蚊やショウジョウバエに対する殺虫剤毒性を定量するための局所適用バイオアッセイ

注:殺虫剤は、人間、動物、および環境上の危険を引き起こす可能性があります25。注意、トレーニング、および個人用保護具を強くお勧めします。使用するすべての殺虫剤および溶媒の物質安全データシートに必ず従ってください。 1. 後部標本 後部3〜5日齢の成虫の蚊。注:以下の議定書は、国連食糧農業機関のガイドライン26に厳密に従って、ヒトスジシマカの飼育条件を反映しています。 27 ± 1 °Cおよび75 ± 5%の相対湿度で12:12時間の明暗サイクルですべてのライフステージの後部蚊。 蚊の卵を脱イオン水に浸して酵母26を加えて孵化させるか、水没した卵を真空チャンバー内に30分間置きます。注:どちらの方法も、水中の酸素含有量を減少させ、ハッチング27を増加させる。 新しく孵化した幼虫の魚の餌(または挽いた猫のキブルなどの同等の食事)をトレイ内で給餌し、幼虫密度が発達12 に影響を与えるので、トレイ間で幼虫密度をできるだけ類似に保つ(例えば、合計1.5Lの水を含むトレイあたり200〜250匹の幼虫)。 幼虫が蛹期に達するまで1日おきに餌を与え(約7〜10日)、必要に応じて食物の量を増やします。注:給餌が少なすぎると、幼虫の成長が妨げられ、幼虫は互いに食べることがあります。あまりにも多く給餌すると、幼虫が死に、水が汚れることがあります。 蛹が発達したら、成虫の蚊かごのウォーターボウルに毎日移し、10%のスクロース溶液を 自由摂取させます。 大人の出現の初日を記録します。出現開始後2日目にケージから残りの蛹を取り除く。注:男性の蚊はより速く出現します。男性と女性の出現に注意し、各テストに十分な男性と女性が利用可能であることを確認してください。 テストのために3〜5日齢の蚊を達成するために蛹を除去した後3日間待つ。 後部のフルーツハエ(チューリッヒ大学28のプロトコルに大まかに従っています)。 後部 ショウジョウバエ 株は、23 ± 1 °C、60 ± 5% の相対湿度でストックボトルに入れ、12:12 hの明暗サイクルで飼育しています。注: ショウジョウバ エストックボトルには、最初に液体としてボトルの底に注がれ、その後一晩固化させる標準的なハエ培地75mLを含める必要があります。 2週間ごとに生鮮食品を入れた新しいストックボトルにコロニーを移し、人口過剰とカビの成長を防ぎます。これを行うには、ハンドヘルド二酸化炭素(CO2)ディスペンサーを使用してハエをノックダウンし、麻酔をかけたハエをアイスパックまたはチルテーブルの計量紙に移し、細かい先端のペイントブラシを使用してハエを新鮮なストックボトルにブラシをかけます。このプロセス中は、ハエが食べ物に落ちて溺れるのを防ぐために、ボトルを横に置いてください。 2. 重量測定法を用いた殺虫剤製剤の調製 ヒュームフード内で0.1mgの精度の分析スケールを使用して、重量測定アプローチに従って最初のストックソリューションを作成します。注:重量測定アプローチは、添加された殺虫剤および溶媒の量を測定するために質量を使用する。標準的な慣行(容積測定アプローチ)では、最初の原液が調製されるときに添加される(固体)殺虫剤の量を測定するための分析スケールが必要となる。ただし、添加する溶媒の量およびそれに続くすべての希釈液は、体積によってのみ測定される。重量測定アプローチは、より高いレベルの精度を有するため、好ましい。 最初の原液の目標殺虫剤濃度と目標体積(冷凍庫に保管するときにこぼれを防ぐために15mLの円錐管を使用する場合は最大10mLを推奨)を決定し、式(1)を使用して殺虫剤有効成分(AI)の量を計算します。   (1) 保存チューブ(大容量の場合は15 mL円錐管、1 mL以下の容量には1.5 mLマイクロ遠心分離スクリューキャップチューブを推奨)を準備し、殺虫剤と溶媒名、目標濃度、および調製日でラベルを付けます。ラックまたはホルダー内のスケールにチューブと蓋を置き、スケールを風袋に入れます。 ステップ2.1.1から決定した固体または液体殺虫剤AIの所望の量を秤量する。(例えば、代表的なデータに用いたデルタメトリンを)チューブに入れ、その質量を記録する。 目盛りを風袋に入れ、所望の体積の溶媒(目標体積に相当)をチューブに加え、すぐに蓋を閉め、質量を記録する。溶媒(ここではアセトンを使用)を加えた直後にチューブの蓋を閉め、蒸発を避け、溶液を混合してください。 室温を記録します。アセトンなどの一部の溶媒は、温度に応じて体積(および結果として密度)が大きく変化することがあります。 すぐに保管する場合は、チューブの蓋をパラフィルムで包み(蒸発を減らすため)、チューブラック/ホルダーに入れ(直立して漏れを防ぐため)、ホイルで覆い(紫外線暴露を防ぐため)、再密封可能なビニール袋に入れ(蒸発を減らすため)、-20°Cの冷凍庫に入れてください。すぐに保管しない場合は、蓋が固定され、ホイルまたは軽く保護された容器で覆われていることを確認してください。 添加した殺虫剤AIの質量を溶媒添加量(液体の場合は殺虫剤添加量)で割って、原液の実際の濃度(mg/mL)を計算します。添加された溶媒(または液体殺虫剤)の体積を計算するには、添加された質量を、記録された温度に適した既知の密度で除算する。 添加した総質量(殺虫剤および溶媒)を添加された総体積(溶媒および殺虫剤、液体形態の場合)で割ることによって、原液の密度(g / mL)を計算する。液体の質量を体積に変換する手順 2.1.7 を参照してください。 初期原液を10%希釈を介して連続希釈する。必要に応じて、これらの段階希釈を使用して初期用量反応曲線を作成し、バイオアッセイの殺虫剤濃度の標的範囲を特定します。 殺虫剤原液および溶媒の体積を計算し、各チューブに加える(例えば、以前の濃度の10%の10mL希釈のために9mLの溶媒で希釈した1mLの殺虫剤原液)。 原液を10秒間渦巻きます。スケール上に予めラベル付けされた第1希釈チューブを風袋にする。ピペットを用いて必要量の原液を第1希釈チューブに加える。直ちに両方のチューブの蓋を閉め、第1希釈チューブの質量を記録する。 最初の希釈チューブを再び風袋に入れ、必要な量の溶媒を加える。すぐに蓋を閉め、添加した溶媒の質量を記録し、最初の希釈液を10秒間渦巻きます。 残りの希釈液について、手順 2.2.2 と 2.2.3 を繰り返します。 ステップ2.1.6で説明したように、すべての希釈液を保存します。 希釈液の実際の濃度は、ステップ2.1.7に従って計算します。 添加した全質量(殺虫剤溶液及び溶媒)を添加した全量(殺虫剤溶液及び溶媒)で除することにより、各殺虫剤希釈液の密度を算出する。各連続希釈について、以前の殺虫剤ストック希釈の密度を使用して、Eq(2)に従って新しい希釈液の密度を計算します。 (2) オプション: 殺虫剤希釈は、段階希釈によってより小さな増分で作成します。 最初の段階希釈、以前の試験、または出版された文献の用量反応曲線の助けを借りて作成する各新しい溶液の濃度および体積を選択する。注:選択された濃度は、プロビット分析を可能にするために、この範囲から最低3つの濃度で0〜100%の死亡率範囲をもたらすべきである。 段階希釈液をストック溶液として使用して、新しい希釈液を作成し、ステップ2.2に従って10倍希釈液の間に新しい希釈液を作成します。 オプション:殺虫剤溶液をアリコートする。大量の殺虫剤溶液が作られた場合は、頻繁な取り扱いや光への暴露によるストック溶液の汚染、蒸発、劣化を避けるために、溶液を1.5mLスクリューキャップチューブにアリコートしてください。 溶液をアリコートし、最低濃度から始めて、潜在的な汚染を減らすために最高濃度に向かって作業します。開封前に10秒間ボルテックス処理して各原液を混合し、所望の容量(例えば、0.5mL)を予めラベル付けされたスクリューキャップチューブにピペッティングする。 アリコートを耐光性容器に入れ、-20°Cの冷凍庫に保管してください。注:アリコートをストック農薬希釈液から直接採取した小さな新しいアリコートと定期的に(毎月)交換することをお勧めします。これにより、サンプルがベンチで使用されている間、蒸発またはUV劣化による汚染が他の実験または変化に持ち越される可能性が制限されます。このプロトコルは、殺虫剤溶液が適切に保存され(ステップ2.1.6を参照)、-20°Cの冷凍庫に保管されている限り、ここで一時停止し、数年後にも再起動することができます。 永久マーカーペンを使用して、保存する前にメニスカスにマークを付け、溶媒蒸発を監視します。殺虫剤溶液を除去してアリコートを作るときは、溶液が除去されるたびにメニスカスにマークを付けます。 3. 局所適用バイオアッセイワークスペースの準備 注:逃げる蚊やハエを簡単に捕獲するために、ベンチトップの昆虫処理テントで働くことをお勧めします。昆虫処理テントの画像については、 補足図S1 を参照してください。 必要な殺虫剤溶液を冷凍庫から取り出し、すぐに渦巻き、室温の耐光性容器に入れて殺虫剤を室温まで温めてから使用してください。注:殺虫剤AIは、より涼しい温度で溶媒から分離することができます。さらに、アセトンは温度とともに変化し、適用される殺虫剤の用量を変化させる可能性がある。溶液を混合し、それらを室温に温めることは、殺虫剤溶液を使用する際の一貫性を確保するのに役立つ。 材料表で参照されているように、昆虫取り扱いテントでの局所適用アッセイに必要なすべてのツールと 材料を設定します。 シリンジバレルと針を分析グレードのアセトンで洗浄し、アセトンアリコートあたり5回の洗浄を完了します。これを5つの別々のアリコートで完了し、合計25回の洗浄を行います。シリンジおよびリピータピペッタ部品については、 補足図S2 を参照してください。 5本の微量遠心チューブにそれぞれ0.5mLのアセトンを入れます。 シリンジバレルに最初のチューブから0.025mLのアセトンを充填し、プランジャーを素早く押し下げてアセトンを廃容器に排出します。さらに4回繰り返して、同じアセトンアリコートから合計5回のアセトン洗浄を完了します。次に、シリンジバレルを空気で完全に満たし、空気と潜在的なアセトン残党を廃棄物容器に排出します。さらに2回繰り返して、空気で3回の「洗浄」を完了します。 残りの4本のアセトンチューブについて、手順3.3.2を繰り返します。 シリンジプランジャーと針の上部の間にバレル内にエアポケットを作り、プランジャーをバレル内にわずかに引き上げます(〜5 mm)。注:このエアポケットは、プランジャーが殺虫剤溶液に接触するのを防ぎ、殺虫剤の持ち越しを減らします。 局所適用に使用する準備ができるまで、シリンジを脇に置いておきます。 適用する線量を含むキーを作成し、乱数または文字ジェネレーターの後にランダム ID を割り当てます ( 補足ファイル 1 を参照)。 プラスチック製の保持カップに、盲目的死亡率評価のためのランダムなIDのラベルを付けます。メモ: 必要に応じて、プロトコルをここで一時停止し、後で再起動することができます。一時停止中に数時間以上経過した場合は、ステップ3.3を繰り返してシリンジが清潔であることを確認し、昆虫を投与する約1時間前まで殺虫剤溶液を冷凍庫に戻してから、ステップ3.1を繰り返すことをお勧めします。 4. 局所バイオアッセイ用の検体を調製する。手順の概要については、 図 1 を参照してください。 蚊を分類して計量する 吸入からの吸引によって駆動されるアスピレーターを使用して、損傷した個体を説明するための過剰を含む、アッセイに必要な3〜5日齢の成虫の蚊の所望の数を吸引する。蚊を円錐形のチューブ(チューブあたり最大100匹の蚊)に移すには、アスピレーターの先端を先端に巻き付けた綿でチューブに入れ、静かに息を吐き出してアスピレーターを叩く。アスピレーターの先端を取り外したら、綿を使用してチューブを差し込み、蓋でキャップします。一度にあまりにも多くの蚊でアスピレーターとチューブを満たすことは避けてください、これは蚊に追加のストレスを加えて死を引き起こす可能性があるからです。 チューブ内の蚊を4°Cで最低10分間置くか、アイストレイの氷の下に埋めて、簡単にノックダウンします。注:蚊は2°Cで数時間保持することができ、死亡率は最小限に抑えられます29。しかし、潜在的な悪影響を減らすために、蚊が氷の上にいる期間を最小限に抑えることが最善です。 ノックダウンした蚊を昆虫処理テントに移し、氷の上に置かれたプラスチック製のトレイ(例えば、ペトリ皿)に慎重に蚊を傾ける。一度に約50匹の蚊だけを注いで、それぞれがその下の冷たいトレイに触れ、ノックダウンされたままであることを確認します。 蚊を鉗子で脚(または翼)で優しく拾い上げて性別で分類し、各性別を別々の保持カップに入れます。ソート中に各性別の蚊の数を数え、所望の数に達したら停止する。選別中に、怪我をしている(例えば、足が欠けている)か、特大(例えば、腹部が異常に拡大している)または小さい(肉眼で容易に区別できる)蚊は、その集団の平均蚊サイズよりも小さい)除去する。注:付属器によって蚊を扱うことは、彼らの柔らかい一次体(例えば、腹部)への構造的損傷を減少させる。 0.1mgの精度で分析スケールを使用して、蚊の各カップの重量を記録します。 ペトリ皿を蓋にした空のカップをスケールの上に置き、スケールを風袋に入れます。蚊を容器に注ぎ、蓋を上に置き、容器を体重計の上に置きます。 検体の重量と個数の合計をスコアシートに記録します( 補足ファイル2を参照)。すぐに標本のカップを氷の上に戻し、固定状態に保ちます。 試料のすべてのカップが計量されるまで、手順4.1.5.1-4.1.5.2を繰り返します。 準備した蚊を20〜25人のグループに分けて、ランダムなIDでラベル付けされた氷の上に置いた別々のカップに入れます。蚊を移すときは、鉗子によるストレスや物理的な損傷を軽減することを目指しています。理想的には、鉗子を使用して蚊を1〜2回だけ拾います:選別/計量に1回、実験カップに移すための潜在的な2回目。注:カップあたりの理想的な蚊の数は20〜25であり、これは複製に十分であり、死亡率を評価するのに合理的であり、カップ内の密度誘発ストレス/死をもたらすべきではない。 フルーツハエを分類して計量する CO2を使用してハエを7秒間麻酔する。注:ハエがCO2 に7秒以上さらされている場合、30日目に目を覚ますと、クロールや飛行に問題が生じる可能性があります。 ベンチペーパーで包まれたアイスパックにハエを注ぎ、先端の細かい絵筆を使って男性と女性を分離して数えます。 ペイントブラシを使用して、選択したハエを優しく拾い上げ、清潔で空のストックボトルに入れます。雄と雌のショウジョウバエ(例:雄15匹、雌15匹)を同数選び、株名とショウジョウバエの合計(例:Canton-S、30匹のハエ)でストックボトルにラベルを付けます。注:雄のショウジョウバエは、雌の存在から取り除かれた後、お互いに対する攻撃性が高まる可能性があるため、雌と雄のショウジョウバエを同数持つことが重要です31。したがって、非殺虫剤の死亡または傷害を避けるためには、雄と雌の数を同数にすることが最善である(または雄のショウジョウバエを完全に省略する)。 分析スケールを使用して、フルーツハエの各ボトルの重量を記録します。 空のバイアル(ランダムなIDでラベル付けされ、ステップ3.4を参照)を、ペトリ皿を蓋としてスケールの上に置き、スケールを風袋に入れます。注:ガラスバイアルは、静電気を大幅に低減するため、フルーツハエでの使用をお勧めします。 バイアルのランダムIDに対応するフルーツハエのボトルを、CO2 を使用して7秒間麻酔する。 フルーツハエを計量紙に注ぎ、その紙を漏斗として使用してハエをバイアルに導入する。フルーツハエのバイアルの上にペトリ皿の蓋を置き、それをスケールの上に置きます。 スコアシートに標本の合計重量と数を記録し、すぐにハエのバイアルを氷のトレイに置き、ハエが逃げるのを防ぐために蓋を上につけたままにします。 フルーツハエのボトルごとに手順4.2.4.1-4.2.4.4を繰り返します。 上記の手順が完了したら、すぐに次のセクションに進みます。 5. 線量標本 シリンジに適切な殺虫剤濃度をロードする。最も濃縮されていない用量から始めて、生物の各グループで最も濃縮された用量に向かって作業します。無駄を防ぐために、必要な量の殺虫剤と推奨される余分な2μLをシリンジにロードするだけです。 氷の上のトレイの上に置いた計量紙の上に標本を傾けます。清潔で殺虫剤を含まないペイントブラシまたは綿棒を使用して、互いに近接している標本を分離して、投薬のために各検体に簡単にアクセスできるようにします。蚊の場合は、ペイントブラシを使用して、各標本が背甲に横たわっており、腹面が上を向いていることを確認してください。 シリンジを使用して、殺虫剤溶液(または対照用のアセトン)の1滴を、蚊の場合は腹側胸部および腹部領域に、ショウジョウバエの場合は背部に塗布する。ショウジョウバエなどの小型の昆虫には0.2 μLの液滴(10 μLのシリンジが必要)、蚊には0.5 μLの液滴(25 μLの注射器が必要)を塗布します。注:殺虫剤の感受性は、付属器(翼、脚、または吻部など)と比較して、主要な身体部分(頭部、胸郭、腹部など)間で有意に異ならない32。したがって、適用部位は、用量液滴が一次体に適用される限り、正確である必要はない。腹側胸部と腹部領域は、ノックダウンされたときに背側に横たわっていることが多いため、蚊に選ばれますが、背甲はノックダウンされたときに腹側に横たわっていることが多いため、フルーツハエに選択されます。このアプリケーションサイトの特異性の低下は、この方法のスループットの向上に役立ちます。 直ちに試料をラベルの付いたプラスチックカップに戻し、カップをネットとゴムバンドで覆います。カップを保持トレイに置き、このプロセスで殺された、損傷した、または逃げた標本をカップに書き留めます(そのカップ内の標本の最終的な数でそれらを除外するため)。最初のカップについては、投薬が完了した時刻を記録します。 投与間の殺虫剤汚染を避けるために、検体が置かれている計量紙を交換してください。 すべての検体が適切な殺虫剤濃度で投与されるまで、各カップの投与を繰り返し、すべての検体が投与された終了時間を記録します。 浸した綿球を介して各カップに10%スクロース溶液を提供し、翌日に死亡率が評価されるまでカップを脇に置いておく。蚊を27±1°C、相対湿度 75±5%で保管し、フルーツハエは23±1°C、相対湿度60±5%で保存します。メモ:綿球を絞るときは、過飽和や過飽和にならないように注意してください。綿球は湿っているはずですが、滴り落ちてはいけません。カップ内の砂糖水を滴下すると、検体の死亡率につながり、殺虫剤の死亡率評価に影響を与える可能性があります。 6. 死亡率を評価する 殺虫剤曝露開始後24時間で検体死亡率を記録する。蚊が飛んで直立することができれば、蚊を生きていると分類する。WHO6が記述しているように、彼らが動けない、または運動失調(飛行のために立ったり離陸したりすることができない)であれば、死んでいるように。ショウジョウバエ8,33について同じ死亡率評価に従ってください。注:遅延死亡率を評価するために、死亡率は、毎日の砂糖水の変化で48および72時間後にさらに評価することができる。 死亡率が記録されたら、すべての検体のカップを冷凍庫の入った袋に入れて、廃棄またはその後の使用(分子分析または化学分析など)の前にすべての検体が死んでいることを確認してください。 7. 反復の実行 殺虫剤の感受性が1日34の時間に応じて変化する可能性があるため、毎日同じ時間に複製を実行するように注意しながら、新しい検体セットに対してステップ3〜6を繰り返します。 検体の50%を殺す致死量(LD 50)を正確に推定するために、各濃度に対して最低3回の反復を確保してください。高レベルの変動が観察される場合は、より多くの反復を含めます。 すべてのデータが収集されたら、分析を完了します。 8. 結果を分析する スプレッドシート・プログラムにデータを記録し、ランダム ID キーを使用してデータのマスクを解除します (参照ステップ 3.4)。データをテキストファイル(補足ファイル3のデータ例を参照)として保存し、統計プログラムR35(補足ファイル4のRコード例を参照)または他の任意のソフトウェア36で分析する。 ソフトウェア・プログラム内で、以下の分析を実行します。R コードの例については、 補足ファイル 4 を参照してください。 検体質量(mg)あたりの殺虫剤の投与量(ng)を以下の式(3)で計算する: (3) 死亡率を計算し、アボットの式37 を適用して、各対照37で観察された死亡率を基準に死亡率を補正する。あるいは、Schneider-Orelli (1947) の公式を使用して死亡率を補正する38.いずれの式を用いても、対照データが異常に高い場合を除き、前述の37 および実施39のように、各対照における死亡率に関係なく、すべてのデータに補正を適用する(下記の議論を参照のこと)。注:アボットの公式およびシュナイダー・オレリの公式などの同等の代替案は、対照群で観察されなかった死亡率の程度に比例して死亡率値を調整し、死亡率が100%であったカップの死亡率の低下を引き起こさない。詳細については、これらの数式の引用文献を参照してください。 補正された死亡率データをプロビット(確率単位)値40 に変換し、殺虫剤用量と変換された死亡率データとの間で線形回帰を実行します。カイ二乗検定を使用して、線形モデルの適合度を評価します。注: 0 (0% 死亡率) または 1 (100% 死亡率) の死亡率値は、プロビット変換を完了する前にデータから削除されます。これは、プロビット変換の性質上必要です。そのため、グラフ化されたデータには、陽性対照または陰性対照、または(アボットの補正が適用された後)0%または100%の死亡率をもたらしたその他のデータは含まれません。 以前に発表された方法39、41、42に従って、検体株、集団、および/または性別ごとのLD50および95%信頼区間(CI)を計算する。 注:2つの株の95%CIが重複しない場合、それらの株は有意に異なる用量応答を有する。 該当する場合は、対象のひずみのLD 50を参照/制御ひずみのLD50で割って抵抗比(RR)を計算します。 図1:局所適用アッセイプロトコル図。局所適用アッセイプロトコルは、(A)氷上で検体を選別することから始まり、続いて(B)分析スケールで標本を計量し、(C)殺虫剤溶液で検体を投薬し、(D)殺虫剤曝露後24時間の待機期間を(浸漬した綿球を介して)10%スクロース溶液に自由にアクセスし、続いて死亡率評価を行う。赤い矢印は、蚊(左)とショウジョウバエ(右)の殺虫剤散布目標位置を示す。画像は拡大縮小しないことに注意してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。