Facettenreiche massenspektrometrische Untersuchung von Neuropeptiden in Callinectes sapidus

Das Nervensystem ist komplex und benötigt ein Netzwerk von Neuronen, um Signale durch einen Organismus zu übertragen. Das Nervensystem koordiniert sensorische Informationen und biologische Reaktionen. Die komplizierten und komplizierten Wechselwirkungen, die an der Signalübertragung beteiligt sind, erfordern viele verschiedene Signalmoleküle wie Neurotransmitter, Steroide und Neuropeptide. Da Neuropeptide die vielfältigsten und stärksten Signalmoleküle sind, die eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung physiologischer Reaktionen auf Stress und andere Reize spielen, ist es von Interesse, ihre spezifische Rolle in diesen physiologischen Prozessen zu bestimmen. Die Funktion von Neuropeptiden hängt mit ihrer Aminosäurestruktur zusammen, die die Mobilität, die Rezeptorinteraktion und die Affinität^{bestimmt 1}. Techniken wie die Histochemie, die wichtig ist, weil Neuropeptide in verschiedenen Regionen des Gewebes synthetisiert, gespeichert und freigesetzt werden können, und die Elektrophysiologie wurden eingesetzt, um die Struktur und Funktion von Neuropeptiden zu untersuchen ^2,3,4, aber diese Methoden sind durch Durchsatz und Spezifität begrenzt^, um die enorme Sequenzvielfalt von Neuropeptiden aufzulösen.

Die Massenspektrometrie (MS) ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse der Neuropeptidstruktur und -häufigkeit. Dies kann durch verschiedene MS-Techniken durchgeführt werden, am häufigsten durch Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Ionisation MS (LC-ESI-MS)5 und matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation MS (MALDI-MS^)6. Durch hochgenaue Massenmessungen und MS-Fragmentierung bietet MS die Möglichkeit, Neuropeptiden aus komplexen Mischungen ohne A-priori-Kenntnisse den Status einer Aminosäuresequenz und posttranslationalen Modifikation (PTM) zuzuweisen, um ihre Funktion zu bestimmen ^7,8. Neben qualitativen Informationen ermöglicht MS die quantitative Information von Neuropeptiden durch markierungsfreie Quantifizierung (LFQ) oder markierungsbasierte Methoden wie isotopische oder isobare Markierung⁹. Zu den Hauptvorteilen von LFQ gehören die Einfachheit, die niedrigen Analysekosten und die Verringerung der Probenvorbereitungsschritte, wodurch der Probenverlust minimiert werden kann. Zu den Nachteilen von LFQ gehören jedoch erhöhte Gerätezeitkosten, da mehrere technische Replikate erforderlich sind, um quantitative Fehler aufgrund von Run-to-Run-Variabilität zu beheben. Dies führt auch zu einer verminderten Fähigkeit, kleine Variationen genau zu quantifizieren. Markierungsbasierte Methoden unterliegen weniger systematischen Variationen, da mehrere Proben mit einer Vielzahl stabiler Isotope differenziell markiert, zu einer Probe kombiniert und gleichzeitig durch Massenspektrometrie analysiert werden können. Dies erhöht auch den Durchsatz, obwohl die Synthese oder der Kauf von Isotopenmarkierungen zeitaufwändig und kostspielig sein kann. Die spektrale Komplexität der Full Scan-Massenspektren (MS1) nimmt mit zunehmendem Multiplexing ebenfalls zu, was die Anzahl der einzigartigen Neuropeptide verringert, die fragmentiert und daher identifiziert werden können. Umgekehrt erhöht die isobare Markierung die spektrale Komplexität auf MS1-Ebene nicht, obwohl sie Herausforderungen für Analyten mit geringer Häufigkeit wie Neuropeptide mit sich bringt. Da die isobare Quantifizierung auf der Ebene der Fragmentionen-Massenspektren (MS2) durchgeführt wird, können Neuropeptide mit geringer Häufigkeit möglicherweise nicht quantifiziert werden, da reichlichere Matrixkomponenten für die Fragmentierung ausgewählt werden können und die ausgewählten möglicherweise nicht hoch genug sind, um quantifiziert zu werden. Mit der Isotopenmarkierung kann die Quantifizierung an jedem identifizierten Peptid durchgeführt werden.

Zusätzlich zur Identifizierung und Quantifizierung können Lokalisierungsinformationen von MS durch MALDI-MS-Bildgebung (MALDI-MSI)¹⁰ erhalten werden. Durch Rasten eines Lasers über eine Probenoberfläche können MS-Spektren zu einem Heatmap-Bild für jeden m/z-Wert kompiliert werden. Die Kartierung der transienten Neuropeptidsignalintensität in verschiedenen Regionen über Bedingungen hinweg kann wertvolle Informationen für die Funktionsbestimmung^{liefern 11}. Die Lokalisation von Neuropeptiden ist besonders wichtig, da die Neuropeptidfunktion je nach Standort¹² unterschiedlich sein kann.

Neuropeptide kommen in vivo in geringerer Häufigkeit vor als andere Signalmoleküle wie Neurotransmitter und erfordern daher empfindliche Methoden zum Nachweis¹³. Dies kann durch die Entfernung von Matrixkomponenten mit höherer Häufigkeit, wie z.B. Lipiden^11,14, erreicht werden. Zusätzliche Überlegungen für die Analyse von Neuropeptiden müssen im Vergleich zu herkömmlichen Proteomik-Workflows angestellt werden, vor allem, weil die meisten neuropeptidomischen Analysen die enzymatische Verdauung auslassen. Dies schränkt die Softwareoptionen für die Neuropeptid-Datenanalyse ein, da die meisten mit Algorithmen erstellt wurden, die auf Proteomik-Daten und Proteinübereinstimmungen basieren, die durch Peptiddetektion informiert sind. Viele Software wie PEAKS¹⁵ eignet sich jedoch aufgrund ihrer De-novo-Sequenzierungsfunktionen besser für die Neuropeptidanalyse. Für die Analyse von Neuropeptiden müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden, angefangen von der Extraktionsmethode bis zur MS-Datenanalyse.

Die hier beschriebenen Protokolle umfassen Methoden zur Probenvorbereitung und Dimethylisotopenmarkierung, Datenerfassung und Datenanalyse von Neuropeptiden durch LC-ESI-MS, MALDI-MS und MALDI-MSI. Durch repräsentative Ergebnisse aus mehreren Experimenten wird der Nutzen und die Fähigkeit dieser Methoden zur Identifizierung, Quantifizierung und Lokalisierung von Neuropeptiden aus blauen Krabben, Callinectes sapidus, demonstriert. Um das Nervensystem besser zu verstehen, werden häufig Modellsysteme verwendet. Vielen Organismen steht kein vollständig sequenziertes Genom zur Verfügung, was eine umfassende Entdeckung von Neuropeptiden auf Peptidebene verhindert. Um diese Herausforderung zu mildern, ist ein Protokoll zur Identifizierung neuartiger Neuropeptide und zum Transkriptom-Mining zur Generierung von Datenbanken für Organismen ohne vollständige Genominformationen enthalten. Alle hier vorgestellten Protokolle können für Neuropeptidproben aus beliebigen Spezies optimiert sowie für die Analyse beliebiger endogener Peptide angewendet werden.