زراعة وفحص الديدان الخيطية الطفيلية النباتية Ditylenchus dipsaci
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة موثوقة ومباشرة لزراعة وجمع وفحص Ditylenchus dipsaci.
Abstract
تدمر الديدان الخيطية الطفيلية النباتية (PPNs) أكثر من 12٪ من المحاصيل الغذائية العالمية كل عام ، وهو ما يعادل ما يقرب من 157 مليار دولار أمريكي تضيع سنويا. مع تزايد عدد سكان العالم ومحدودية الأراضي الصالحة للزراعة ، فإن السيطرة على الإصابة ب PPN أمر بالغ الأهمية لإنتاج الغذاء. ومما يضاعف من التحدي المتمثل في زيادة غلة المحاصيل إلى أقصى حد القيود المتزايدة المفروضة على مبيدات الآفات الفعالة بسبب الافتقار إلى انتقائية الديدان الخيطية. وبالتالي، فإن تطوير مبيدات نيماتسيد كيميائية جديدة وآمنة أمر حيوي للأمن الغذائي. في هذا البروتوكول ، يتم عرض استزراع وجمع أنواع PPN Ditylenchus dipsaci . D. dipsaci ضار اقتصاديا ومقاوم نسبيا لمعظم النيماتيدات الحديثة. يشرح العمل الحالي أيضا كيفية استخدام هذه الديدان الخيطية في الشاشات لمبيدات النيماتيدات الصغيرة الجديدة والتقارير حول منهجيات جمع البيانات وتحليلها. يوفر خط الأنابيب المثبتة إنتاجية من آلاف المركبات أسبوعيا ويمكن تكييفها بسهولة للاستخدام مع أنواع PPN الأخرى مثل Pratylenchus Penetrans. يمكن استخدام التقنيات الموصوفة هنا لاكتشاف مبيدات نيماتيسيد جديدة ، والتي بدورها يمكن تطويرها إلى منتجات تجارية انتقائية للغاية تكافح بأمان PPNs للمساعدة في إطعام عالم يزداد جوعا.
Introduction
تشير التقديرات إلى أن الديدان الخيطية الطفيلية النباتية (PPNs) مسؤولة عن فقدان 12.3٪ من الإنتاج الغذائي العالمي وتسبب أضرارا تقدر بنحو 157 مليار دولار سنويا 1,2,3. لسوء الحظ ، فإن القدرة على التحكم في PPNs تتضاءل بسبب حظر مبيدات النيماتسيد الكيميائية الفعالة أو تواجه قيودا متصاعدة بسبب سلامة الإنسان والمخاوف البيئية. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى ضعف انتقائية الديدان الخيطية للأجيال السابقة من المبيدات الحشرية4. على مدى السنوات ال 25 الماضية ، تم تجريب ستة مبيدات نيماتسيد كيميائية جديدة أو إدخالها في السوق5. وقد تم بالفعل حظر واحد من هذه في أوروبا ، وآخر تم وقفه أثناء التحقيق في تأثيره على heatlhالإنسان 6,7. وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لمبيدات نيماتيسيد جديدة انتقائية للغاية ل PPNs.
الديدان الخيطية الجذعية واللمبة ، Ditylenchus dipsaci (D. dipsaci) هي PPN4. D. dipsaci المؤثرة اقتصاديا تصيب ما يقرب من 500 نوع نباتي عبر 30 سباقا بيولوجيا وتستهدف بعض المحاصيل الأكثر أهمية من الناحية الزراعية مثل الجاودار والشوفان والثوم والبصل والكراث 8,9. على سبيل المثال ، قام D. dipsaci مؤخرا بضرب حقول الثوم في أونتاريو وكيبيك ، مما أدى إلى خسائر تصل إلى 90٪ 10,11. توزيعها الجغرافي في كل مكان تقريبا ويشمل الأمريكتين (بما في ذلك كاليفورنيا وفلوريدا) وأوروبا والكثير من آسيا (بما في ذلك الصين) وأوقيانوسيا9. D. dipsaci هو طفيلي داخلي مهاجر يدخل الثغور على الأوراق أو الجروح والعدس حيث يطلق الإنزيمات لتحطيم جدار الخلية12. مما يضاعف من تأثير D. dipsaci على المحاصيل ، فإن الضرر الناجم عن PPN يجعل النبات عرضة للعدوى الثانوية11. لسوء الحظ ، يظهر D. dipsaci مستويات عالية من التسامح مع مبيدات الديدان الخيطية الحالية مقارنة بسلالات الديدان الخيطية الأخرى13,14.
يصف هذا البروتوكول زراعة D. dipsaci ، واستخدامه في شاشات واسعة النطاق لمبيدات النيماتيسيد المرشحة للجزيئات الصغيرة. باختصار ، يتم الحفاظ على مجموعات D. dipsaci وتوسيعها على نباتات البازلاء المستزرعة في وسائط Gamborg B-5 (GA) المعقمة15. قبل زراعة براعم البذور على وسط GA ، يجب تعقيم البذور من خلال سلسلة من الغسلات وطلائها على أجار المغذيات (NA) للتحقق من التلوث. تعقيم البذور ضروري للكشف عن الملوثات البكتيرية والفطرية التي قد تكون موجودة. ثم يتم نقل البذور غير الملوثة إلى ألواح GA ، حيث تنمو براعم البذور استعدادا للعدوى. تصاب ألواح GA التي تحتوي على براعم البذور بالديدان الخيطية من صفيحة استزراع سابقة عن طريق نقل قطعة من الأجار تحتوي على أنسجة الجذر إلى الألواح الطازجة. بعد 6-8 أسابيع ، يتم استخراج الديدان الخيطية من وسائط GA ويتم تصفيتها من خلال قمع مبطن بمرشح القهوة في كوب مجموعة. يمكن استخدام الديدان الخيطية في العديد من المقايسات الحيوية بمجرد جمع عدد مناسب. تولد التقنية الموصوفة في هذا البروتوكول ما يقرب من 15000 D. dipsaci لكل لوحة استزراع. تم نشر بروتوكولات بديلة لزراعة D. dipsaci 16,17.
كما يتم وصف فحص جزيء صغير في المختبر استنادا إلى العمل السابق18 هنا. كوكيل لصحة الدودة ، يتم فحص حركة 20 ديدان خيطية لكل بئر بعد 5 أيام من التعرض للجزيئات الصغيرة. لتصور حركة الديدان بشكل أفضل ، يضاف NaOH لزيادة حركة الديدان الحية19,20. يسمح هذا البروتوكول بالفحص متوسط الإنتاجية ويوفر بيانات قيمة لتقييم إمكانات النيماتيزم للجزيئات الصغيرة. إذا تم استخدام تقنية مختلفة لجمع الديدان الخيطية16,17 ، يمكن مع ذلك تنفيذ منهجية فحص الجزيئات الصغيرة الموضحة هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة
على الرغم من بساطة البروتوكول ، هناك خطوات حاسمة في البروتوكول تستحق اهتماما إضافيا لزيادة احتمال نجاحه. أولا ، يمكن أن يؤدي الإفراط في تبييض البذور إلى تعطيل نموها. لذلك ، فإن الحد من وقت البذور في محلول التبييض إلى 20 دقيقة أو أقل أمر ضروري. ثانيا ، كما لاحظ سابقا Storelli et al. ، فإن الصحة الظاهرة للديدان الخيطية تنخفض بمرور الوقت عند تخزينها عند 4 درجات مئوية16. يوفر استخدام الديدان الخيطية بعد وقت قصير من جمعها ثقة إضافية بأنه يمكن تحقيق ظروف الفحص المثلى. إذا كان التخزين على المدى الطويل ضروريا ، فتأكد من أن غطاء الأنبوب ليس ضيقا للسماح بتبادل الأكسجين. ثالثا ، إن ضمان نمو البازلاء على ألواح NA للوقت المقترح يمكن المجرب من الحكم على البذور الملوثة. رابعا ، إن الإفراط في نمو البازلاء على ألواح GA قبل إضافة الديدان الخيطية سيضعف العدوى ويقلل من غلة الديدان الخيطية. وأخيرا، يمكن للعديد من العوامل التي يصعب السيطرة عليها أن تؤثر على نتائج الفحص. لذلك ، من الضروري إجراء العديد من شاشات النسخ المتماثل المستقلة في أيام مختلفة ومن الناحية المثالية مع PPNs التي تم جمعها من لوحات ثقافة مختلفة لضمان تكرار النتائج.
قيود الطريقة
أحد القيود المفروضة على البروتوكول هو أنه يفشل في مزامنة المرحلة التنموية للديدان التي تم جمعها ، والتي تتراوح من الأحداث إلى البالغين. وبالتالي ، من المحتمل أن تكون النتائج القوية التي تكشفها أي شاشة فعالة على مراحل متعددة. ومع ذلك ، فإن البروتوكول يزيد من خطر تجاهل الضربات الفعالة الخاصة بالمرحلة. والاعتبار الثاني هو أنه ينبغي اعتبار الفحص في المختبر الخطوة الأولى في خط أنابيب اكتشاف مبيدات الديدان الخيطية؛ تعد الفحوصات القائمة على التربة إضافة ممتازة إلى خط أنابيب لاختبار قابلية ترجمة الزيارات.
أهمية البروتوكول وتطبيقه
البروتوكولات الموضحة هنا بسيطة ويمكن تكرارها بسهولة. علاوة على ذلك ، تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على PPNs الأخرى في المختبر ، بما في ذلك Pratylenchus penetrans ، من خلال إجراء تعديلات طفيفة فقط. يعد وضع تدابير جديدة وآمنة لمكافحة PPN أمرا ضروريا لضمان الأمن الغذائي العالمي. هذا ينطبق بشكل خاص على أنواع مثل D. dipsaci التي تتحمل عموما مجموعة واسعة من مبيدات النيماتسيد الكيميائية المقبولة حاليا13,14. وبالتالي، فإن البروتوكولات المبينة هنا لديها القدرة على تقديم مساهمة هامة في صحة الإنسان على نطاق عالمي.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويقر المؤلفان الدكتور تشينغ يو (الزراعة والأغذية الزراعية في كندا) بتوفيره ثقافة ديتيلنشوس ديبساتشي والمشورة بشأن أساليب الثقافة؛ الدكتور بنجامين ميمي (الزراعة والأغذية الزراعية الكندية) وناتالي دوفينايس (الزراعة والأغذية الزراعية الكندية) للحصول على المشورة بشأن الاستزراع المختبري للديدان الخيطية الطفيلية النباتية؛ الدكتور أندرو بيرنز وشون هارينغتون للحصول على اقتراحات مفيدة حول المشروع والمخطوطة. JK هو باحث دراسات عليا في NSERC ألكسندر غراهام بيل كندا. يتم دعم PJR من خلال منحة مشروع CIHR (313296). PJR هو كرسي أبحاث كندي (المستوى 1) في علم الوراثة الكيميائية.
Materials
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.205 | |
| 2 forceps | Almedic | 7747-A10-108 | |
| 2L beaker | Pyrex | CLS10002L | |
| 50mL beaker | Pyrex | CLS100050 | |
| 96 well plate | Sarstedt | 83.3924 | |
| aluminium foil | Alcan Plus | ||
| bacteriological agar | BioShop | AGR001.5 | |
| coffee filter | No name brand | 716 | |
| commercial bleach 6% | Lavo Pro 6 | DIN102358107 | |
| disposable petri dishes (10cm x 1.5cm) | Fisherbrand | FB0875712 | |
| disposable petri dishes (10cm x 2.5cm) | Sigma-Aldrich | Z358762 | |
| dissecting scope | Leica | Leica MZ75 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-500ML | |
| Funnel | VWR | 414004-270 | |
| Gamborg B5 | Sigma-Aldrich | G5893-10L | |
| glass petri dish | VWR | 75845-546 | |
| glass slide | MAGNA | 60-1200 | |
| Lint-Free Blotting Paper | V&P Scientific | VP 522-100 | |
| mutlichannel pipette | Eppendorf research plus | 3125000036 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| nutrient agar | Sigma-Aldrich | 70148-100G | |
| parafilm | Bemis | PM-996 | |
| pea seeds | Ontario Seed Company | D-1995-250G | |
| pin cleaning solutions | V&P Scientific | VP110A | |
| pinner | V&P Scientific | VP381N | |
| pinner rinse trays | V&P Scientific | VP 421 | |
| pipette tips- low retention ? Reg. 200uL | LABFORCE | 1159M44 | |
| reagent reservoir with lid for multichannel pipettes | Sigma-Aldrich | BR703459 | |
| shaking incubator | New Brunswick Scientific | I26 | |
| sterile surgical blade | MAGNA | sb21-100-a | |
| stir bar | Fisherbrand | 2109 – 1451359 | |
| sucrose | BioShop | SUC507.1 |
Riferimenti
- Sasser, J. N., Freckman, D. W. A. world perspective on nematology: the role of the society. Vistas on nematology. , 7-14 (1987).
- Abad, P., et al. Genome sequence of the metazoan plant parasitic nematode Meloidogyne incognita. Nature Biotechnology. 26 (8), 909-915 (2008).
- Auwal, M., Hassan, T. H. P., Hongli, S., Jingwu, Z. Nematodes threats to global food security. Acta Agriculturae Scandinavica, Section B – Soil & Plant Science. 63 (5), 420-425 (2013).
- Chen, Z. X., Chen, S. Y., Dickson, D. W. Nematicides: Past and present uses. Nematology Vol 2, Nematode Management and Utilization. , 1179-1200 (2004).
- Desaeger, J., Wram, C., Zasada, I. New reduced-risk agricultural nematicides – and review. Journal of nematology. 52, (2020).
- Donely, N. The USA lags behind other agricultural nations in banning harmful pesticides. Environmental Health. 18 (1), 44 (2019).
- Polansek, T. Monsanto halts launch of chemical after users complain of rashes. Reuters. , (2017).
- Sturhan, D., Brzeski, M. W. Stem and bulb nematodes, Ditylenchus spp. Manual of agricultural nematology. , 423-464 (1991).
- The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). Data Sheets on Quarantine Pests; Ditylenchus dipsaci. Prepared by CABI and EPPO for the EU under Contract 90/399003. The European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO). , (2021).
- Quebec (Canada), Agriculture, Pêcherie et Alimentation Quebec. Réseau d’avertissements phytosanitaires (RAP). Avertissement Carotte, Céleri, Laitue, Oignon, Poireau [Warning carrot celery, lettuce, onion, leek]. Quebec (Canada), Agriculture, Pêcherie et Alimentation Quebec. , (2011).
- Abawi, G. S., Moktan, K. Bloat nematode problem on garlic: symptoms, distribution, and management guidelines. Department of Plant Pathology and Plant-microbe Biology, Geneva. , (2010).
- Taylor, R. Chapter 7. Nematodes and other worms. , 143-234 (2019).
- Storelli, A., Keiser, A., Eder, R., Jenni, S., Kiewnick, S. Evaluation of fluopyram for the control of Ditylenchus dipsaci in sugar beet. Journal of nematology. 52, 1-10 (2020).
- Oka, Y. Nematicidal activity of fluensulfone against some migratory nematodes under laboratory conditions. Pest Management Science. 70, 1850 (2014).
- Poirier, S., Dauphinais, N., Van Der Heyden, H., Véronneau, P. Y., Bélair, G., Gravel, V., Mimee, B. Host Range and Genetic Characterization of Ditylenchus dipsaci Populations from Eastern Canada. Plant disease. 103, 456-460 (2019).
- Storelli, A., Kiewnick, S., Daub, M., et al. Virulence and pathogenicity of four Ditylenchus dipsaci populations on sugar beet. Eur J Plant Pathol. 161, 63-71 (2021).
- Kühnhold, V., Kiewnick, S., Sikora, R. A. Development of an in vivo bioassay to identify sugar beet resistance to the stem nematode Ditylenchus dipsaci. Nematology. 8 (5), 641-645 (2006).
- Burns, A., Luciani, G., Musso, G. Caenorhabditis elegans is a useful model for anthelmintic discovery. Nat Communications. 6, (2015).
- Chen, S. Y., Dickson, D. W. A Technique for Determining Live Second-stage Juveniles of Heterodera glycines. Journal of nematology. 32, 117-121 (2000).
- Xiang, N., Lawrence, K. S. Optimization of In Vitro Techniques for Distinguishing between Live and Dead Second Stage Juveniles of Heterodera glycinesand Meloidogyne incognita. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
- US EPA. Fluopyram. US EPA. , (2016).
- US EPA. Fluopyram. US EPA. , (2020).
- US EPA. Oxamyl Facts. Prevention, Pesticides and Toxic Substances. US EPA. , (2000).
