JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia dello sviluppo

Протокол для моделирования бластоидов человека Разработка и имплантация бластоцисты

Published: August 10, 2022
doi:
10.3791/63388
, , , , , , ,
1Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA),Vienna Biocenter (VBC), 2Institute of Molecular Pathology (IMP),Vienna Biocenter (VBC), 3Vienna BioCenter PhD Program,Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna

Summary

Протокол, описывающий образование человеческих бластоидов, которые эффективно, своевременно и последовательно генерируют бластоцистоподобные клетки.

Abstract

Модель человеческой бластоцисты, сформированной из стволовых клеток (бластоида), будет поддерживать научные и медицинские достижения. Однако его прогностическая сила будет зависеть от его способности эффективно, своевременно и точно повторять последовательности развития бластоцисты (морфогенез, спецификация, паттернирование) и формировать клетки, отражающие стадию бластоцисты. Здесь мы показываем, что наивные человеческие плюрипотентные стволовые клетки, культивируемые в условиях PXGL, а затем трижды ингибируемые для гиппопотамов, трансформируя фактор роста β, и внеклеточные сигнально-регулируемые киназные пути эффективно подвергаются морфогенезу с образованием бластоидов (>70%). В соответствии со сроками развития (~4 дня) бластоиды разворачивают последовательность бластоцисты спецификации, производя аналоги трофобласта и эпибласта, с последующим образованием аналогов примитивной энтодермы и полярных трофобластов. Это приводит к образованию клеток, транскрипционно похожих на бластоцисту (>96%) и меньшинство постимплантационных аналогов. Бластоиды эффективно моделируются, образуя эмбрионально-абембрионную ось, отмеченную созреванием полярной области (NR2F2+), которая приобретает специфический потенциал для направленного прикрепления к гормонально стимулированным клеткам эндометрия, как в утробе матери. Такой человеческий бластоид является масштабируемой, универсальной и этической моделью для изучения развития человека и имплантации in vitro.

Introduction

Отсутствие экспериментальных моделей ограничило понимание раннего эмбриогенеза человека. Современные знания о специфических для человека аспектах эмбрионального развития получены из избыточных эмбрионов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), пожертвованных для исследований. Однако ограниченная доступность, трудности экспериментальных манипуляций и переменное качество эмбрионов препятствуют научным исследованиям. Напротив, верная модель человеческих эмбрионов in vitro позволила бы проводить сложные экспериментальные манипуляции, обеспечивая тем самым этическую возможность дополнить исследования человеческих эмбрионов 1,2,3,4. Ранее разработанная модель мышиных бластоцист объединила эмбриональные стволовые клетки мыши и стволовые клетки трофобласта5. В этом подробном протоколе описан метод генерации модели бластоцисты человека из наивных плюрипотентных стволовых клеток, которая верна критериям элементальной бластоцисты6.

Четыре критерия для человеческих бластоидов. Здесь, в попытке установить стандартизированное определение человеческих бластоидов, мы предлагаем четыре минимальных критерия. Хотя эти критерии не являются исчерпывающими, они могут служить основой для оценки параметров, позволяющих образовывать бластоиды человека (рисунок 1А). (1) Бластоиды должны эффективно формироваться с точки зрения морфологии и генерации аналогов трех линий, а именно: эпибласта (Epi), трофэктодермы (TE) и примитивной энтодермы (PrE). Неэффективность, вероятно, указывает на неадекватное начальное состояние клетки и/ и состояние культуры (например, бластоидная среда). (2) Бластоиды должны генерировать аналоги трех линий в соответствии с последовательностью развития (Epi/TE first, PrE/polarTE last)7,8 и сроками (индукция ~ 3 дня; эмбриональные дни 5-7)7,9. (3) Бластоиды должны образовывать аналоги стадии бластоцисты, но не стадии после имплантации (например, постимплантационные эпибласты, трофобласты или амнионные клетки). (4) Наконец, бластоиды должны быть способны воспроизводить функциональные особенности имплантации и развития бластоцисты. Используя этот протокол, человеческие бластоиды формируются эффективно с использованием нескольких клеточных линий (>70%), способны генерировать клеточные аналоги бластоцисты последовательно и в течение 4 дней, а аналоги транскрипционно похожи на стадию бластоцисты (>96% на основе нескольких анализов)6,10,11. Наконец, бластоиды надежно генерируют эмбрионально-абембрионную ось, что позволяет им взаимодействовать с гормонально стимулированными клетками эндометрия через полярную область и надежно расширять линии при расширенной культуре (эквивалент времени: эмбриональный день 13).

Важность начального состояния клетки. Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) могут быть стабилизированы в различных состояниях, которые пытаются захватить точные стадии развития. Эти состояния поддерживаются условиями культивирования, которые, хотя все еще неоптимальны, ограничивают клетки в предимплантационном (~ эмбриональные дни 5-7) или постимплантационном (~ эмбриональные дни 8-14) эпибластестадии 12. Транскриптомный анализ показал, что hPSCs, культивируемые в PD0325901, XAV939, Gö6983 и факторе ингибирования лейкемии (LIF; называемые PXGL наивными hPSCs)13,14, более похожи на эпибласт бластоцисты по сравнению с hPSCs, культивируемыми в факторе роста фибробластов (FGF) 2 и активине15 (называемый праймированным hPSCs12) и на расширенные плюрипотентные стволовые клетки человека (hEPSCs)16 (см. анализ в ссылках 17, пункты 18,19). Соответственно, транскриптом праймированных hPSCs лучше всего соответствует постимплантационному/предгаструляционному cynomolgus monkey epiblast20. Дополнительные молекулярные критерии, такие как транспозонная экспрессия, метилирование ДНК и состояние Х-хромосомы, подтвердили, что вариации наивного состояния более похожи на эпибласт бластоцисты по сравнению с праймированным состоянием17,21. Наконец, линии наивных hPSCs были успешно получены непосредственно из бластоцист с использованием условий культуры PXGL22.

Клетки ранней бластоцисты человека еще не зафиксированы. Спецификация линии мышей происходит со стадии морулы, которая предшествует стадии бластоцисты23. Напротив, эксперименты по диссоциации и реагрегации показали, что клетки трофэктодермы человека ранних бластоцист еще не совершены24. Соответственно, анализ клеток бластоцист человека методом секвенирования одноклеточной РНК (scRNAseq) показал, что первая спецификация линии (трофобласт/эпибласт) происходит после образования полости бластоцисты7. Эта отложенная человеческая спецификация коррелирует с наблюдениями, что hPSCs являются мощными для образования трофобластов 25,26,27, когда мышиные PSC в значительной степени привержены линии эпибластов. Эти комбинированные наблюдения привели к возможности того, что наивные гПСК отражают стадию бластоцисты и сохраняют потенциал для формирования трех линий бластоцисты. В последнее время было предложено, чтобы эффективность hPSCs для определения внеэмбрионных аналогов переходила от трофэктодермы к амниону при прогрессировании от наивного к праймированному состоянию27. Таким образом, наивные гПСК более похожи на стадию предимплантации 17,18,21 и обладают повышенной способностью к образованию трофобластов по сравнению с праймированными гПСК27, гЭПСК16 или промежуточными перепрограммированными состояниями28, которые склонны к образованию постимплантационных аналогов10 (рисунок 1B). ). Таким образом, исходное состояние клетки имеет решающее значение для формирования соответствующих внеэмбриональных аналогов. Хотя тщательный параллельный анализ преобразованных аналогов трофэктодермы еще предстоит сделать, наивное состояние PXGL, отражающее раннюю бластоцисту, представляется важным для формирования высокоточных бластоидов.

Подсказка спецификации и морфогенез путем ингибирования сигнальных путей. Ингибирование сигнального пути гиппопотама является сохраненным механизмом, определяющим спецификацию трофобласта у мышей, коров и людей 9,29,30. Также с 2013 года известно, что ингибирование УЗЛОВОЙ (А83-01) и внеклеточной сигнально-регулируемой киназы (ЭРК; PD0325901 или эквивалент) и активация сигнальных путей костного морфогенетического белка (BMP) запускает праймированные hPSCs для активации транскрипционной сети, связанной с линией трофобластов 25,31,32,33,34. Более того, в последнее время несколько сообщений также подтвердили, что ингибирование как пути NODAL, так и ERK и активация BMP способствуют дифференцировке трофобласта от наивных hPSCs 25,31,32,33,34. Наконец, если спецификация трофобласта запускается из наивного состояния, клетки повторяют аспекты прогрессирования развития трофэктодермы26. Однако самообновляющиеся линии, отражающие трофэктодерму бластоцисты, не были стабилизированы in vitro. Следуя спецификации трофобласта, индукция эпидермального фактора роста (EGF) и сигнальных путей Wnt вместе с ингибированием HDAC может способствовать прогрессированию развития трофобласта34,35 и стабилизировать клетки в линиях стволовых клеток трофобласта человека (hTSCs), отражающих постимплантационные цитотрофобласты18,35. Такие линии могут быть получены как из бластоцист, так и из плацентарных тканей35.

Вторая внеэмбриональная линия, называемая PrE, указывается после трофобластов и происходит от эпибласта 7,9. В отличие от мышиного PrE36, человеческий аналог считается независимым от FGF, сигнализирующим 37,38. Линии, отражающие внеэмбриональную энтодерму (называемую nEnd), были установлены из наивных hPSCs путем индукции сигнальных путей с использованием активина A, Wnt и LIF39. Было показано, что в отличие от экспериментов по ингибированию эмбрионов, ингибирование ERK предотвращает образование таких nEND-клеток in vitro39. До сих пор такие линии не были получены непосредственно из бластоцист.

В последнее время модели раннего эмбриона были сформированы путем объединения вариаций среды, ранее разработанных для hTSCs35 и nEND-клеток39, таким образом, с использованием активаторов трансформирующего фактора роста – β (TGF-β), EGF и сигнальных путей Wnt28,40. Эти модели эмбрионов формируются с низкой эффективностью (10%-20%) и образуют клетки, напоминающие стадию после, а не доимплантации10, включая аналоги постимплантационного эпибласта, трофобласта, амниона, гаструлы, мезодермальных тканей (~ эмбриональный день 14) и цитотрофобластов10. Напротив, тройное ингибирование путей Hippo, ERK и TGF-β эффективно направляет образование бластоидов, содержащих бластоцистоподобные клетки41. Наряду с начальным состоянием клетки мы предполагаем, что ингибирование тройных путей (Hippo, ERK, TGF-β) является вторым важным параметром для образования бластоидов высокой точности (рисунок 1B).

Оценка состояния клетки и отраженной стадии с помощью scRNAseq. Состояния клеток, составляющих бластоиды, могут быть оценены с помощью анализа scRNAseq. Их транскрипционное сходство с конкретными эмбриональными стадиями может быть измерено с использованием только бластоидных клеток и путем сравнения с праймированными hPSCs или hTSCs, которые отражают стадии постимплантации20,35. Выполнение кластерного анализа с использованием различных уровней определения показывает, как субпопуляции постепенно сливаются при уменьшении определения, тем самым выявляя сходство кластеров. Хотя оптимальность в количестве кластеров может быть измерена42, кластеризация с высоким разрешением также информирует о возможном наличии небольших аномальных субпопуляций, например, отражающих постимплантационные стадии10. Гены, дифференциально экспрессируемые между кластерами, могут предоставлять информацию о своих аналогах в процессе разработки, оценивая уровни экспрессии эталонных наборов генов, которые определяют специфические для стадии линии. Это позволяет измерять обогащение бластоидных субпопуляций либо с помощью неконтролируемых карт расстояний (например, с использованием верхних обогащенных генов), либо с помощью анализа обогащения набора генов (GSEA)43. Используя этот бластоидный протокол, образуются только три основных кластера, которые транскрипционно отражают три линии бластоцисты. Один кластер включает в себя как начальные наивные гПСК, так и эпибластный аналог бластоидов. Анализ клеток в разные моменты времени показал последовательный характер спецификации линий (трофобласты начинают определяться в течение 24 ч, а примитивные клетки энтодермы в течение 60 ч). Кластеризация с высоким разрешением захватила субпопуляцию клеток (3,2%), экспрессирующих гены, специфичные для эмбрионов стадии гаструляции (возможно, мезодермы или амниона). Следует отметить, что первоначальные наивные hPSCs также составляли 5% постимплантационных клеток, как описано ранее44. Во втором анализе бластоидные клетки могут быть объединены в silico с эталонными клетками, выделенными из concepti на разных стадиях 45,46,47, чтобы вывести эквивалентность стадии. Здесь в качестве ориентиров использовались клетки, выделенные из предимплантационных концепций 45,46, культивируемых бластоцист in vitro 45 и эмбрионов стадии гаструляции47. Используя этот протокол, было количественно определено, что несоответствующие бластоидные клетки, выявленные кластеризацией с высоким разрешением, действительно группируются с постимплантационной мезодермой и амнионом. На будущих этапах бенчмаркинг транскриптома должен быть дополнен анализом экспрессии транспозонов, метилирования ДНК и статуса Х-хромосомы, которые также обеспечивают ориентиры стадии развития21.

Оценка формирования осей и других функциональных возможностей бластоидов человека. Зрелая бластоциста характеризуется образованием эмбрионально-абембрионной оси, узорящей трофобласты для имплантации. Используя этот бластоидный протокол, образуется ось, примером которой является созревание проксимальных трофобластов (например, NR2F2 +/CDX2-), которые приобретают способность присоединяться к органоидным клеткам эндометрия только тогда, когда они гормонально стимулируются48,49. Сравнение с трофосферами, которые не образуют эпибласт, показывает, что эти внутренние клетки индуцируют примыкающие трофобласты к созреванию таким образом, чтобы опосредовать первоначальное прикрепление к эндометрию. При культивировании в расширенной питательной среде, предназначенной для бластоцист обезьян cynomolgus50, все три линии бластоида последовательно расширяются в течение шести дополнительных дней (эквивалент времени 13-го дня), хотя их организация не отражает эту стадию развития.

Подразумевается высокоэффективный и высокоточный человеческий бластоид. Сохранение принципов развития, которые были обнаружены в модельных организмах, по своей сути трудно проверить в человеческой концепции из-за ограниченного доступа и технических трудностей в генетическом и физическом манипулировании ею. Высокоэффективная и высокоточная бластоидная модель позволит проводить высокопроизводительные генетические и лекарственные скрининги, которые лежат в основе научных и биомедицинских открытий. Кроме того, включение сложных генетических модификаций для изменения и регистрации биологических процессов будет дополнять такие исследования. В целом, мы предполагаем, что тройное ингибирование (Hippo, TGF-β, ERK) наивных PXGL hPSCs является проводящим для эффективного формирования высокоточных человеческих бластоидов, соответствующих четырем минимальным критериям. Масштабируемый и универсальный характер этого протокола делает его пригодным для генерации целевых гипотез, которые затем могут быть проверены с использованием бластоцист человека. Таким образом, человеческие бластоиды не заменят использование человеческой концепции для исследований in vitro , но могут действовать как мощный способ направить исследования через ранее недоступные экспериментальные подходы, лежащие в основе процесса научных и биомедицинских открытий. Протокол показывает, как формировать человеческие бластоиды, а также как анализировать клетки, которые содержатся в бластоиде.

Protocol

Руководство по исследованию стволовых клеток и клиническому переводу Международного общества исследований стволовых клеток (ISSCR) рекомендует, чтобы исследования бластоидов человека были допустимы только после рассмотрения и утверждения в рамках специализированного научного и этического процесса обзора 3,4. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами комитета по этике исследований человека Института молекулярной биотехнологии Австрийской академии наук (IMBA) в соответствии с утвержденным Rivron_Stellungnahme_2020-04-22. Соблюдение этих руководящих принципов необходимо для публикации результатов исследований в научных журналах. 1. Культура наивных эмбриональных стволовых клеток человека в состоянии PXGL ПРИМЕЧАНИЕ: Наивные hPSCs могут быть получены в соответствующих лабораториях. Линии, используемые здесь, были получены из лабораторий Ясухиро Такасимы (в настоящее время в CiRA, Киото, Япония) и Остина Смита (в настоящее время в Институте живых систем, Эксетер, Великобритания). В качестве альтернативы, наивные hPSC могут быть сброшены в дом из линий загрунтованных HPSC, как описано ранее13,14. Наивные HPSC кажутся стабильными для нескольких проходов (> 15), но качество культуры может меняться с течением времени. Если качество наивного hPSC снижается, разморозьте новый флакон клеток или сгенерируйте de novo наивные hPSCs из праймированных PSC. Для всех композиций сми см. Дополнительную таблицу 1. Подготовка облученного слоя эмбриональной кормушки мыши (MEF) За день до прохождения наивных гПСК подготовьте 6-луночную пластину для культивирования клеток с облученными слоями MEF, выполнив описанные ниже действия. Покрыть 6-луночную пластину клеточной культуры 1 мл 0,1% желатина в PBS на лунку. Инкубировать пластину при 37 °C в течение 30 мин. Удалите желатиновый раствор. Приготовьте mef среду при 37 °C. Размораживайте MEF на водяной бане при 37 °C до тех пор, пока не останется только небольшой сгусток льда. Растворите объем флакона 1 мл подготовленной среды MEF с помощью пипетки P1000. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл. Открутите суспензию при 200 х г в течение 4 мин. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулу MEF, добавив свежую среду MEF (достаточную для 1,5 мл на лунку). Подсчитайте клетки с помощью слайдов подсчета клеток и добавьте 300 000 клеток на лунку и перенесите пластину в инкубатор нормокси при 37 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Если MEF отсоединяются с течением времени, свежие MEF могут быть добавлены в среду PXGL во время обычной смены носителя. Пассаж человеческих наивных плюрипотентных стволовых клеток Прежде чем пропускать гПСК, проверьте их морфологию под микроскопом. Колонии обычно имеют куполообразную морфологию с яркими, очерченными границами. Если отдельные колонии демонстрируют более плоскую морфологию или если начинают появляться дифференцированные колонии, следуйте инструкциям шага 1.2.8. Аспирируйте среду и промывайте клетки PBS один раз. Добавьте 500 мкл раствора для отсоединения клеток на лунку 6-луночной пластины. Инкубировать клетки в течение 5 мин при 37 °C. Используйте пипетку P1000 и пипетку клеток несколько раз, чтобы диссоциировать колонии на отдельные клетки. Соберите ячейки и перенесите их в трубку объемом 15 мл, содержащую промывочный буфер (1 мл на лунку 6-луночной пластины). Раскрутите ячейки при 200 х г в течение 4 мин. Аспирировать надосадочное вещество и повторно суспендировать гранулы в свежей среде PXGL (достаточно для 1,5 мл на лунку). Рассмотрим коэффициент расщепления 1:3-1:6 для обычного прохождения.ПРИМЕЧАНИЕ: После каждых 3-4 пассажей или если качество клеточной культуры снижается в зависимости от морфологии клеток (например, появление плоских колоний в популяции), добавляйте 10 мкМ Y-27632 и экстракт базальной мембраны фактора роста (5 мкл / хорошо) в среду в течение первых 24 ч после прохождения. Перед повторной обработкой hPSCs подготовьте пластины со свежими MEF, аспирируя среду MEF и промывая ячейки один раз PBS. Затем используйте пипетку P1000 для переноса 1,5 мл суспензии ячейки hPSCs на лунку 6-луночной пластины, содержащей MEF.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что пипетка приводит к однородному посеву клеток по всей площади скважины. Это обеспечит рост колоний с однородными размерами и относительной синхронностью клеток. Культивировать гПСК в гипоксических условиях при 37 °C во увлажненной среде. По истечении 24 ч следует подключить гПСК. Большое количество неадгезивных (или плавающих) клеток отражает проблему жизнеспособности или прикрепления при прохождении. Изменение среды с 1,5 мл среды PXGL на скважину в день. Проходите гПСК каждые 3-4 дня или используйте их для экспериментов по образованию бластоидов.ПРИМЕЧАНИЕ: После оттаивания hPSCs пройдите их в течение как минимум трех проходов, прежде чем начать эксперимент со бластоидом. 2. Образование бластоидов Формирование наивных агрегатов PSC Подготовьте и предварительно нагрейте носитель PXGL, базальную среду N2B27, моющий буфер, PBS и агрегационную среду перед началом эксперимента. Исключите MEF из суспензии hPSCs для образования бластоидов, выполнив описанные ниже шаги. Для исключения MEF приготовьте пластину с желатиновым покрытием, добавив 1 мл 0,1% желатина в лунку 6-луночной пластины и инкубируя при 37 °C в течение 30-90 мин. Чтобы собрать клетки, аспирируйте среду и промывайте клетки 1 мл PBS. Добавляют 500 мкл раствора клеточного отсоединения (на лунку 6-луночной пластины) и инкубируют при 37 °С в течение 5 мин. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы проследить диссоциацию колоний на отдельные клетки (несколько многоклеточных сгустков могут быть диссоциированы позже путем мягкого пипетирования). Раствор для отсоединения клеток разбавить 1 мл промывочного буфера. Соберите клетки с пластины, аккуратно пипетируя от 5 до 10 раз. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл. Раскрутите ячейки при 200 х г в течение 4 мин. Аспирировать супернатант, повторно суспендировать клетки в 1,5 мл среды PXGL (на лунку 6-луночной пластины) и посеять клетки на пластинах с желатиновым покрытием для исключения MEF и инкубировать при 37 °C в течение 60-90 мин. После того, как наивные клетки засеяны для исключения MEF, удалите PBS из микролунок и уравновесьте лунки 200 мкл базальной среды N2B27 (на 1 микролунку чипа) и инкубируйте в течение 60 мин при 37 °C. Соберите супернатант, содержащий неприкрепленные наивные клетки, перенесите его в трубку объемом 15 мл и раскрутите клетки при 200 х г в течение 4 минут. Аспирация среды и повторное суспендирование клеток в 1 мл базальной среды N2B27. Подсчитывайте ячейки с помощью слайдов подсчета ячеек. Раскрутите ячейки при 200 х г в течение 4 мин. Аспирировать среду и добавить соответствующее количество 10 мкМ Y-27632, содержащееся в среде N2B27, для получения плотности клеток 30 000 клеток на 50 мкл.ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное начальное число ячеек посева может варьироваться между различными клеточными линиями. Например, для засева 50-60 клеток / микролунки 30 000 клеток (включая избыток, учитывая, что некоторые клетки выпадают за пределы микровеллы) засевают в 1 лунку из 96 лунок, которая содержит 430 микролунок. Неподходящий начальный номер ячейки может привести к образованию мелкого агрегата без полости или образованию кавитированной структуры, достигающей более 250 мкм. Аспирируйте среду из уравновешенных микролуночных массивов и добавьте 25 мкл среды N2B27 с 10 мкМ Y-27632. Добавьте 50 мкл клеточной суспензии и инкубируйте при 37 °C в течение 15 мин (до тех пор, пока клетки не попадут в нижнюю часть микролунки). Затем добавляют 125 мкл среды N2B27, дополненной 10 мкМ Y-27632. Разработка бластоидов В течение 24 ч на микросхеме можно наблюдать агрегаты наивных GPSC (день 0). Чтобы инициировать образование бластоидов, подготовьте среду PALLY и выполните шаги, описанные ниже. Предварительно нагрейте среду PALLY при 37 °C в течение 30 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: 1-олеоиллизофосфатидная кислота (LPA) и 10 мкМ Y-27632 должны быть добавлены непосредственно перед использованием. Оптимальная концентрация LPA колеблется в пределах 0,5-5 мкМ. Это должно быть титровано для отдельных линий hPSC, используемых для бластоидов. Аспирировать среду агрегации. Добавьте 200 мкл предварительно нагретой среды PALLY к микролункам. Поместите пластину для культивирования клеток обратно в гипоксический инкубатор при 37 °C. Повторите смену носителя на 1-й день. На 2-й день удалите среду PALLY и добавьте 200 мкл среды N2B27, дополненной LPA и 10 мкМ Y-27632.ПРИМЕЧАНИЕ: На 2-й день большинство агрегатов продолжают расти. Однако некоторые агрегаты образуют небольшие полости. Непрерывно культивируйте бластоиды в PALLY до 4-го дня или в культуральной среде in vitro (IVC1) со 2-го дня. Однако после этого изменения среды усиливается образование PrE в зрелых бластоидах. Повторите смену носителя на 3-й день. Полное бластоидное образование происходит к 4-му дню.ПРИМЕЧАНИЕ: Бластоиды считаются полностью развитыми, когда они подверглись полному морфогенезу на основе морфометрии бластоцист человека 7-го дня (например, диапазон диаметра от 150-250 мкм; один внутренний кластер, окруженный эпителием трофэктодермоподобных клеток) и сформировали полярные трофэктодермоподобные клетки (NR2F2+/CDX2-) и PrE-подобные клетки (GATA4+). Это может быть оценено с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания или флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). 3. Образование бластоидов в 96-луночных микропластинках сверхнизкого крепления Приготовьте наивную клеточную суспензию hPSCs для образования бластоидов, выполнив этапы, описанные выше из 2.1.1 – 2.1.11. Аспирировать среду и добавить соответствующее количество среды N2B27, содержащей 10 мкМ Y-27632, чтобы получить плотность клеток 70 клеток на 100 мкл среды.ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное начальное число ячеек посева может варьироваться между различными клеточными линиями. Например, 70 ячеек/лунка могут быть оптимальным числом ячеек для большинства клеточных линий. Центрифугировать пластину при 200 х г в течение 2 мин при комнатной температуре до кластерных ячеек на дне скважин. Инкубируют пластину в инкубаторе при 37 °C в условиях гипоксической культуры. В течение 24 ч на скважинах можно наблюдать агрегаты наивных ГПСК (день 0). Приготовьте 2x PALLY medium. Добавьте в скважины 100 мкл предварительно выровненной 2x среды PALLY. Поместите пластину для культивирования клеток обратно в гипоксический инкубатор при 37 °C. Через 24 ч аспирировать половину среды (100 мкл) и заменить ее 100 мкл предварительно расплавленной среды PALLY. Повторите шаг до 4-го дня. Убедитесь, что агрегаты не аспирируются.ПРИМЕЧАНИЕ: На 2-й день большинство агрегатов продолжают расти. Однако некоторые агрегаты имеют небольшие заполненные жидкостью полости. На 4-й день большинство кавитированных структур подвергаются полному морфогенезу с образованием бластоцистоподобных структур. 4. Образование трофосферов Для формирования трофосферы следуйте протоколу образования бластоидов с этапа 2.1.1 (исключение MEF) до этапа 2.1.12 (последний этап протокола посева). После образования агрегатов наивных гПСК через 24 ч обменивают агрегационную среду на PALY (без LIF), дополненную 3 мкМ SC-144 для образования трофосферов, представляющих раннюю трофэктодерму, и PALLY, дополненную 2 мкМ XMU-MP-1 для образования трофосферов, представляющих зрелую трофэктодерму. Обновляйте среду ежедневно. Полное формирование трофосферы происходит к 4 дню. 5. Анализ состояния бластоидных клеток и его отраженной стадии с помощью scRNAseq Чтобы подобрать бластоиды и выполнить диссоциацию, разогрейте встряхивающийся инкубатор до 37 °C и установите его на 100 оборотов в минуту. Соберите бластоиды из исходной 96-луночной пластины и перенесите их в несколько скважин U-нижней 96-луночной пластины с помощью ротовой пипетки, оснащенной стеклянным капилляром.ПРИМЕЧАНИЕ: Бластоиды (> 70%) должны быть выбраны на основе морфометрических критериев (размер = 150-250 мкм с уникальным внутренним кластером), чтобы избежать загрязнения небластоидными структурами (< 30%). Мойте один раз с 200 мкл PBS с помощью P200, просматривая под стереомикроскопом. Переложить в лунку, содержащую 50 мкл коллагеназы, и инкубировать в течение 30 мин в встряхивающем инкубаторе. Переложите бластоиды в лунку со 100 мкл 10-кратного трипсина-ЭДТА и хорошо перемешайте. Инкубировать в течение 20 мин в встряхивающемся инкубаторе. Диссоциируйте бластоиды на одну ячейку с помощью пипетки P200. Переведите ячейки в трубку объемом 15 мл с буфером FACS (1% FBS в PBS). Чтобы уловить специфические соотношения аналогов трех линий, окрашивают аналоги TE и PrE антителами TROP2 и PDGFRa соответственно.ПРИМЕЧАНИЕ: Количество prE-клеток в бластоцистах человека меньше по сравнению с мышиными бластоцистами, которые могут отражать дефекты развития бластоцист, образующихся в результате экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) или видовое различие. В бластоидах аналоги PrE менее распространены, чем аналоги TE и EPI, и составляют 7,4% клеток при подсчете клеток GATA4+ с помощью иммунофлуоресцентной визуализации. Кроме того, процесс диссоциации может вызывать смещения в пропорциях различных типов клеток в качестве аналогов PrE, чтобы представлять 1%-2% клеток при диссоциации бластоидов, маркировке PDGFRa и анализе FACS. FACS-сортируют ячейки из всех трех аналогов линии в 384 пластины, содержащие буфер лизиса для анализа smart-seq2. Исключить мертвые клетки, отмеченные окрашиванием DAPI (выполняется в соответствии с инструкциями производителя). Чтобы оценить состояния клеток (тип клетки и стадию развития), сравните транскриптомные данные бластоида с соответствующими контрольными элементами. 6. Расширенная культура для оценки прогрессирования развития бластоида Культивируйте бластоиды человека на пластинах с матричным покрытием базальной мембраны (стеклянное дно). Покрытие пластины матрицей базальной мембраны. Визуально осмотрите бластоиды для оценки и записи морфологии.ПРИМЕЧАНИЕ: Только бластоиды, которые отображают классическую морфологию бластоцисты с полым шаром с компактным ICM, имеют потенциал для дальнейшего роста и развития. Добавьте 100 мкл среды CMRL-1 на одну лунку 96-луночной пластины и поместите пластину в инкубатор не менее чем за 2 ч до переноса бластоидов для уравновешивания. С помощью стереомикроскопа визуально идентифицируют бластоиды с хорошей морфологией, переносят выбранные бластоиды в скважину из 96-луночной пластины, содержащей 100 мкл среды CMRL-1 для удаления следов бластоидной среды. Перенесите бластоиды в скважину, содержащую предварительно уравновешенную среду CMRL-1. Поместите пластину в инкубатор и вылечите при температуре 37°C в течение ночи.ПРИМЕЧАНИЕ: До 5 бластоидов могут быть культивированы в одной скважине из 96 плит скважины. Наличие слишком большого количества бластоидов в одной лунке может привести к образованию агрегатов нескольких бластоидов. На следующий день визуально осмотрите бластоиды под микроскопом. Если бластоиды присоединены, добавляют 100 мкл предварительно уравновешенной среды CMRL-1, дополненной 5% базальной мембранной матрицей. Поместите тарелку в инкубатор и вылечите при температуре 37 °C в течение ночи. На следующий день следите за бластоидами под микроскопом. Удалить половину среды (100 мкл) и заменить ее 100 мкл предварительно уравновешенной среды CMRL-2, дополненной 5% базальной мембранной матрицей. В последующие дни замените половину среды (100 мкл) предварительно уравновешенной средой CMRL-3, дополненной 5% базальной мембранной матрицей. Поместите тарелку в инкубатор и вылечите при температуре 37 °C в течение ночи. Повторяйте каждый день в течение 4-6 дней культивирования in vitro .ПРИМЕЧАНИЕ: У нас есть культивируемые бластоиды на срок до 6 дней в условиях расширенной культуры, что соответствует времени, эквивалентному 13-му дню культивируемых in vitro человеческих эмбрионов. 7. Иммуноокрашивающие бластоиды Аспирировать среду. Промывайте образцы 3x с PBS в течение 5 мин. Добавьте 200 мкл холодного 4% параформальдегида (PFA) в PBS и зафиксируйте образцы в течение 30 мин при комнатной температуре. Удалите раствор PFA и промывайте образцы в 3 раза PBS в течение 10 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Если бластоиды культивировались на микролуночных чипах, перенесите бластоиды из чипа в 96-луночные U-образные нижние пластины для следующих шагов. Пермеабилизируют и блокируют бластоиды в 100 мкл блокирующего раствора на лунку (PBS, содержащий 0,3% Triton-X 100 и 10% нормальную ослиную сыворотку) в течение 60 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от вида антител-хозяев, адаптируйте сыворотку соответствующим образом. Удалите блокирующее решение. Добавляют 100 мкл первичных антител, разведенных в свежем блокирующем растворе, и инкубируют образцы в течение ночи при 4°C.ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации первичных антител должны определяться на основании инструкций производителя. Промывайте образцы 3x с 0,1% Triton-X 100 в PBS (моющий раствор) в течение 10 мин. Добавляют 100 мкл вторичных антител в блокирующий раствор вместе с 20 мкг/мл ядерного пятна Хохста и инкубируют образцы в течение 1 ч при комнатной температуре. Защитите образцы от света.ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации вторичных антител должны определяться на основании инструкций производителя. Промыть образцы 3x моющим раствором в течение 10 мин. Для получения изображений перенесите образцы на дно стекла μ слайд в PBS.ПРИМЕЧАНИЕ: Монтажная среда должна быть выбрана на основе объектива, используемого для визуализации. Например, 80% глицерина в PBS можно использовать для монтажа образцов при использовании масляных объективов.

Representative Results

Как правило, наивные гПСК, культивируемые в PXGL (рисунок 2A), представляют собой агрегированные и кавитированные структуры, которые возникают между 48 и 72 ч после индукции PALLY и достигают диаметра 150-250 мкм в течение 96 ч (рисунок 2B). При использовании оптимальных (1) количества посевных клеток, (2) длительности предкультурной агрегации с N2B27 (от 0 до 24 ч), (3) концентрации отдельных химических компонентов (особенно LPA) и (4) продолжительности обработки PALLY эффективность индукции достигает 70%-80%, как определено на основе морфометрических параметров (общий размер 150-250 мкм, одна правильная полость, один внутренний кластер клеток; Рисунок 2C,D) и наличие трех линий. Неоптимальное начальное состояние клетки и/или условия индукции приведут к менее эффективному образованию бластоидов или их отсутствию. Чтобы обеспечить максимальную эффективность и формировать только предимплантационные аналоги, крайне важно использовать высококачественную культуру наивных PXGL hPSCs. Это можно оценить, измерив с помощью FACS процент клеток, положительных для поверхностных маркеров SUSD2 (наивное состояние) и CD24 (праймированное состояние). Дополнительные поверхностные маркеры, специфичные для внецелевых внеэмбриональных линий (например, амнион, внеэмбриональная мезодерма), также были бы полезны, но, насколько нам известно, в настоящее время недоступны. Если полученная эффективность образования ниже, чем представленные результаты, важно тщательно проверить все компоненты бластоидной среды, особенно LPA, которая восстановлена в PBS и которая, как лиганд GPCR, может быть более нестабильной по сравнению с синтетическими молекулами, восстановленными в DMSO. В большинстве случаев, даже если выход не максимален, кавитированные структуры все равно состоят из трех линий бластоцисты. Появление трех линий бластоцисты и формирование эмбрионально-абембрионной оси может быть подтверждено иммунофлуоресцентным окрашиванием маркеров (EPI: NANOG, OCT4, TE: GATA3, Polar-TE NR2F2, Mural-TE: CDX2, PrE: GATA4; Рисунок 2E,G). Трофосферы, которые состоят только из ТЭ, помогают в дальнейшем препарировать роль межклеточной связи. Трофосферы могут образовываться с эффективностью 50%-60% в течение 96 ч после индукции (рисунок 2H,I). Бластоидное образование может быть выполнено не только в самодельных микроскважинных массивах, но и в коммерчески доступных сверхнизких пластинах крепления 96 скважин с оптимизацией условий индукции (см. Протокол и Рисунок 2J). Бластоиды также обладают способностью к дальнейшему развитию в течение дополнительных 6 дней, что эквивалентно времени эмбриону 13-го дня, с протоколом дифференцировки in vitro (рисунок 2K). Для дальнейшей характеристики клеточного состояния бластоидных клеток необходимо использовать технологию секвенирования одноклеточной РНК. UMAP обычно применяется для визуализации распределения состояний клеток, и на нем выполняется неконтролируемый кластерный анализ для оценки близости отдельных состояний клеток. Различные параметры в анализе одноклеточных данных могут влиять на то, как ячейки отображаются в UMAPs, что приводит к кластерам с различными пространственными и относительными положениями и формами (рисунок 3A). Однако в этом анализе клетки отображают заметно воспроизводимо различные кластерные профили независимо от параметров, используемых для выполнения кластеризации и визуализации данных, что позволяет с высокой степенью достоверности различать три линии бластоцисты. Мы использовали клетки эмбрионов, собранных на разных стадиях развития, в качестве эталона. Слияние этих наборов данных показывает, что большинство аналогов трофэктодермы из бластоида сгруппированы с предимплантационной трофэктодермой, но не с постимплантационными трофобластами (рисунок 3B). Эти результаты также были подтверждены независимым консорциумом10. Когда гаструлирующие эмбрионы Карнеги стадии 7 (CS7) вводятся в референс-карту, небольшая популяция бластоидных клеток (3%) группируется с линиями мезодермы и амниона этих эмбрионов (рисунок 3C). Когда амнионоподобные клетки вводятся в эталонную карту, небольшая популяция бластоидных клеток (< 2%) группируется с такими амнионоподобными клетками. В целом, только структуры, включающие одну правильную полость, один внутренний кластер клеток, общий размер от 150-250 мкм, включающие транскриптомные аналоги трех линий бластоцисты и в значительной степени лишенные других линий (например, амнион, мезодерма, внеэмбриональная мезодерма), считаются человеческими бластоидами. Рисунок 1: Четыре функции и два подхода к генерации высокоточных бластоидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Бластоиды и трофосферы, полученные из агрегатов наивного hPSC. (A) Фазоконтрастные изображения, показывающие наивные hPSCs, культивируемые в среде PXGL, совместно культивируемой с облученным MEF. Шкала: 50 мкм. (B) Фазоконтрастные изображения, показывающие морфологическое изменение наивных агрегатов hPSCs, культивируемых на неадгезивной гидрогелевой микролуночной решетке с 500 нМ LPA (среда PALLY). Шкала стержня: 200 мкм. (C) Человеческие бластоиды, образующиеся на микролуночном массиве через 96 ч. Шкала баров: 400 мкм. (D) Количественная оценка процента микролунок, содержащих бластоид человека, индуцированный состоянием культуры PALLY с оптимизированной концентрацией LPA из различных наивных линий hPSC (n = 3 микролуночных массива). (E) иммунофлуоресцентное окрашивание бластоидов человека маркерами эпибластов (EPI) (желтыми) NANOG и OCT4; маркеры TE (голубой) CDX2 и GATA3; и примитивный маркер энтодермы (пурпурный) SOX17 и GATA4. Шкала: 100 мкм. (H-I) Количественная оценка количества клеток (слева) и процента клеток (справа), принадлежащих каждой линии в бластоиде (96 ч) на основе иммунофлуоресцентного окрашивания OCT4, GATA3 и GATA4. (G) Иммунофлуоресцентное окрашивание человеческих бластоидов для CDX2 (голубой) и NR2F2 (пурпурный). (F) Фазоконтрастные изображения трофосферов ранней и поздней стадии на микролуночной решетке, индуцированные добавлением 3 мкМ SC144 (H) или 2 мкМ XMU-MP-1 (I), соответственно. (J) Фазоконтрастные изображения, показывающие морфологическое изменение наивных агрегатов hPSCs, культивируемых в пластине скважины со сверхнизким прикреплением 96 с 500 нМ LPA (среда PALLY). (K) Фазоконтрастное изображение (слева) и иммунофлуоресцентное окрашивание (справа) для OCT4 (желтый), GATA3 (голубой) и GATA4 (пурпурный) в бластоиде, выращенном в постимплантационном состоянии культуры в течение 6 дней. Шкала: 100 мкм. Эта цифра скорректирована с 6,10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Характеристика состава бластоидов путем секвенирования одиночных клеток. (A) Неконтролируемый кластерный анализ с различными параметрами на UMAP транскриптома одиночных клеток, полученных из различных временных точек бластоида (24 ч, 60 ч, 96 ч), наивных гПСК, праймированных гПСК и hTSC (представляют собой постимплантационный цитотрофофобласт). (B) UMAP транскриптома клеток, полученных из бластоида (96 ч), наивных hPSCs и праймированных hPSCs, интегрированных с опубликованными наборами данных человеческих эмбрионов стадий предимплантации, периимплантации (бластоцисты in vitro ) и гаструляции (стадия Карнеги 7, т.е. между E16-19). Отдельные клетки окрашиваются на основе их происхождения в человеческих эмбрионах (слева), бластоидных клетках или стволовых клетках (посередине) и результате неконтролируемого кластерного анализа (справа). (C)UMAP транскриптома клеток, полученных из бластоидов, наивных hPSCs, праймированных hPSCs и интегрированных с опубликованным набором данных из гаструляции (стадия Карнеги 7, т.е. между E16-19) стадии эмбриона. Отдельные клетки окрашиваются на основе их происхождения в человеческих эмбрионах (слева), бластоидных клетках или стволовых клетках (посередине) и результате неконтролируемого кластерного анализа (справа). Эта цифра адаптирована из6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительная таблица 1: Вся композиция среды, используемая в данном исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Discussion

В настоящем исследовании мы показываем шаг за шагом, как установить человеческие бластоиды с высокой эффективностью, используя простой и надежный протокол. При агрегации наивных PXGL hPSC и их тройном ингибировании бластоиды образуются эффективно (> 70%) и последовательно генерируют 3 аналога бластоцисты в течение 4 дней. Ограничения в эффективности и качестве бластоидов (например, наличие нецелевых клеток) могут возникать, если исходное состояние является неутолимным. Следует отметить, что мы измерили, что PXGL hPSCs содержит около 5% клеток, отражающих стадии после имплантации. Эти клетки могут ограничивать образование высококачественных бластоидов. Помимо первоначального наивного состояния PXGL, которое отражает эпибласт бластоцисты, другим ключевым фактором является среда, используемая для образования бластоидов. Чтобы быстро сформировать бластоцистоподобные клетки и предотвратить образование нецелевых, постимплантационных клеток, мы предполагаем, что ингибирование тройных путей (Hippo, ERK, TGF-β) имеет важное значение. В то время как различные клеточные линии дают разные выходы бластоида при ингибировании ERK / TGF-β (обычно около 10-20%), воздействие LPA приводит к образованию одинаково высокого выхода бластоида по всем клеточным линиям, при использовании строгих морфометрических критериев и критериев спецификации линии. LPA, возможно, действует на ингибирование пути Hippo, который играет решающую роль в первой линии сегрегации между линиями эпибластов и трофэктодерм у мышей и человека 8,51. Значительное улучшение эффективности бластоида LPA предполагает, что механизмы спецификации внутренней-внешней клетки, опосредованные путем Гиппопоспособа, в игре в бластоцисте, кооптированы во время образования бластоидов. Текущее ограничение заключается в том, что из-за неоптимальности протоколов, используемых для культивирования бластоцисты человека или бластоидов в эквивалентный времени день 7-13 (после образования бластоцисты/ бластоида), мы не в состоянии оценить, в какой степени мы можем правильно моделировать постимплантационное развитие.

Анализ транскриптомного состояния бластоидных клеток может быть легко достигнут с использованием scRNAseq, адекватных справочных карт и биоинформационных методов. Ранее транскриптомный анализ показал, что hPSCs, культивируемые в PXGL, более похожи на эпибласт бластоцисты по сравнению с праймированным состоянием. Ограничения в анализе данных могут возникнуть, если эталонная карта содержит только клетки стадии бластоцисты. Эталонная карта должна включать клетки, происходящие из постимплантационных эмбрионов, чтобы оценить наличие потенциальных нецелевых клеток. В будущем, чтобы сравнить бластоидные клетки, эталонная карта, включающая все ткани до- и послеимплантационной концепции человека, будет чрезвычайно ценной. Кроме того, мультиомные одноклеточные справочные карты, например, включая транскриптом, доступность хроматина и метилирование ДНК, еще больше помогут. Наконец, стандартизированные биоинформационные методы количественной оценки сходства между клетками из эмбриональных моделей и эталонных концепций, а также для положительной идентификации нецелевых клеток помогут в дальнейшем объективно анализировать и сравнивать результаты.

В целом, бластоиды, образованные путем тройного ингибирования путей Hippo, TGF-β и ERK, обладают четырьмя особенностями: 1) высокоэффективный морфогенез, 2) правильная спецификация последовательности линий, 3) высокая чистота бластоцистоподобных клеток на уровне транскриптома, 4) способность моделировать развитие периимплантации. Эти особенности бластоидов облегчат построение гипотез о развитии бластоцисты и имплантации, однако они не повторяют более ранние стадии эмбрионального развития. В отличие от ограниченной доступности и универсальности бластоцисты человека, бластоиды поддаются генетическим и лекарственным скринингам для функциональных исследований развития и имплантации бластоцисты. В будущем такие базовые знания могут способствовать улучшению формулирования средств ЭКО, разработке контрацептивов после оплодотворения и улучшению ведения ранней беременности.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Этот проект получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках исследовательской и инновационной программы Европейского Союза Horizon 2020 (грантовое соглашение ERC-Co No 101002317 «BLASTOID: платформа открытий для раннего эмбриогенеза человека»). H.H.K. поддерживается Австрийским научным фондом (FWF), Lise Meitner Program M3131-B. Мы благодарим Ясухиро Такашиму за совместное использование клеточных линий H9 и H9-GFP, а также Остина Смита, Питера Эндрюса и Гэ Го за совместное использование клеточных линий HNES1, Shef6, niPSC 16.2b и cR-NCRM2. Мы благодарим Хоссейна Бахарванда за то, что он поделился эндометриальными органоидами. Мы благодарим Джошуа М. Брикмана за то, что он поделился РНК, выделенной из дифференцированных клеток PrE и nEND-клеток. Мы благодарим Шанкара Шриниваса за то, что он поделился данными секвенирования одноклеточной РНК эмбриона пери-гаструляции. Благодарим Александра Быкова и Луизу Кочеллу за техническую помощь в подготовке библиотеки SMARTSeq2. Мы благодарим центр NGS, Biooptic и Stem Cell в IMBA за критически важную помощь.

Materials

Neurobasal media in house
DMEM/F12 in house
100X N2 supplemen Gibco 17502048
50X B27 supplement Gibco 17504044
100X Glutamax Gibco 35050038
100 mM Sodium Pyruvate Gibco 11360039
MEM-Non-essential amino acids Gibco 11140050
1 M Hepes in house
50 mM 2-Mercaptoethanol Thermofisher 31350010
100X Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P0781
Bovine Serum Albumin solution Sigma-Aldrich A7979
PD0325901 Medchem express HY-10254
XAV-939 Medchem express HY-15147
Gö 6983 Medchem express HY-13689
Human recombinant Leukemia Inhibitory Factor in house
A83-01 Medchem express HY-10432
1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) Peprotech 2256236
Y-27632 Medchem express HY-10583
CMRL medium Gibco 21530027
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermofisher 10-828-028
Accutase Biozym B423201 cell detachment solution
Geltrex Thermofisher A1413302 growth factor basement membrane extract
TROP2 antibody R&D systems MAB650
PDGFRα antibody R&D systems AF307
SC-144 Axon 2324
XMU-MP-1 Med Chem Express HY-100526
Matrigel basement membrane matrix
Countess cell counting chamber slides Thermo fisher cell counting slides
DAPI Staining Solution Miltenyi Biotec 130-111-570
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Rivron, N., et al. Debate ethics of embryo models from stem cells. Nature. 564 (7735), 183-185 (2018).
  2. Hyun, I., Munsie, M., Pera, M. F., Rivron, N. C., Rossant, J. Toward Guidelines for Research on Human Embryo Models Formed from Stem Cells. Stem Cell Reports. 14 (2), 169-174 (2020).
  3. Clark, A. T., et al. Human embryo research, stem cell-derived embryo models and in vitro gametogenesis: Considerations leading to the revised ISSCR guidelines. Stem Cell Reports. 16 (6), 1416-1424 (2021).
  4. Lovell-Badge, R., et al. ISSCR Guidelines for Stem Cell Research and Clinical Translation: The 2021 update. Stem Cell Reports. 16 (6), 1398-1408 (2021).
  5. Rivron, N. C., et al. Blastocyst-like structures generated solely from stem cells. Nature. 557 (7703), 106-111 (2018).
  6. Kagawa, H., et al. Human blastoids model blastocyst development and implantation. Nature. , 04267-04268 (2021).
  7. Meistermann, D., et al. Integrated pseudotime analysis of human pre-implantation embryo single-cell transcriptomes reveals the dynamics of lineage specification. Cell Stem Cell. 28 (9), 1625-1640 (2021).
  8. Gerri, C., et al. Initiation of a conserved trophectoderm program in human, cow and mouse embryos. Nature. 587 (7834), 443-447 (2020).
  9. Gerri, C., Menchero, S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. A., Niakan, K. K. Human Embryogenesis: A Comparative Perspective. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 411-440 (2020).
  10. Zhao, C., et al. Reprogrammed iBlastoids contain amnion-like cells but not trophectoderm. bioRxiv. , 2021.05.07.442980 (2021).
  11. Zijlmans, D. W. Integrated multi-omics reveal polycomb repressive complex 2 restricts human trophoblast induction. Nat. Cell Biol. 24, 858-871 (2022).
  12. Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).
  13. Guo, G., et al. Epigenetic resetting of human pluripotency. Development. 144 (15), 2748-2763 (2017).
  14. Takashima, Y., et al. Resetting transcription factor control circuitry toward ground-state pluripotency in human. Cell. 158 (6), 1254-1269 (2014).
  15. Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  16. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  17. Stirparo, G. G., et al. Integrated analysis of single-cell embryo data yields a unified transcriptome signature for the human pre-implantation epiblast. Development. 145 (3), 158501 (2018).
  18. Castel, G., et al. Induction of Human Trophoblast Stem Cells from Somatic Cells and Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 33 (8), 108419 (2020).
  19. Posfai, E., et al. Evaluating totipotency using criteria of increasing stringency. Nature Cell Biology. 23 (1), 49-60 (2021).
  20. Nakamura, T., et al. A developmental coordinate of pluripotency among mice, monkeys and humans. Nature. 537 (7618), 57-62 (2016).
  21. Theunissen, T. W., et al. Molecular Criteria for Defining the Naive Human Pluripotent State. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
  22. Guo, G., et al. Naive Pluripotent Stem Cells Derived Directly from Isolated Cells of the Human Inner Cell Mass. Stem Cell Reports. 6 (4), 437-446 (2016).
  23. Rossant, J. Genetic Control of Early Cell Lineages in the Mammalian Embryo. Annual Review of Genetics. 52, 185-201 (2018).
  24. De Paepe, C., et al. Human trophectoderm cells are not yet committed. Human reproduction. 28 (3), 740-749 (2013).
  25. Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 1212-1221 (2013).
  26. Io, S., et al. Capturing human trophoblast development with naive pluripotent stem cells in vitro. Cell Stem Cell. 28 (6), 1023-1039 (2021).
  27. Guo, G., et al. Human naive epiblast cells possess unrestricted lineage potential. Cell Stem Cell. 28 (6), 1040-1056 (2021).
  28. Liu, X., et al. Modelling human blastocysts by reprogramming fibroblasts into iBlastoids. Nature. 591 (7851), 627-632 (2021).
  29. Hirate, Y., et al. Polarity-dependent distribution of angiomotin localizes Hippo signaling in preimplantation embryos. Current biology: CB. 23 (13), 1181-1194 (2013).
  30. Cockburn, K., Biechele, S., Garner, J., Rossant, J. The Hippo pathway member Nf2 is required for inner cell mass specification. Current Biology: CB. 23 (13), 1195-1201 (2013).
  31. Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature Biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
  32. Krendl, C., et al. GATA2/3-TFAP2A/C transcription factor network couples human pluripotent stem cell differentiation to trophectoderm with repression of pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9579-9588 (2017).
  33. Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
  34. Horii, M., Bui, T., Touma, O., Cho, H. Y., Parast, M. M. An Improved Two-Step Protocol for Trophoblast Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 96 (2019).
  35. Okae, H., et al. Derivation of Human Trophoblast Stem Cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63 (2018).
  36. Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
  37. Kuijk, E. W., et al. The roles of FGF and MAP kinase signaling in the segregation of the epiblast and hypoblast cell lineages in bovine and human embryos. Development. 139 (5), 871-882 (2012).
  38. Roode, M., et al. Human hypoblast formation is not dependent on FGF signalling. Biologia dello sviluppo. 361 (2), 358-363 (2012).
  39. Linneberg-Agerholm, M., et al. Naïve human pluripotent stem cells respond to Wnt, Nodal and LIF signalling to produce expandable naïve extra-embryonic endoderm. Development. 146 (24), (2019).
  40. Yu, L., et al. Blastocyst-like structures generated from human pluripotent stem cells. Nature. 591 (7851), 620-626 (2021).
  41. Yanagida, A., et al. Naive stem cell blastocyst model captures human embryo lineage segregation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1016-1022 (2021).
  42. Zappia, L., Oshlack, A. Clustering trees: a visualization for evaluating clusterings at multiple resolutions. GigaScience. 7 (7), (2018).
  43. Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
  44. Messmer, T., et al. Transcriptional Heterogeneity in Naive and Primed Human Pluripotent Stem Cells at Single-Cell Resolution. Cell Reports. 26 (4), 815-824 (2019).
  45. Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
  46. Petropoulos, S., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Lineage and X Chromosome Dynamics in Human Preimplantation Embryos. Cell. 167 (1), 285 (2016).
  47. Tyser, R. C. V., et al. A spatially resolved single cell atlas of human gastrulation. bioRxiv. , (2020).
  48. Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  49. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  50. Ma, H., et al. In vitro culture of cynomolgus monkey embryos beyond early gastrulation. Science. 366 (6467), (2019).
  51. Nishioka, N., et al. The Hippo signaling pathway components Lats and Yap pattern Tead4 activity to distinguish mouse trophectoderm from inner cell mass. Developmental Cell. 16 (3), 398-410 (2009).

Tags

Human BlastoidsBlastocyst DevelopmentImplantationIn Vitro FertilizationPre-clinical ModelingTherapeutic TargetsNon-hormonal ContraceptivesMEF ExclusionPXGL MediaN2B27 Basal MediaAggregation MediaCell DetachmentMicroWells

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Kagawa, H., Javali, A., Heidari Khoei, H., Sommer, T. M., Sestini, G., Novatchkova, M., Scholte op Reimer, Y., Rivron, N. Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation. J. Vis. Exp. (186), e63388, doi:10.3791/63388 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image