以下物质加入连续的销钉托盘中：25 mL 针清洁液、35 mL 50% DMSO（水中）、45 mL 蒸馏水、55 mL 70% EtOH 和 65 mL 95% EtOH。在每个纸盒前放置一张吸墨纸 通过在清洁溶液中插入针脚并在溶液中上下移动针脚三次（3x）来清洁固定工具。在该协议中，“3x”和“10x”被定义为在溶液中分别向上和向下移动引脚器三次或十次。吸墨纸上的针脚。再次重复此过程。 接下来，在蒸馏水中冲洗针脚3次，然后吸干针脚。再次重复该过程。 最后，在95%EtOH中冲洗针脚3倍，然后印迹针脚。再重复一次。点燃销钉，让乙醇蒸发。 通过将3x固定到化学板中，然后将10X针转移到测定板中，将96孔化学储备板中的化学物质添加到测定板中。在清洁液前的纸张上吸墨。 通过按以下顺序洗涤来清洁板之间的固定工具，在印迹纸上进行两次印迹：在50%DMSO中3倍（一次），在蒸馏水中3倍（一次），在75%EtOH中清洗3倍（一次），在95%EtOH中3倍（两次）。点燃销钉，让乙醇蒸发。 完成所有固定后，重复步骤 3.2.2。注意：筛选以60μM的最终浓度进行。 添加蠕虫 通过首先重悬，然后使用低保留尖端移液5μL到载玻片上进行观察，从收集中计数线虫的数量。使用解剖显微镜计数5μL中的线虫数量。 使用无菌蒸馏水将浓度调节至2个蠕虫/μL。使用多通道移液器和槽，向96孔板的每个孔中加入10μL（约20个蠕虫）。注意：使用所述培养和收集方法，每个培养板将收集约15，000 个D. dipsaci 线虫。每口井使用20个蠕虫，因为少量的蠕虫有助于移动和不移动的蠕虫的清晰可视化和核算。 将板密封在实验室包装膜中，并用湿纸巾包裹。放入盒子中并固定在20°C振荡培养箱中粘性垫上，以200rpm的速度振荡。通过添加额外的湿纸巾来确保板在盒子中稳定，以确保板的移动最小。 4. 数据收集和分析 在第5天在解剖显微镜下观察板。计算DMSO溶剂对照和药物处理孔中的移动数和 D. dipsaci 的总数。 如果蠕虫相对不动，则向孔中加入2μL的1M NaOH至40mM的最终浓度以刺激运动19，20。注意：添加NaOH后，蠕虫会立即移动，需要在5分钟内查看。移动蠕虫的数量和蠕虫的总数将用于计算移动蠕虫的比例。测定的长度可能会根据筛选的目的而变化。 计算移动蠕虫的比例。在 D. dipsaci 筛选中，可重复产生0%移动蠕虫的孔被归类为强命中。注意：避免在解剖显微镜的载物台上长时间暴露板，因为光源可以加热板并诱导对生物测定的可变影响。