מיצוי וטיהור של חלבון FAHD1 מכבד כליות ועכבר חזירים
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לחלץ את החלבון 1 המכיל הידרולאז 1 (FAHD1) מכליות החזירים ומכבד העכברים. השיטות המפורטות עשויות להיות מותאמות לחלבונים אחרים בעלי עניין ולשנות אותן עבור רקמות אחרות.
Abstract
פומארילאצטואצטט הידרולאז המכיל חלבון 1 (FAHD1) הוא החבר המזוהה הראשון במשפחת העל FAH באאוקריוטים, הפועל כאוקסלואצטט דקרבוקסילאז במיטוכונדריה. מאמר זה מציג סדרה של שיטות למיצוי וטיהור של FAHD1 מכליות חזירים וכבד עכברים. השיטות המכוסות הן כרומטוגרפיית חילופי יונית עם כרומטוגרפיה נוזלית של חלבונים מהירים (FPLC), סינון ג’ל הכנה ואנליטי עם FPLC, וגישות פרוטאומיות. לאחר מיצוי החלבון הכולל, נחקרו משקעי אמוניום סולפט וכרומטוגרפיית חילופים יונית, ו-FAHD1 הופק באמצעות אסטרטגיה רציפה באמצעות חילופי יונים וכרומטוגרפיית אי הכללת גודל. גישה מייצגת זו עשויה להיות מותאמת לחלבונים אחרים בעלי עניין (המתבטאים ברמות משמעותיות) ומשתנה עבור רקמות אחרות. חלבון מטוהר מרקמה עשוי לתמוך בפיתוח נוגדנים איכותיים, ו/או מעכבים פרמקולוגיים חזקים וספציפיים.
Introduction
החלבון האאוקריוטי המכיל את תחום FAH 1 (FAHD1) פועל כאוקסלואצטט דו-תפקודי (OAA) דקרבוקסילאז (ODx)1 ואצילפירובט הידרולאז (ApH)2. הוא מקומי במיטוכונדריה2 ושייך למשפחת העל הרחבה FAH של אנזימים 1,2,3,4,5,6. בעוד שפעילות ה-ApH שלה רלוונטית רק באופן מינורי, פעילות ה-ODx של FAHD1 מעורבת בוויסות של שטף מחזור TCA 1,7,8,9. OAA נדרש לא רק לתגובת הסינתאז המרכזית של ציטראט ציטראט במחזור החומצה הטריקרבוקסילית, אלא גם פועל כמעכב תחרותי של סוקסינט דהידרוגנאז כחלק ממערכת הובלת האלקטרונים וכמטבוליט קטפלרוטי. הפחתה של ביטוי הגנים FAHD1 בתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVEC) הביאה לירידה משמעותית בקצב התפשטות התא10, ולעיכוב משמעותי של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדרית, הקשורה למעבר מקביל לגליקוליזה. מודל העבודה מתייחס לתפקוד לקוי של מיטוכונדריאלי הקשורלפנוטיפ דמוי 11 (MiDAS)11, שבו רמות OAA מיטוכונדריאליות מווסתות באופן הדוק על ידי פעילות FAHD1 1,8,9.
קל יותר להשיג חלבון רקומביננטי באמצעות ביטוי וטיהור מחיידקים12 ולא מרקמה. עם זאת, חלבון המתבטא בחיידקים עשוי להיות מוטה על ידי היעדר אפשרי של שינויים לאחר התרגום, או פשוט עשוי להיות בעייתי (כלומר, עקב אובדן פלסמיד, תגובות עקה חיידקיות, קשרים דיסולפידיים מעוותים/לא מעוצבים, הפרשה ללא או הפרשה לקויה, צבירת חלבונים, ביקוע פרוטאוליטי וכו ‘). עבור יישומים מסוימים, יש לקבל חלבון מליסאט תאי או מרקמה, על מנת לכלול שינויים כאלה ו/או להחריג ממצאים אפשריים. חלבון מטוהר מרקמה תומך בפיתוח נוגדנים באיכות גבוהה, ו/או מעכבים פרמקולוגיים חזקים וספציפיים עבור אנזימים נבחרים, כגון עבור FAHD113.
כתב יד זה מציג סדרה של שיטות למיצוי וטיהור של FAHD1 מכליות חזירים וכבד עכברים. השיטות המתוארות דורשות כרומטוגרפיה נוזלית מהירה של חלבון (FPLC) אך משתמשות בציוד מעבדה נפוץ. שיטות חלופיות ניתן למצוא במקומות אחרים 14,15,16,17. לאחר מיצוי חלבונים כולל, הפרוטוקול המוצע כולל שלב בדיקה, שבו נדונים תת-פרוטוקולים עבור משקעי אמוניום גופרתיים וכרומטוגרפיית חילופי יונית (איור 1). לאחר הגדרת תת-פרוטוקולים אלה, החלבון המעניין מופק באמצעות אסטרטגיה רציפה באמצעות חילופי יונית וכרומטוגרפיית אי הכללת גודל עם FPLC. בהתבסס על הנחיות אלה, הפרוטוקול הסופי עשוי להיות מותאם בנפרד לחלבונים אחרים בעלי עניין.
איור 1: האסטרטגיה הכוללת של פרוטוקול זה. מלמעלה למטה: חלבון מופק מרקמות. רקמות הומוגנטיות מוכנות, צנטריפוגות ותנוססות. עבור כל זוג של דגימות סופרנטנט ודגימות שמקורן בכדור, יש לבצע בדיקות לאיתור משקעי אמוניום סולפט וכרומטוגרפיית חילופי יונית (FPLC) כדי לחקור תנאים אופטימליים. לאחר קביעת תת-פרוטוקולים אלה, ניתן לחלץ את החלבון באמצעות הליך רציף של משקעי אמוניום סולפט, כרומטוגרפיית חילופי יונית וכרומטוגרפיה חוזרת ונשנית של הרחקת גודל (FPLC) בריכוזי pH ומלח משתנים. כל הצעדים צריכים להיות נשלטים על ידי כתם מערבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול
הקפדה על הנחיות נפוצות לטיפול בחלבונים היא חיונית, כגון עבודה על קרח ובתנאים מתונים של pH ומלח. השימוש במעכבי פרוטאזות מועיל לשיטה, בעוד שהשימוש במעכבי פרוטאזום מומלץ מאוד. הקפאה והפשרה של הדגימה עלולות תמיד לגרום למשקעי חלבון (לפחות באופן חלקי), ולכן כל א…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים מאוד על הסיוע הטכני של אייסה אוזטורק ואווה אלברטיני. עכברים ששימשו ליצירת רקמת כבד נשמרו תחת פיקוחה של אוניברסיטת דוז. ד”ר פידר יאנסן-דור (המכון לחקר ההזדקנות הביו-רפואית באוניברסיטת אינסברוק, Rennweg 10, 6020 אינסברוק, אוסטריה).
Materials
| 0.22 µm filter units | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril |
| 0.45 µm filter units | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 734-0451 | centrifugal tubes |
| 50 mL Falcon tubes | VWR | 734-0448 | centrifugal tubes |
| 96-Well UV Microplate | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates |
| Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) | BIO-RAD | #1610147 | 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels |
| ÄKTA FPLC system | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | – | using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC901024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL |
| Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC801024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL |
| Ammonium sulfate powder | MERCK | A4418 | ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0% |
| Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% | MERCK | 215589 | Catalyst for acrylamide gel polymerization. |
| Coomassie Brilliant blue R 250 | MERCK | 1125530025 | Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C) |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MERCK | D9277 | Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis. |
| Eppendof tubes 1.5 mL | VWR | 525-1042 | microcentrifugal tubes; autoclaved |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 28989334 | HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins |
| Immun-Blot PVDF Membrane | BIO-RAD | #1620177 | PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications. |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | #1703930 | Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels. |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BIO-RAD | #1658004 | 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam. |
| Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516701 | Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins. |
| Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516901 | Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins. |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo-Fischer | 23225 | A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration. |
| Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter | Branson | – | New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf |
| Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) | Agilent Dako | P0399 | The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes. |
| TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA | MERCK | T9281 | TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels. |
| Tube Roller | – | – | A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71 |
| Tube Rotator | – | – | A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123 |
| ULTRA-TURRAX; T 25 digital | IKA | 0003725000 | New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/ |
Riferimenti
- Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
- Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).
- Kang, T. -. W., et al. Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development. Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).
- Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -. J. Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies. Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).
- Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure. 7 (9), 1023-1033 (1999).
- Bateman, R. L., et al. Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).
- Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).
- Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 – a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily – A role in calcium homeostasis. Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).
- Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
- Wiley, C. D., et al. Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype. Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).
- Weiss, A. K. H., et al. Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1). Molcules. 26 (16), 5009 (2021).
- Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).
- Lee, C. H. A simple outline of methods for protein isolation and purification. Endocrinology and Metabolism. 32 (1), 18-22 (2017).
- Amer, H. E. A. Purification of proteins: Between meaning and different methods). Proteomics Technologies and Applications. , (2019).
- Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes. Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Gallagher, S. R. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).
- . Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography Available from: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf (2011)
- Sørensen, B. K., et al. Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).
- Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
- . Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography (2022)
- Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).
- Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).
