JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia dello sviluppo

Protocol voor humane blastoïden modellering blastocyst ontwikkeling en implantatie

Published: August 10, 2022
doi:
10.3791/63388
, , , , , , ,
1Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA),Vienna Biocenter (VBC), 2Institute of Molecular Pathology (IMP),Vienna Biocenter (VBC), 3Vienna BioCenter PhD Program,Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna

Summary

Een protocol dat de vorming van menselijke blastoïden schetst die efficiënt, tijdig en sequentieel blastocystachtige cellen genereren.

Abstract

Een model van de menselijke blastocyst gevormd uit stamcellen (blastoïde) zou wetenschappelijke en medische vooruitgang ondersteunen. Zijn voorspellende kracht zal echter afhangen van zijn vermogen om efficiënt, tijdig en getrouw de sequenties van blastocystontwikkeling (morfogenese, specificatie, patroonvorming) samen te vatten en cellen te vormen die het blastocyststadium weerspiegelen. Hier laten we zien dat naïeve menselijke pluripotente stamcellen gekweekt in PXGL-omstandigheden en vervolgens drievoudig geremd voor het nijlpaard, transformerende groeifactor- β, en extracellulaire signaalgereguleerde kinaseroutes efficiënt morfogenese ondergaan om blastoïden te vormen (>70%). Overeenkomend met de ontwikkelingstiming (~ 4 dagen), ontrollen blastoïden de blastocystsequentie van specificatie door analogen van de trofoblast en epiblast te produceren, gevolgd door de vorming van analogen van het primitieve endoderm en de polaire trofoblasten. Dit resulteert in de vorming van cellen die transcriptioneel vergelijkbaar zijn met de blastocyst (>96%) en een minderheid van post-implantatie-analogen. Blastoïden vertonen efficiënt patroon door de embryonaal-abembryonische as te vormen die wordt gekenmerkt door de rijping van het poolgebied (NR2F2 +), die het specifieke potentieel krijgt om zich richtingsgewijs te hechten aan hormonaal gestimuleerde endometriumcellen, zoals in utero. Zo’n menselijke blastoïde is een schaalbaar, veelzijdig en ethisch model om menselijke ontwikkeling en implantatie in vitro te bestuderen.

Introduction

Een gebrek aan experimentele modellen heeft het begrip van vroege menselijke embryogenese beperkt. De huidige kennis van mensspecifieke aspecten van embryonale ontwikkeling is afgeleid van overtollige in-vitrofertilisatie (IVF) embryo’s die zijn gedoneerd voor onderzoek. De beperkte beschikbaarheid, moeilijkheden van experimentele manipulaties en de variabele kwaliteit van de embryo’s belemmeren echter wetenschappelijk onderzoek. Integendeel, een getrouw in vitro model van menselijke embryo’s zou complexe experimentele manipulaties mogelijk maken, waardoor een ethische mogelijkheid wordt geboden om het onderzoek op menselijke embryo’s aan te vullen 1,2,3,4. Een eerder ontwikkeld model van muizenblastocysten combineerde embryonale stamcellen van muizen en trofoblaststamcellen5. In dit gedetailleerde protocol wordt een methode beschreven om een model van de menselijke blastocyst te genereren uit naïeve pluripotente stamcellen die trouw is aan elementaire blastocystcriteria6.

Vier criteria voor menselijke blastoïden. Hier, in een poging om een gestandaardiseerde definitie van menselijke blastoïden vast te stellen, stellen we vier minimale criteria voor. Hoewel niet uitputtend, kunnen deze criteria als basis dienen om de parameters te evalueren die de vorming van menselijke blastoïden mogelijk maken (figuur 1A). (1) Blastoïden moeten zich efficiënt vormen in termen van morfologie en generatie van de analogen van de drie afstammingslijnen, namelijk epiblast (Epi), trophectoderm (TE) en primitief endoderm (PrE). Inefficiëntie wijst waarschijnlijk op een ontoereikende initiële celtoestand en/of kweekconditie (bijv. Blastoïde medium). (2) Blastoïden moeten analogen van de drie afstammingslijnen genereren volgens de ontwikkelingssequentie (Epi/TE eerst, PrE/polarTE laatste)7,8 en timing (inductie ~ 3 dagen; embryonale dagen 5-7)7,9. (3) Blastoïden moeten analogen vormen van het blastocyststadium, maar niet van post-implantatiestadia (bijv. post-implantatie epiblast-, trofoblast- of amnioncellen). (4) Ten slotte moeten blastoïden in staat zijn de functionele kenmerken van de implantatie en ontwikkeling van blastocysten samen te vatten. Met behulp van dit protocol vormen menselijke blastoïden zich efficiënt met behulp van meerdere cellijnen (>70%), zijn ze in staat om de blastocyst cellulaire analogen sequentieel en binnen 4 dagen te genereren, en de analogen zijn transcriptioneel vergelijkbaar met de blastocystfase (>96% op basis van verschillende analyses)6,10,11. Ten slotte genereren blastoïden robuust de embryonaal-abembryonische as, waardoor ze kunnen interageren met hormonaal gestimuleerde endometriumcellen door het poolgebied en de afstammingslijnen robuust kunnen uitbreiden bij uitgebreide kweek (tijdequivalent: embryonale dag 13).

Het belang van de initiële celtoestand. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC’s) kunnen worden gestabiliseerd in verschillende toestanden die proberen nauwkeurige ontwikkelingsstadia vast te leggen. Deze toestanden worden in stand gehouden door kweekomstandigheden die, hoewel nog steeds suboptimaal, cellen beperken in een pre-implantatie- (~ embryonale dagen 5-7) of post-implantatie-achtige (~ embryonale dagen 8-14) epiblaststadium12. Transcriptomische analyse toonde aan dat hPSC’s gekweekt in PD0325901, XAV939, Gö6983 en leukemie remmende factor (LIF; pxgl naïeve hPSC’s genoemd)13,14 meer lijken op de blastocyst epiblast in vergelijking met hPSC’s gekweekt in fibroblastgroeifactor (FGF) 2 en activine15 (geprimeerde hPSCs12 genoemd) en met menselijke uitgebreide pluripotente stamcellen (hEPSCs)16 (zie analyse in referenties17, 18,19). Dienovereenkomstig komt het transcriptoom van geprimeerde hPSC’s het beste overeen met een post-implantatie / pre-gastrulatie cynomolgus aap epiblast20. Aanvullende moleculaire criteria, zoals transposonexpressie, DNA-methylatie en X-chromosoomtoestand, bevestigden dat variaties van de naïeve toestand meer lijken op de blastocyst-epiblast in vergelijking met de geprimeerde toestand17,21. Ten slotte zijn lijnen van naïeve hPSC’s met succes rechtstreeks afgeleid van blastocysten met behulp van PXGL-kweekomstandigheden22.

Menselijke vroege blastocystcellen zijn nog niet gepleegd. Murine afstammingsspecificatie vindt plaats vanaf het morulastadium dat voorafgaat aan het blastocyststadium23. Integendeel, dissociatie- en heraggregatie-experimenten hebben aangetoond dat de menselijke trophectodermcellen van vroege blastocysten nog niet zijn gepleegd24. Dienovereenkomstig heeft analyse van de cellen van menselijke blastocysten door eencellige RNA-sequencing (scRNAseq) aangetoond dat de eerste afstammingsspecificatie (trofoblast / epiblast) optreedt na de vorming van de blastocystholte7. Deze uitgestelde menselijke specificatie correleert met observaties dat hPSC’s krachtig zijn om trofoblasten 25,26,27 te vormen wanneer psc’s van muizen grotendeels toegewijd zijn aan de epiblastlijn. Deze gecombineerde waarnemingen leidden tot de mogelijkheid dat naïeve hPSC’s een blastocyststadium weerspiegelen en het potentieel behouden om de drie blastocystlijnen te vormen. Onlangs is voorgesteld om de potentie van hPSC’s om extra-embryonale analogen te specificeren om te verschuiven van trophectoderm naar amnion tijdens progressie van naïeve naar geprimeerde toestand27. Naïeve hPSC’s lijken dus meer op de pre-implantatiefase 17,18,21 en hebben een verbeterd vermogen om trofoblasten te vormen in vergelijking met geprimeerde hPSC’s27, hEPSCs16 of intermediaire geherprogrammeerde toestanden28, die vatbaar zijn voor post-implantatie-analogen10 (Figuur 1B ). De initiële celtoestand is dus cruciaal voor het vormen van de juiste extra-embryonale analogen. Hoewel een grondige side-by-side analyse van geconverteerde trophectoderm-analogen nog moet worden gedaan, lijkt een PXGL-naïeve toestand die de vroege blastocyst weerspiegelt belangrijk om high-fidelity blastoïden te vormen.

Induceren van specificatie en morfogenese door het signaleren van remming van routes. De remming van de Hippo-signaleringsroute is een geconserveerd mechanisme dat trofoblastspecificatie aandrijft bij muizen, koeien en mensen 9,29,30. Ook is sinds 2013 bekend dat de remming van de NODAL (A83-01) en het extracellulaire signaalgeregelde kinase (ERK; PD0325901 of gelijkwaardig) en de activering van de botmorfogenetische eiwit (BMP) signaleringsroutes triggert geprimeerde hPSC’s om het transcriptionele netwerk geassocieerd met de trofoblastlijn te activeren 25,31,32,33,34. Bovendien bevestigden onlangs verschillende rapporten ook dat de remming van zowel NODAL- als ERK-route en activering van BMP de trofoblastdifferentiatie van naïeve hPSC’s 25,31,32,33,34 vergemakkelijken. Ten slotte, als trofoblastspecificatie wordt geactiveerd vanuit een naïeve toestand, recapituleren cellen aspecten van de ontwikkelingsprogressie van het trophectoderm26. Zelfvernieuwende lijnen die het blastocyst-trophectoderm weerspiegelen, zijn echter niet in vitro gestabiliseerd. Volgens trofoblastspecificatie kan inductie van de epidermale groeifactor (EGF) en Wnt-signaalroutes samen met HDAC-remming de ontwikkelingsprogressie van trofoblast34,35 vergemakkelijken en cellen stabiliseren in lijnen van menselijke trofoblaststamcellen (hTC’s) die post-implantatie cytotrophoblastenweerspiegelen 18,35. Dergelijke lijnen kunnen zowel van blastocysten als placentaweefsels worden afgeleid35.

De tweede extra-embryonale afstamming, PrE genaamd, wordt gespecificeerd na trofoblasten en is afkomstig van de epiblast 7,9. In tegenstelling tot murine PrE36 wordt gedacht dat de menselijke tegenhanger onafhankelijk is van FGF-signalering 37,38. Lijnen die het extra-embryonale endoderm (nEnd genoemd) weerspiegelen, werden vastgesteld uit naïeve hPSC’s door inductie van signaalroutes met behulp van activine A, Wnt en LIF39. In tegenstelling tot embryoremmingsexperimenten is aangetoond dat ERK-remming de vorming van dergelijke nEND-cellen in vitro voorkomt39. Tot nu toe zijn dergelijke lijnen niet rechtstreeks afgeleid van blastocysten.

De laatste tijd zijn modellen van het vroege embryo gevormd door variaties van de media te combineren die eerder zijn ontwikkeld voor hTSCs35 en nEND-cellen39, waardoor activatoren van de transformerende groeifactor- β (TGF-β), EGF en Wnt-signaalroutes28,40 worden gebruikt. Deze embryomodellen vormen zich met een laag rendement (10%-20%) en vormen cellen die lijken op de post- in plaats van pre-implantatiefase10, inclusief analogen van de post-implantatie epiblast, trofoblast, amnion, gastrula, mesodermale weefsels (~ embryonale dag 14) en cytotrophoblasten10. Integendeel, een drievoudige remming van de Hippo-, ERK- en TGF-β-paden leidt efficiënt de vorming van blastoïden bestaande uit blastocystachtige cellen41. Samen met de initiële celtoestand stellen we voor dat remming van drievoudige routes (Hippo, ERK, TGF-β) de tweede essentiële parameter is om high-fidelity blastoïden te vormen (figuur 1B).

Evaluatie van de celtoestand en het gereflecteerde stadium met behulp van scRNAseq. De toestanden van cellen waaruit blastoïden bestaan, kunnen worden geëvalueerd door middel van scRNAseq-analyse. Hun transcriptionele gelijkenis met specifieke embryonale stadia kan worden gemeten met behulp van blastoïde cellen alleen en door vergelijking met geprimeerde hPSC’s of hTSC’s die post-implantatiestadiaweerspiegelen 20,35. Het uitvoeren van clusteranalyses met behulp van verschillende definitieniveaus onthult hoe subpopulaties geleidelijk samensmelten wanneer de definitie afneemt, waardoor de overeenkomsten tussen clusters worden onthuld. Hoewel optimaliteit in het aantal clusters kan worden gemeten42, informeert clustering met hoge resolutie ook over de uiteindelijke aanwezigheid van kleine abnormale subpopulaties, bijvoorbeeld als gevolg van de post-implantatiestadia10. De genen die differentieel tot expressie komen tussen clusters kunnen informatie verschaffen over hun analogen in het ontwikkelingsproces door de expressieniveaus van referentiegensets te beoordelen die stadiumspecifieke afstammingslijnen definiëren. Dit maakt het mogelijk om de verrijking van blastoïde subpopulaties te meten door middel van onbewaakte afstandskaarten (bijvoorbeeld met behulp van topverrijkte genen) of door gensetverrijkingsanalyse (GSEA)43. Met behulp van dit blastoïdeprotocol vormen zich slechts drie hoofdclusters die transcriptioneel de drie blastocystlijnen weerspiegelen. Eén cluster omvat zowel de initiële naïeve hPSC’s als het epiblastanaloog van de blastoïden. Het analyseren van cellen op verschillende tijdstippen toonde de sequentiële aard van afstammingsspecificaties (trofoblasten beginnen binnen 24 uur te specificeren en primitieve endodermcellen binnen 60 uur). Een clustering met hoge resolutie legde een subpopulatie van cellen (3,2%) vast die genen tot expressie brachten die specifiek zijn voor embryo’s in het gastrulatiestadium (mogelijk mesoderm of amnion). Van belang is dat de initiële naïeve hPSC’s ook 5% van post-implantatie-achtige cellen omvatten, zoals eerder beschreven44. In een tweede analyse kunnen blastoïde cellen in silico worden samengevoegd met referentiecellen geïsoleerd uit concepti in verschillende stadia 45,46,47 om fase-equivalentie af te leiden. Hier werden cellen geïsoleerd uit pre-implantatieconcepti45,46, in vitro gekweekte blastocysten45 en gastrulatiestadiumembryo’s47 als referentiepunten gebruikt. Met behulp van dit protocol werd gekwantificeerd dat de niet-overeenkomende blastoïde cellen die worden onthuld door clustering met hoge resolutie inderdaad clusteren met mesoderm en amnion na implantatie. In toekomstige stappen moet transcriptoombenchmarking worden aangevuld met analyse van transposonexpressie, DNA-methylatie en van de X-chromosoomstatus die ook oriëntatiepunten van ontwikkelingsstadia21 bieden.

Evaluatie van asvorming en andere functionaliteiten van menselijke blastoïden. Een volwassen blastocyst wordt gekenmerkt door de vorming van de embryonaal-abembryonische as die trofoblasten patroont voor implantatie. Met behulp van dit blastoïdeprotocol vormt zich een as die robuust wordt geïllustreerd door een rijping van de proximale trofoblasten (bijv. NR2F2 +/CDX2-) die alleen het vermogen verwerven om zich te hechten aan endometriumorganoïde cellen wanneer ze hormonaal worden gestimuleerd48,49. Vergelijking met trofosfen die de epiblast niet vormen, laat zien dat deze binnenste cellen aangrenzende trofoblasten laten rijpen om de initiële aanhechting aan het baarmoederslijmvlies te bemiddelen. Wanneer gekweekt in een uitgebreid kweekmedium dat is ontworpen voor cynomolgus-apenblastocysten50, breiden alle drie de afstammingslijnen van de blastoïde zich consequent uit gedurende zes extra dagen (tijdsequivalent van dag 13), hoewel hun organisatie dat ontwikkelingsstadium niet weerspiegelt.

De implicatie van hoogrenderende en high-fidelity menselijke blastoïden. Het behoud van ontwikkelingsprincipes die werden ontdekt in modelorganismen is inherent moeilijk te testen in het menselijke conceptus vanwege de beperkte toegang en de technische moeilijkheden bij het genetisch en fysiek manipuleren ervan. Een hoog-efficiëntie en high-fidelity blastoïde model zou high-throughput genetische en medicijnscreening mogelijk maken, die aan de basis liggen van wetenschappelijke en biomedische ontdekkingen. Bovendien zou de integratie van complexe genetische modificaties om biologische processen te veranderen en vast te leggen, dergelijke studies aanvullen. Over het algemeen stellen we voor dat de drievoudige remming (Hippo, TGF-β, ERK) van naïeve PXGL hPSCs geleidend is voor de efficiënte vorming van high-fidelity menselijke blastoïden die voldoen aan de vier minimale criteria. Het schaalbare en veelzijdige karakter van dit protocol maakt het geschikt om gerichte hypothesen te genereren die vervolgens kunnen worden gevalideerd met behulp van menselijke blastocysten. Als zodanig zullen menselijke blastoïden het gebruik van menselijke conceptus voor in vitro onderzoek niet vervangen, maar kunnen ze fungeren als een krachtige manier om onderzoek te leiden via voorheen ontoegankelijke experimentele benaderingen in het hart van het wetenschappelijke en biomedische ontdekkingsproces. Het protocol laat zien hoe menselijke blastoïden te vormen en ook hoe de cellen die zich in de blastoïde bevinden te analyseren.

Protocol

De Guidelines for Stem Cell Research and Clinical Translation van de International Society for Stem Cell Research (ISSCR) beveelt aan dat onderzoek naar menselijke blastoïden alleen is toegestaan na beoordeling en goedkeuring door middel van een gespecialiseerd wetenschappelijk en ethisch beoordelingsproces 3,4. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van het Instituut voor Moleculaire Biotechnologie van de Oostenrijkse Academie van Wetenschappen (IMBA) onder de goedkeuring Rivron_Stellungnahme_2020-04-22. Naleving van deze richtlijnen is noodzakelijk voor het publiceren van onderzoeksresultaten in wetenschappelijke tijdschriften. 1. Kweek van menselijke naïeve embryonale stamcellen in PXGL-toestand OPMERKING: Naïeve hPSC’s kunnen worden verkregen bij relevante laboratoria. De hier gebruikte lijnen werden verkregen uit de laboratoria van Yasuhiro Takashima (momenteel bij CiRA, Kyoto, Japan) en van Austin Smith (momenteel bij Living Systems Institute, Exeter, VK). Als alternatief kunnen naïeve hPSC’s intern worden gereset uit lijnen van geprimeerde hPSC’s zoals eerder beschreven13,14. Naïeve hPSC’s lijken stabiel voor meerdere passages (> 15), maar de kwaliteit van de cultuur kan in de loop van de tijd variëren. Als de kwaliteit van naïeve hPSC afneemt, ontdooi dan een nieuwe flacon met cellen of genereer de novo naïeve hPSC’s uit geprimeerde PSC’s. Voor alle mediacomposities zie aanvullende tabel 1. Bereiding van de doorstraalde embryonale feederlaag van muizen (MEF’s) Bereid de dag voor het passeren van naïeve hPSC’s een 6-well celkweekplaat met bestraalde MEF-lagen door de onderstaande stappen te volgen. Bestrijk een 6-well celkweekplaat met 1 ml 0,1% gelatine in PBS per putje. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 30 min. Verwijder de gelatine-oplossing. Bereid MEF-medium bij 37 °C. Ontdooi MEF’s in een waterbad bij 37 °C totdat er nog maar een klein ijsklompje over is. Los het volume van de injectieflacon op met 1 ml bereid MEF-medium met behulp van een P1000-pipet. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml. Draai de suspensie gedurende 4 minuten op 200 x g . Zuig het supernatant op en resuspend de MEF-pellet door vers MEF-medium toe te voegen (voldoende voor 1,5 ml per put). Tel de cellen met behulp van celtelglaasjes en voeg 300.000 cellen per put toe en breng de plaat over in een normoxy-incubator bij 37 °C.OPMERKING: Als MEF’s na verloop van tijd losraken, kunnen nieuwe MEF’s worden toegevoegd aan het PXGL-medium tijdens routinematige mediawisselingen. Passaging van menselijke naïeve pluripotente stamcellen Voordat u hPSC’s passeert, controleert u hun morfologie onder de microscoop. Kolonies hebben meestal een koepelvormige morfologie met heldere, gedefinieerde randen. Als de afzonderlijke kolonies een plattere morfologie vertonen of als er gedifferentieerde kolonies beginnen te ontstaan, volg dan de instructies van stap 1.2.8. Zuig het medium op en was de cellen eenmaal met PBS. Voeg 500 μL celloslatingsoplossing toe per put van een 6-putplaat. Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C. Gebruik een P1000-pipet en pipetteer de cellen meerdere keren om de kolonies in afzonderlijke cellen te dissociëren. Verzamel de cellen en breng ze over in een buis van 15 ml met wasbuffer (1 ml per put van een 6-well plaat). Draai de cellen gedurende 4 minuten op 200 x g . Zuig het supernatant op en resuspend de pellet in vers PXGL-medium (voldoende voor 1,5 ml per put). Overweeg een splitsingsverhouding van 1: 3-1: 6 voor routinematig passeren.OPMERKING: Na elke 3-4 passages of als de kwaliteit van de celcultuur afneemt op basis van de celmorfologie (bijv. De opkomst van platte kolonies in de populatie), voeg 10 μM Y-27632 en groeifactor keldermembraanextract (5 μL / put) toe aan het medium gedurende de eerste 24 uur na passaging. Voordat u de hPSC’s afslaat, bereidt u de platen voor met verse MEF’s door het MEF-medium aan te zuigen en de cellen eenmaal met PBS te wassen. Gebruik vervolgens een P1000-pipet om 1,5 ml hPSCs-celsuspensie over te brengen per put van een 6-putplaat met de MEF’s.OPMERKING: Zorg ervoor dat pipetteren leidt tot een homogene zaaiing van de cellen over het hele putgebied. Dit zorgt voor de groei van kolonies met homogene groottes en relatieve synchronisatie van de cellen. Kweek hPSC’s onder hypoxische omstandigheden bij 37 °C in een bevochtigde omgeving. Na 24 uur moeten hPSC’s worden aangesloten. Een groot aantal niet-hechtende (of zwevende) cellen weerspiegelt een probleem van levensvatbaarheid of van hechting bij het passeren. Verwissel het medium dagelijks met 1,5 ml PXGL-medium per put. Passeer hPSC’s om de 3-4 dagen of gebruik ze voor experimenten met blastoïdevorming.OPMERKING: Na het ontdooien van hPSC’s, passeer ze voor minimaal drie passages voordat u een blastoïde-experiment start. 2. Vorming van blastoïden Vorming van naïeve PSC-aggregaten Bereid de PXGL-media, N2B27 basale media, wasbuffer, PBS en aggregatiemedia voor en verwarm ze voordat u met het experiment begint. Sluit MEF’s uit van de hPSCs-suspensie voor het vormen van blastoïden door de onderstaande stappen te volgen. Bereid voor MEF-uitsluiting een met gelatine bedekte plaat door 1 ml 0,1% gelatine toe te voegen aan de put van een 6-wells plaat en te incuberen bij 37 °C gedurende 30-90 min. Om de cellen te oogsten, zuigt u het medium op en wast u de cellen met 1 ml PBS. Voeg 500 μL celloslatingsoplossing toe (per put van een 6-well plaat) en incubeer bij 37 °C gedurende 5 min. Controleer de cellen onder de microscoop om de dissociatie van kolonies in enkele cellen te volgen (een paar meercellige klonten kunnen later worden gedissocieerd door zacht pipetteren). Verdun de celloslatingsoplossing met 1 ml wasbuffer. Verzamel de cellen van de plaat door 5 tot 10 keer voorzichtig te pipetteren. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml. Draai de cellen gedurende 4 minuten op 200 x g . Zuig het supernatant op, resuspend de cellen in 1,5 ml PXGL-medium (per put van een 6-well plaat) en zaai de cellen op de met gelatine bedekte platen voor MEF-uitsluiting en incubeer bij 37 °C gedurende 60-90 min. Zodra de naïeve cellen zijn gezaaid voor MEF-uitsluiting, verwijdert u de PBS uit microwells en balanceert u de putten met 200 μL basaal N2B27-medium (per 1 microwell-chip) en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 °C. Verzamel het supernatant met de ongebonden naïeve cellen, breng het over naar een buis van 15 ml en draai de cellen gedurende 4 minuten met 200 x g naar beneden. Adem de media op en resuspend de cellen in 1 ml N2B27 basale media. Tel de cellen met behulp van celtellingsdia’s. Draai de cellen gedurende 4 minuten op 200 x g . Zuig het medium op en voeg een geschikte hoeveelheid van 10 μM Y-27632 toe in N2B27-media om een celdichtheid van 30.000 cellen per 50 μL te verkrijgen.OPMERKING: Het optimale initiële seeding celnummer kan variëren tussen de verschillende cellijnen. Om bijvoorbeeld 50-60 cellen / microwell te zaaien, worden 30.000 cellen (inclusief overschot gezien sommige cellen buiten de microwell vallen) gezaaid in 1 put van 96 putplaat die 430 microwells bevat. Een ongepast startcelnummer kan resulteren in de kleine aggregaatvorming zonder holte of vorming van caviteuze structuur die meer dan 250 μm bereikt. Zuig het medium op uit gebalanceerde microwell-arrays en voeg 25 μL N2B27-media toe met 10 μM Y-27632. Voeg 50 μL celsuspensie toe en incubeer bij 37 °C gedurende 15 minuten (totdat de cellen in de bodem van de microwell vallen). Voeg vervolgens 125 μL N2B27 medium toe, aangevuld met 10 μM Y-27632. Blastoid ontwikkeling Binnen 24 uur kunnen aggregaten van naïeve hPSC’s worden waargenomen (dag 0) op de microwell-chip. Om blastoïdevorming te starten, bereidt u PALLY-medium voor en volgt u de onderstaande stappen. Verwarm PALLY medium voor bij 37 °C gedurende 30 min.OPMERKING: 1-Oleoyl Lysofosfatidinezuur (LPA) en 10 μM Y-27632 moeten vlak voor gebruik worden toegevoegd. De optimale concentratie LPA varieert tussen 0,5-5 μM. Dit moet worden getitreerd voor individuele hPSC-lijnen die worden gebruikt voor blastoïden. Aspirateer het aggregatiemedium. Voeg 200 μL voorverwarmd PALLY medium toe aan de microwells. Plaats de celkweekplaat terug in een hypoxische incubator bij 37 °C. Herhaal de mediaverandering op dag 1. Verwijder op dag 2 het PALLY-medium en voeg 200 μL N2B27 medium aangevuld met LPA en 10 μM Y-27632 toe.OPMERKING: Op dag 2 blijft de meerderheid van de aggregaten groeien. Sommige aggregaten vormen echter kleine holtes. Kweek continu blastoïden in PALLY tot dag 4 of in vitro kweekmedium (IVC1) vanaf dag 2. Het volgen van deze mediaverandering verbetert echter de vorming van PrE in volwassen blastoïden. Herhaal mediaverandering op dag 3. Volledige blastoïdevorming vindt plaats op dag 4.OPMERKING: Blastoïden worden geacht volledig ontwikkeld te zijn wanneer ze volledige morfogenese hebben ondergaan op basis van morfometrie van dag 7 menselijke blastocysten (bijvoorbeeld een diameterbereik van 150 -250 μm; één binnenste cluster omgeven door een epitheel van trophectoderm-achtige cellen) en polaire trophectoderm-achtige cellen (NR2F2 + / CDX2-) en PrE-achtige cellen (GATA4 +) hebben gevormd. Dit kan worden beoordeeld met behulp van immunofluorescentiekleuring of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). 3. Vorming van blastoïden in 96-well ultra low attachment microplates Bereid naïeve hPSCs-celsuspensie voor blastoïdvorming voor door de hierboven beschreven stappen van 2.1.1 – 2.1.11 te volgen. Zuig het medium op en voeg een geschikte hoeveelheid N2B27-media toe die 10 μM Y-27632 bevatten om de celdichtheid van 70 cellen per 100 μL van het medium te verkrijgen.OPMERKING: Het optimale aantal initiële zaaicellen kan variëren tussen verschillende cellijnen. 70 cellen/put kan bijvoorbeeld het optimale celgetal zijn voor de meeste cellijnen. Centrifugeer de plaat bij 200 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur om cellen op de bodem van de putten te clusteren. Incubeer de plaat in een incubator bij 37 °C onder hypoxische kweekomstandigheden. Binnen 24 uur kunnen aggregaten van naïeve hPSC’s worden waargenomen (dag 0) op de putten. Bereid 2x PALLY medium. Voeg 100 μL voorgewarmd 2x PALLY medium toe aan de putjes. Plaats de celkweekplaat terug in een hypoxische couveuse bij 37 °C. Zuig na 24 uur de helft van de media (100 μL) op en vervang deze door 100 μL voorverwarmd PALLY-medium. Herhaal de stap tot dag 4. Zorg ervoor dat u de aggregaten niet aspirateert.OPMERKING: Op dag 2 blijft de meerderheid van de aggregaten groeien. Sommige aggregaten hebben echter kleine met vloeistof gevulde holtes. Op dag 4 ondergaan de meeste cavitaire structuren volledige morfogenese om blastocystachtige structuren te vormen. 4. Vorming van trofosfen Volg voor trofosferevorming het blastoïdvormingsprotocol van stap 2.1.1 (MEF-uitsluiting) tot stap 2.1.12 (laatste stap van het zaaiprotocol). Zodra aggregaten van naïeve hPSC’s zich na 24 uur hebben gevormd, wisselt u het aggregatiemedium uit met PALY (zonder LIF) aangevuld met 3 μM SC-144 voor de vorming van trofosfcellen die vroege trophectoderm vertegenwoordigen en PALLY aangevuld met 2 μM XMU-MP-1 voor de vorming van trofosfverbindingen die volwassen trophectoderm vertegenwoordigen. Ververs het medium dagelijks. Volledige trofosferevorming vindt plaats op dag 4. 5. Analyse van de blastoïde celtoestand en de gereflecteerde fase met behulp van scRNAseq Om blastoïden op te pakken en dissociatie uit te voeren, warmt u de schudincubator op tot 37 °C en stelt u deze in op 100 tpm. Verzamel blastoïden van de eerste 96-well plaat en breng ze over naar meerdere putten van een U-bottom 96-well plaat met behulp van een mondpipet uitgerust met een glazen capillair.OPMERKING: Blastoïden (> 70%) moeten worden geselecteerd op basis van de morfometrische criteria (grootte = 150-250 μm met een unieke binnencluster) om besmetting met niet-blastoïde structuren (< 30%) te voorkomen. Was eenmaal met 200 μL PBS met behulp van een P200 door onder een stereomicroscoop te kijken. Breng over in een put met 50 μL collagenase en incubeer gedurende 30 minuten in de schudincubator. Breng de blastoïden over in een put met 100 μL 10x trypsine-EDTA en meng goed. Incubeer gedurende 20 minuten in de schudincubator. Dissociëer de blastoïden in een enkele cel met behulp van P200 pipet. Breng de cellen over in een buis van 15 ml met FACS-buffer (1% FBS in PBS). Om specifieke verhoudingen van de analogen van de drie afstammingslijnen vast te leggen, kleurt u de TE- en PrE-analogen met respectievelijk TROP2- en PDGFRa-antilichamen.OPMERKING: Het aantal PrE-cellen in menselijke blastocysten is minder in vergelijking met blastocysten bij muizen, wat ontwikkelingsdefecten van blastocysten kan weerspiegelen die zijn gevormd door in-vitrofertilisatie (IVF) of een soortverschil. In blastoïden zijn de PrE-analogen minder overvloedig dan de TE- en EPI-analogen en vertegenwoordigen ze 7,4% van de cellen bij het tellen van GATA4+ cellen door immunofluorescentiebeeldvorming. Ook kan het dissociatieproces vooroordelen veroorzaken in de verhoudingen van de verschillende celtypen als PrE-analogen om 1% -2% van de cellen te vertegenwoordigen bij blastoïde dissociatie, PDGFRa-tagging en FACS-analyse. FACS-sorteert cellen van alle drie de afstammingsanalogen in 384-platen met een lysisbuffer voor smart-seq2-analyse. Sluit dode cellen uit die zijn gemarkeerd door DAPI-kleuring (uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant). Om de celtoestanden (celtype en ontwikkelingsstadium) te evalueren, vergelijkt u de transcriptomische gegevens van blastoid met de juiste controles. 6. Uitgebreide kweek om de progressie van blastoïdeontwikkeling te beoordelen Kweek menselijke blastoïden op keldermembraanmatrix-gecoate platen (glazen bodem). Bekleed de plaat met keldermembraanmatrix. Inspecteer de blastoïden visueel om de morfologie te beoordelen en vast te leggen.OPMERKING: Alleen blastoïden die de klassieke holle-bal blastocystmorfologie vertonen met compacte ICM hebben het potentieel om verder te groeien en zich te ontwikkelen. Voeg 100 μL CMRL medium-1 toe per put van de 96-well plaat en plaats de plaat ten minste 2 uur voordat blastoids worden overgebracht in de incubator voor evenwicht. Identificeer met behulp van een stereomicroscoop visueel de blastoïden met een goede morfologie, breng de geselecteerde blastoïden over in een put van 96-putplaat met 100 μl CMRL-medium-1 om de sporen van blastoïde media te verwijderen. Breng de blastoïden over in de put met voorgebalanceerde CMRL-media-1. Plaats de plaat in de couveuse en incubeer een nacht op 37°C.OPMERKING: Tot 5 blastoïden kunnen worden gekweekt in één put van 96 putplaten. Het hebben van te veel blastoïden in een enkele put kan leiden tot de vorming van aggregaten van meerdere blastoïden. Inspecteer de volgende dag de blastoïden visueel onder een microscoop. Als de blastoïden zijn bevestigd, voeg dan 100 μL voorgebalanceerde CMRL media-1 toe, aangevuld met 5% keldermembraanmatrix. Plaats de plaat in de couveuse en incubeer een nacht bij 37 °C. Controleer de volgende dag de blastoïden onder een microscoop. Verwijder de helft van de media (100 μL) en vervang deze door 100 μL voorgebalanceerde CMRL media-2 aangevuld met 5% keldermembraanmatrix. Vervang de volgende dagen de helft van de media (100 μL) door voorgebalanceerde CMRL media-3 aangevuld met 5% keldermembraanmatrix. Plaats de plaat in de couveuse en incubeer een nacht bij 37 °C. Herhaal elke dag gedurende maximaal 4-6 dagen in vitro kweek.OPMERKING: We hebben blastoïden gedurende maximaal 6 dagen gekweekt in uitgebreide kweekomstandigheden die overeenkomen met het tijdsequivalent van dag 13 van in vitro gekweekte menselijke embryo’s. 7. Immunostaining blastoïden Adem het medium op. Was monsters 3x met PBS gedurende 5 min. Voeg 200 μL koude 4% paraformaldehyde (PFA) toe aan PBS en fixeer de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de PFA-oplossing en was monsters 3x met PBS gedurende 10 minuten.OPMERKING: Als blastoïden werden gekweekt op microwell-chips, breng de blastoïden dan over van de chip naar 96-well U-bottom platen voor de volgende stappen. Permeabiliseer en blokkeer de blastoïden in 100 μL blokkerende oplossing per put (PBS met 0,3% Triton-X 100 en 10% normaal ezelserum) gedurende 60 minuten.OPMERKING: Afhankelijk van de gastheersoort van de antilichamen, past u het serum dienovereenkomstig aan. Verwijder de blokkeringsoplossing. Voeg 100 μL primaire antilichamen verdund in verse blokkerende oplossing toe en incubeer monsters ‘s nachts bij 4°C.OPMERKING: De concentraties van primaire antilichamen moeten worden bepaald op basis van de instructies van de fabrikant. Was monsters 3x met 0,1% Triton-X 100 in PBS (wasoplossing) gedurende 10 min. Voeg 100 μL secundaire antilichamen toe in blokkerende oplossing samen met 20 μg/ml Hoechst kernvlek en incubeer monsters gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Bescherm monsters tegen licht.OPMERKING: De concentraties van secundaire antilichamen moeten worden bepaald op basis van de instructies van de fabrikant. Was monsters 3x met wasoplossing gedurende 10 min. Breng voor beeldvorming de monsters over op de glazen bodem μ-slide in PBS.OPMERKING: Het montagemedium moet worden geselecteerd op basis van het doel dat voor de beeldvorming wordt gebruikt. 80% glycerol in PBS is bijvoorbeeld mogelijk om te gebruiken voor het monteren van de monsters tijdens het gebruik van oliedoelstellingen.

Representative Results

Typisch, naïeve hPSC’s gekweekt in PXGL (figuur 2A) zijn geaggregeerde en cavitated structuren die ontstaan tussen 48 en 72 uur na PALLY-inductie en een diameter van 150-250 μm bereiken binnen 96 h (figuur 2B). Met behulp van optimale (1) zaaicelnummers, (2) duur van prekweekaggregatie met N2B27 (0 tot 24 uur), (3) concentratie van individuele chemische componenten (vooral LPA) en (4) duur van PALLY-behandeling, bereikt de inductie-efficiëntie 70% -80% zoals gedefinieerd op basis van morfometrische parameters (totale grootte van 150-250 μm, enkele regelmatige holte, enkele binnenste celcluster; Figuur 2C,D) en de aanwezigheid van de drie afstammingslijnen. Een suboptimale initiële celtoestand en/of inductiecondities zal resulteren in minder efficiënte of geen blastoïdevorming. Om maximale efficiëntie te garanderen en alleen pre-implantatie-analogen te vormen, is het cruciaal om een hoogwaardige cultuur van naïeve PXGL hPSC’s te gebruiken. Dit kan worden beoordeeld door FACS het percentage cellen te meten dat positief is voor de oppervlaktemarkers SUSD2 (naïeve toestand) en CD24 (geprimeerde toestand). Extra oppervlaktemarkers die specifiek zijn voor de off-target extra-embryonale afstammingslijnen (bijv. Amnion, extraembryonic mesoderm) zouden ook nuttig zijn, maar zijn, voor zover we weten, momenteel niet beschikbaar. Als de verkregen formatie-efficiëntie lager is dan de gerapporteerde resultaten, is het belangrijk om alle componenten van het blastoïde medium zorgvuldig te controleren, met name LPA die is gereconstitueerd in PBS en dat, als GPCR-ligand, onstabieler kan zijn in vergelijking met synthetische moleculen gereconstitueerd in DMSO. In de meeste gevallen, zelfs als de opbrengst niet maximaal is, zijn de cavitated structuren nog steeds samengesteld uit de drie blastocystlijnen. De opkomst van drie blastocystlijnen en de vorming van embryonaal-abembryonische as kan worden bevestigd door de immunofluorescentiekleuring van markers (EPI: NANOG, OCT4, TE: GATA3, Polar-TE NR2F2, Mural-TE: CDX2, PrE: GATA4; Figuur 2E,G). Trofosfen, die alleen uit TE bestaan, helpen de rol van intercellulaire communicatie verder te ontleden. Trofosfen kunnen zich vormen met een efficiëntie van 50%-60% binnen 96 uur na inductie (figuur 2H,I). Blastoïdevorming kan niet alleen worden uitgevoerd in zelfgemaakte microwell-arrays, maar ook in in de handel verkrijgbare ultralage bevestiging 96 putplaten met optimalisatie van inductiecondities (zie Protocol en figuur 2J). Blastoïden hebben ook de capaciteit om zich nog eens 6 dagen verder te ontwikkelen, wat tijdequivalent is van het embryo van dag 13, met in vitro differentiatieprotocol (figuur 2K). Om de celtoestand van blastoïde cellen verder te karakteriseren, moet eencellige RNA-sequencingtechnologie worden gebruikt. UMAP wordt vaak toegepast om een verdeling van celtoestanden te visualiseren en er wordt een clusteringanalyse zonder toezicht op uitgevoerd om de nabijheid van individuele celtoestanden te evalueren. Verschillende parameters in de eencellige data-analyse kunnen van invloed zijn op de manier waarop cellen worden weergegeven in de AUMAPs, wat leidt tot clusters met verschillende ruimtelijke en relatieve posities en vormen (figuur 3A). In deze analyse vertonen cellen echter duidelijk reproduceerbaar verschillende clusteringprofielen, ongeacht de parameters die worden gebruikt om de clustering en de visualisatie van de gegevens uit te voeren, waardoor de drie blastocyst-afstammingslijnen met hoge betrouwbaarheid kunnen worden onderscheiden. We gebruikten cellen van embryo’s die in verschillende ontwikkelingsstadia waren geoogst als referentie. De samenvoeging van deze datasets toont aan dat de meerderheid van het trophectoderm analoog van blastoïde geclusterd is met pre-implantatie trophectoderm, maar niet met post-implantatie trofoblasten (figuur 3B). Deze resultaten werden ook bevestigd door een onafhankelijk consortium10. Wanneer Carnegie stadium 7 (CS7) gastrulatende embryo’s in de referentiekaart worden geïntroduceerd, clustert een kleine populatie blastoïde cellen (3%) zich met de mesoderm- en amnion-afstammingslijnen van deze embryo’s (figuur 3C). Wanneer amnion-achtige cellen in de referentiekaart worden geïntroduceerd, clustert een kleine populatie blastoïde cellen (< 2%) met dergelijke amnion-achtige cellen. Over het algemeen worden alleen de structuren bestaande uit een enkele regelmatige holte, een enkele binnenste celcluster, een totale grootte variërend van 150-250 μm, bestaande uit transcriptomische analogen van de drie blastocystlijnen, en grotendeels verstoken van andere afstammingslijnen (bijv. Amnion, mesoderm, extraembryonische mesoderm) beschouwd als menselijke blastoïden. Figuur 1: Vier functies en twee benaderingen voor het genereren van high-fidelity blastoïden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Blastoid en trofosfen afgeleid van aggregaten van Naïeve hPSC. (A) Fasecontrastbeelden met naïeve hPSC’s gekweekt in PXGL-medium in co-gekweekt met bestraalde MEF. Schaalbalk: 50 μm. (B) Fasecontrastbeelden die de morfologische verandering laten zien van naïeve hPSC-aggregaten gekweekt op een niet-adherente hydrogel microwell array met 500 nM LPA (PALLY medium). Schaalbalk: 200 μm. (C) Menselijke blastoïden gevormd op een microwell array na 96 h. Schaalstaven: 400 μm. (D) Kwantificering van het percentage microwells dat een menselijke blastoïde bevat, geïnduceerd door PALLY-cultuurconditie met geoptimaliseerde LPA-concentratie van verschillende naïeve hPSC-lijnen (n = 3 microwell-arrays). (E) immunofluorescentiekleuring van menselijke blastoïden met epiblastmarkers (EPI) (geel) NANOG en OCT4; de TE-markers (cyaan) CDX2 en GATA3; en de primitieve endoderm marker (magenta) SOX17 en GATA4. Schaalbalk: 100 μm. (H-I) Kwantificering van het celnummer (links) en het percentage cellen (rechts) dat tot elke afstamming behoort in blastoïde (96 h) op basis van immunofluorescentiekleuring van OCT4, GATA3 en GATA4. (G) Immunofluorescentiekleuring van menselijke blastoïden voor CDX2 (cyaan) en NR2F2 (magenta). (F) Fasecontrastbeelden van trofosfen in een vroeg en laat stadium op microwell array geïnduceerd door toevoeging van respectievelijk 3 μM SC144 (H) of 2 μM XMU-MP-1 (I). (J) Fasecontrastbeelden die de morfologische verandering laten zien van naïeve hPSCs-aggregaten gekweekt in ultralage aanhechting 96-putplaat met 500 nM LPA (PALLY-medium). (K) Fasecontrastbeeld (links) en immunofluorescentiekleuring (rechts) voor OCT4 (geel), GATA3 (cyaan) en GATA4 (magenta) in blastoïde gekweekt in postimplantatiecultuurconditie gedurende 6 dagen. Schaalbalk: 100 μm. Dit cijfer is aangepast van 6,10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Karakterisering van de samenstelling van blastoïden door single cell sequencing. (A) Unsupervised clustering analyse met verschillende parameters op UMAP van het transcriptoom van afzonderlijke cellen afgeleid van de verschillende tijdspunten van blastoïde (24 h, 60 h, 96 h), naïeve hPSC’s, geprimeerde hPSC’s en hTSC (vertegenwoordigen de post-implantatie cytotrophoblast). (B) UMAP van het transcriptoom van cellen afgeleid van blastoïde (96 h), naïeve hPSC’s en geprimeerde hPSC’s geïntegreerd met gepubliceerde datasets van menselijke embryo’s van pre-implantatie, peri-implantatie (in vitro gekweekte blastocysten) en gastrulatie (Carnegie stadium 7, d.w.z. tussen E16-19) stadia. Individuele cellen worden gekleurd op basis van hun oorsprong in menselijke embryo’s (links), blastoïde-afgeleide cellen of stamcellen (midden) en het resultaat van onbewaakte clusteringanalyse (rechts). (C) AAP’s van het transcriptoom van cellen afgeleid van blastoïden, naïeve hPSC’s, geprimeerde hPSC’s en geïntegreerd met gepubliceerde dataset van gastrulatie (Carnegie stadium 7, d.w.z. tussen E16-19) stadium embryo. Individuele cellen worden gekleurd op basis van hun oorsprong in menselijke embryo’s (links), blastoïde-afgeleide cellen of stamcellen (midden) en het resultaat van onbewaakte clusteringanalyse (rechts). Dit cijfer is aangepast van6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullende tabel 1: Alle mediasamenstelling die in dit onderzoek is gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

In deze studie laten we stap voor stap zien hoe menselijke blastoïden met een hoge efficiëntie kunnen worden vastgesteld met behulp van een eenvoudig en robuust protocol. Na aggregatie van naïeve PXGL hPSC’s en hun drievoudige remming vormen blastoïden zich efficiënt (> 70%) en genereren ze achtereenvolgens de 3 blastocyst-analogen binnen 4 dagen. Beperkingen in de efficiëntie en kwaliteit van de blastoïden (bijv. Aanwezigheid van off-target cellen) kunnen optreden als de begintoestand suboptimaal is. Van belang is dat we hebben gemeten dat PXGL hPSCs ongeveer 5% cellen bevat die de post-implantatiestadia weerspiegelen. Deze cellen kunnen de vorming van hoogwaardige blastoïden beperken. Naast de initiële naïeve PXGL-toestand die de blastocyst-epiblast weerspiegelt, is een andere cruciale factor het medium dat wordt gebruikt voor blastoïdevorming. Om snel blastocystachtige cellen te vormen en de vorming van off-target, post-implantatie-achtige cellen te voorkomen, stellen we voor dat remming van drievoudige routes (Hippo, ERK, TGF-β) essentieel is. Hoewel verschillende cellijnen verschillende opbrengsten van blastoïde geven op ERK / TGF-β remming (over het algemeen ongeveer 10% -20%), resulteert blootstelling aan LPA in de vorming van een even hoge blastoïdeopbrengst over alle cellijnen, terwijl strikte morfometrische en afstammingsspecificatiecriteria worden gebruikt. LPA werkt mogelijk in op de remming van de Hippo-route, die een cruciale rol speelt in de eerste afstammingssegregatie tussen epiblast- en trophectoderm-afstammingslijnen bij muizen en mensen 8,51. De significante verbetering van de blastoïde-efficiëntie door LPA suggereert dat de Hippo pathway-gemedieerde binnen-buitenste celspecificatiemechanismen die in de blastocyst spelen, worden gecoöpteerd tijdens blastoïdevorming. Een huidige beperking ligt in het feit dat we, vanwege een suboptimaliteit van de protocollen die worden gebruikt om menselijke blastocyst of blastoïden te kweken op tijdequivalente dag 7-13 (na blastocyst / blastoïdevorming), niet in staat zijn om te beoordelen in hoeverre we de ontwikkeling na implantatie goed kunnen modelleren.

Het analyseren van de transcriptomische toestand van de blastoïde cellen kan eenvoudig worden bereikt met behulp van scRNAseq, adequate referentiekaarten en bioinformatische methoden. Eerder toonde de transcriptomische analyse aan dat hPSC’s gekweekt in PXGL meer lijken op de blastocyst-epiblast in vergelijking met de geprimeerde toestand. Beperkingen in de analyse van de gegevens kunnen optreden als de referentiekaart alleen blastocyst-stadiumcellen bevat. De referentiekaart moet cellen bevatten die afkomstig zijn van embryo’s na implantatie om de aanwezigheid van potentiële off-target cellen te beoordelen. In de toekomst, om blastoïde cellen te benchmarken, zou een referentiekaart met alle weefsels van de pre- en post-implantatie menselijke conceptus uiterst waardevol zijn. Bovendien zouden multi-omics single cell reference maps, bijvoorbeeld inclusief transcriptoom, chromatinetoegankelijkheid en DNA-methylatie, verder helpen. Ten slotte zouden gestandaardiseerde bio-informaticamethoden om de overeenkomsten tussen cellen uit embryomodellen en referentieconcepti kwantitatief te beoordelen en om off-target cellen positief te identificeren, verder helpen om onbevooroordeeld resultaten te analyseren en te vergelijken.

Al met al bezitten blastoïden gevormd door drievoudige remming van Hippo-, TGF-β- en ERK-routes de vier kenmerken van 1) zeer efficiënte morfogenese, 2) correcte volgorde van afstammingsspecificatie, 3) hoge zuiverheid van blastocystachtige cellen op transcriptoomniveau, 4) capaciteit om peri-implantatieontwikkeling te modelleren. Deze kenmerken van blastoïden zullen het opbouwen van hypothesen over de ontwikkeling en implantatie van blastocysten vergemakkelijken, maar ze vatten geen eerdere stadia van embryonale ontwikkeling samen. In tegenstelling tot de beperkte toegankelijkheid en veelzijdigheid van menselijke blastocyst, zijn blastoïden vatbaar voor genetische en medicijnscreenings voor het functionele onderzoek naar de ontwikkeling en implantatie van blastocysten. In de toekomst kan dergelijke basiskennis bijdragen aan het verbeteren van de ivf-mediaformulering, het ontwikkelen van anticonceptiva na de bevruchting en het beter beheren van de vroege zwangerschap.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit project heeft financiering ontvangen van de European Research Council (ERC) in het kader van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie (ERC-Co-subsidieovereenkomst nr. 101002317 ‘BLASTOID: een ontdekkingsplatform voor vroege menselijke embryogenese’). H.H.K. wordt ondersteund door het Austrian Science Fund (FWF), Lise Meitner Programme M3131-B. We bedanken Yasuhiro Takashima voor het delen van de H9- en H9-GFP-cellijnen en Austin Smith, Peter Andrews en Ge Guo voor het delen van de HNES1-, Shef6-, niPSC 16.2b- en cR-NCRM2-cellijnen. We bedanken Hossein Baharvand voor het delen van de endometriumorganoïden. We bedanken Joshua M. Brickman voor het delen van het RNA geïsoleerd uit PrE-gedifferentieerde cellen en nEND-cellen. We bedanken Shankar Srinivas voor het delen van de eencellige RNA-sequencinggegevens van het peri-gastrulatie-embryo. We bedanken Aleksand Bykov en Luisa Cochella voor technische assistentie bij de voorbereiding van de SMARTSeq2-bibliotheek. We bedanken de NGS-, Biooptische en Stamcelfaciliteit bij IMBA voor kritieke hulp.

Materials

Neurobasal media in house
DMEM/F12 in house
100X N2 supplemen Gibco 17502048
50X B27 supplement Gibco 17504044
100X Glutamax Gibco 35050038
100 mM Sodium Pyruvate Gibco 11360039
MEM-Non-essential amino acids Gibco 11140050
1 M Hepes in house
50 mM 2-Mercaptoethanol Thermofisher 31350010
100X Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P0781
Bovine Serum Albumin solution Sigma-Aldrich A7979
PD0325901 Medchem express HY-10254
XAV-939 Medchem express HY-15147
Gö 6983 Medchem express HY-13689
Human recombinant Leukemia Inhibitory Factor in house
A83-01 Medchem express HY-10432
1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) Peprotech 2256236
Y-27632 Medchem express HY-10583
CMRL medium Gibco 21530027
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermofisher 10-828-028
Accutase Biozym B423201 cell detachment solution
Geltrex Thermofisher A1413302 growth factor basement membrane extract
TROP2 antibody R&D systems MAB650
PDGFRα antibody R&D systems AF307
SC-144 Axon 2324
XMU-MP-1 Med Chem Express HY-100526
Matrigel basement membrane matrix
Countess cell counting chamber slides Thermo fisher cell counting slides
DAPI Staining Solution Miltenyi Biotec 130-111-570
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Rivron, N., et al. Debate ethics of embryo models from stem cells. Nature. 564 (7735), 183-185 (2018).
  2. Hyun, I., Munsie, M., Pera, M. F., Rivron, N. C., Rossant, J. Toward Guidelines for Research on Human Embryo Models Formed from Stem Cells. Stem Cell Reports. 14 (2), 169-174 (2020).
  3. Clark, A. T., et al. Human embryo research, stem cell-derived embryo models and in vitro gametogenesis: Considerations leading to the revised ISSCR guidelines. Stem Cell Reports. 16 (6), 1416-1424 (2021).
  4. Lovell-Badge, R., et al. ISSCR Guidelines for Stem Cell Research and Clinical Translation: The 2021 update. Stem Cell Reports. 16 (6), 1398-1408 (2021).
  5. Rivron, N. C., et al. Blastocyst-like structures generated solely from stem cells. Nature. 557 (7703), 106-111 (2018).
  6. Kagawa, H., et al. Human blastoids model blastocyst development and implantation. Nature. , 04267-04268 (2021).
  7. Meistermann, D., et al. Integrated pseudotime analysis of human pre-implantation embryo single-cell transcriptomes reveals the dynamics of lineage specification. Cell Stem Cell. 28 (9), 1625-1640 (2021).
  8. Gerri, C., et al. Initiation of a conserved trophectoderm program in human, cow and mouse embryos. Nature. 587 (7834), 443-447 (2020).
  9. Gerri, C., Menchero, S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. A., Niakan, K. K. Human Embryogenesis: A Comparative Perspective. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 411-440 (2020).
  10. Zhao, C., et al. Reprogrammed iBlastoids contain amnion-like cells but not trophectoderm. bioRxiv. , 2021.05.07.442980 (2021).
  11. Zijlmans, D. W. Integrated multi-omics reveal polycomb repressive complex 2 restricts human trophoblast induction. Nat. Cell Biol. 24, 858-871 (2022).
  12. Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).
  13. Guo, G., et al. Epigenetic resetting of human pluripotency. Development. 144 (15), 2748-2763 (2017).
  14. Takashima, Y., et al. Resetting transcription factor control circuitry toward ground-state pluripotency in human. Cell. 158 (6), 1254-1269 (2014).
  15. Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  16. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  17. Stirparo, G. G., et al. Integrated analysis of single-cell embryo data yields a unified transcriptome signature for the human pre-implantation epiblast. Development. 145 (3), 158501 (2018).
  18. Castel, G., et al. Induction of Human Trophoblast Stem Cells from Somatic Cells and Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 33 (8), 108419 (2020).
  19. Posfai, E., et al. Evaluating totipotency using criteria of increasing stringency. Nature Cell Biology. 23 (1), 49-60 (2021).
  20. Nakamura, T., et al. A developmental coordinate of pluripotency among mice, monkeys and humans. Nature. 537 (7618), 57-62 (2016).
  21. Theunissen, T. W., et al. Molecular Criteria for Defining the Naive Human Pluripotent State. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
  22. Guo, G., et al. Naive Pluripotent Stem Cells Derived Directly from Isolated Cells of the Human Inner Cell Mass. Stem Cell Reports. 6 (4), 437-446 (2016).
  23. Rossant, J. Genetic Control of Early Cell Lineages in the Mammalian Embryo. Annual Review of Genetics. 52, 185-201 (2018).
  24. De Paepe, C., et al. Human trophectoderm cells are not yet committed. Human reproduction. 28 (3), 740-749 (2013).
  25. Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 1212-1221 (2013).
  26. Io, S., et al. Capturing human trophoblast development with naive pluripotent stem cells in vitro. Cell Stem Cell. 28 (6), 1023-1039 (2021).
  27. Guo, G., et al. Human naive epiblast cells possess unrestricted lineage potential. Cell Stem Cell. 28 (6), 1040-1056 (2021).
  28. Liu, X., et al. Modelling human blastocysts by reprogramming fibroblasts into iBlastoids. Nature. 591 (7851), 627-632 (2021).
  29. Hirate, Y., et al. Polarity-dependent distribution of angiomotin localizes Hippo signaling in preimplantation embryos. Current biology: CB. 23 (13), 1181-1194 (2013).
  30. Cockburn, K., Biechele, S., Garner, J., Rossant, J. The Hippo pathway member Nf2 is required for inner cell mass specification. Current Biology: CB. 23 (13), 1195-1201 (2013).
  31. Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature Biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
  32. Krendl, C., et al. GATA2/3-TFAP2A/C transcription factor network couples human pluripotent stem cell differentiation to trophectoderm with repression of pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9579-9588 (2017).
  33. Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
  34. Horii, M., Bui, T., Touma, O., Cho, H. Y., Parast, M. M. An Improved Two-Step Protocol for Trophoblast Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 96 (2019).
  35. Okae, H., et al. Derivation of Human Trophoblast Stem Cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63 (2018).
  36. Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
  37. Kuijk, E. W., et al. The roles of FGF and MAP kinase signaling in the segregation of the epiblast and hypoblast cell lineages in bovine and human embryos. Development. 139 (5), 871-882 (2012).
  38. Roode, M., et al. Human hypoblast formation is not dependent on FGF signalling. Biologia dello sviluppo. 361 (2), 358-363 (2012).
  39. Linneberg-Agerholm, M., et al. Naïve human pluripotent stem cells respond to Wnt, Nodal and LIF signalling to produce expandable naïve extra-embryonic endoderm. Development. 146 (24), (2019).
  40. Yu, L., et al. Blastocyst-like structures generated from human pluripotent stem cells. Nature. 591 (7851), 620-626 (2021).
  41. Yanagida, A., et al. Naive stem cell blastocyst model captures human embryo lineage segregation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1016-1022 (2021).
  42. Zappia, L., Oshlack, A. Clustering trees: a visualization for evaluating clusterings at multiple resolutions. GigaScience. 7 (7), (2018).
  43. Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
  44. Messmer, T., et al. Transcriptional Heterogeneity in Naive and Primed Human Pluripotent Stem Cells at Single-Cell Resolution. Cell Reports. 26 (4), 815-824 (2019).
  45. Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
  46. Petropoulos, S., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Lineage and X Chromosome Dynamics in Human Preimplantation Embryos. Cell. 167 (1), 285 (2016).
  47. Tyser, R. C. V., et al. A spatially resolved single cell atlas of human gastrulation. bioRxiv. , (2020).
  48. Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  49. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  50. Ma, H., et al. In vitro culture of cynomolgus monkey embryos beyond early gastrulation. Science. 366 (6467), (2019).
  51. Nishioka, N., et al. The Hippo signaling pathway components Lats and Yap pattern Tead4 activity to distinguish mouse trophectoderm from inner cell mass. Developmental Cell. 16 (3), 398-410 (2009).

Tags

Human BlastoidsBlastocyst DevelopmentImplantationIn Vitro FertilizationPre-clinical ModelingTherapeutic TargetsNon-hormonal ContraceptivesMEF ExclusionPXGL MediaN2B27 Basal MediaAggregation MediaCell DetachmentMicroWells

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Kagawa, H., Javali, A., Heidari Khoei, H., Sommer, T. M., Sestini, G., Novatchkova, M., Scholte op Reimer, Y., Rivron, N. Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation. J. Vis. Exp. (186), e63388, doi:10.3791/63388 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image