Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in precursori di cellule beta pancreatiche in un sistema di coltura 2D
Summary
Il presente protocollo descrive un metodo potenziato per aumentare la co-espressione dei fattori di trascrizione PDX1 e NKX6.1 nei progenitori pancreatici derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in monostrati planari. Ciò si ottiene reintegrando la matrice fresca, manipolando la densità cellulare e dissociando le cellule endodermiche.
Abstract
Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono uno strumento eccellente per studiare lo sviluppo pancreatico precoce e studiare i fattori genetici che contribuiscono al diabete. Le cellule secernenti insulina derivate da hPSC possono essere generate per la terapia cellulare e la modellizzazione della malattia, tuttavia, con efficienza e proprietà funzionali limitate. I progenitori pancreatici derivati da hPSC che sono precursori delle cellule beta e di altre cellule endocrine, quando co-esprimono i due fattori di trascrizione PDX1 e NKX6.1, specificano i progenitori delle cellule beta funzionali che secernono insulina sia in vitro che in vivo. I progenitori pancreatici derivati da hPSC sono attualmente utilizzati per la terapia cellulare nei pazienti con diabete di tipo 1 come parte di studi clinici. Tuttavia, le procedure attuali non generano un’alta percentuale di NKX6.1 e progenitori pancreatici, portando alla cogenerazione di cellule endocrine non funzionali e poche cellule sensibili al glucosio e secernenti insulina. Questo lavoro ha quindi sviluppato un protocollo avanzato per la generazione di progenitori pancreatici derivati da hPSC che massimizzano la co-espressione di PDX1 e NKX6.1 in un monostrato 2D. I fattori come la densità cellulare, la disponibilità di matrice fresca e la dissociazione delle cellule endodermiche derivate da hPSC sono modulati che hanno aumentato i livelli di PDX1 e NKX6.1 nei progenitori pancreatici generati e ridotto al minimo l’impegno ad alternare la linea epatica. Lo studio evidenzia che la manipolazione dell’ambiente fisico della cellula durante la differenziazione in vitro può influire sulla specificazione del lignaggio e sull’espressione genica. Pertanto, l’attuale protocollo ottimizzato facilita la generazione scalabile di progenitori co-espressivi PDX1 e NKX6.1 per la terapia cellulare e la modellazione della malattia.
Introduction
Il diabete è una malattia metabolica complessa che colpisce milioni di persone in tutto il mondo. L’integrazione di insulina è considerata l’unica opzione di trattamento per il diabete. I casi più avanzati sono trattati con la terapia sostitutiva delle cellule beta, ottenuta attraverso il trapianto di pancreas cadaverico intero o isole 1,2. Diverse questioni circondano la terapia dei trapianti, come la limitazione della disponibilità e della qualità del tessuto, l’invasività delle procedure di trapianto oltre alla continua necessità di immunosoppressori. Ciò richiede la necessità di scoprire opzioni nuove e alternative per la terapia sostitutiva delle cellule beta 2,3. Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono recentemente emerse come uno strumento promettente per comprendere la biologia del pancreas umano e come fonte non esaustiva e potenzialmente più personalizzata per la terapia dei trapianti 4,5,6,7. Le hPSC, comprese le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hiPSC), hanno un’elevata capacità di autorinnovamento e danno origine a qualsiasi tipo di tessuto del corpo umano. Le hESCs sono derivate dalla massa cellulare interna dell’embrione e le hiPSC sono riprogrammate da qualsiasi cellula somatica 4,8.
I protocolli di differenziazione diretta sono ottimizzati per generare cellule beta pancreatiche da hPSC che dirigono sequenzialmente le hPSC attraverso gli stadi di sviluppo pancreatici in vitro. Questi protocolli generano organoidi di isole derivati da hPSC. Mentre sono notevolmente migliorati nell’aumentare la proporzione di cellule beta pancreatiche al loro interno, l’efficienza dei protocolli è altamente variabile. Non aumenta a più di ~ 40% delle cellule NKX6.1 + / INSULIN + o C-PEPTIDE + 5,9,10,11,12,13. Tuttavia, le cellule beta generate non sono del tutto identiche alle cellule beta umane adulte in termini di profili trascrizionali e metabolici e della loro risposta al glucosio 4,5,14. Le cellule beta derivate da hPSC mancano di espressione genica di marcatori chiave delle cellule beta come PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 e KCNK3 rispetto alle isole 5 dell’uomoadulto. Inoltre, le cellule beta derivate da hPSC hanno diminuito la segnalazione del calcio in risposta al glucosio. Sono contaminati dalle cellule poliormonali co-generate che non secernono quantità appropriate di insulina in risposta all’aumento dei livelli di glucosio5. D’altra parte, i progenitori pancreatici derivati da hPSC, che sono precursori delle isole, potrebbero essere generati in modo più efficiente in vitro rispetto alle cellule beta e, una volta trapiantati in vivo, potrebbero maturare di cellule beta funzionali che secernono insulina15,16. Gli studi clinici sono attualmente focalizzati sulla dimostrazione della loro sicurezza ed efficacia dopo il trapianto in soggetti T1D.
In particolare, l’espressione dei fattori di trascrizione PDX1 (Pancreatic and Duodenal Homeobox 1) e NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) all’interno della stessa cellula progenitrice pancreatica è cruciale per l’impegno verso una linea cellulare beta5. I progenitori pancreatici che non riescono ad esprimere NKX6.1 danno origine a cellule endocrine poliormonali o cellule beta non funzionali17,18. Pertanto, un’elevata co-espressione di PDX1 e NKX6.1 nello stadio progenitore pancreatico è essenziale per generare un gran numero di cellule beta funzionali. Gli studi hanno dimostrato che un corpo embrioide o una coltura 3D migliora PDX1 e NKX6.1 nei progenitori pancreatici in cui le cellule differenzianti sono aggregate, variando tra il 40% -80% della popolazione PDX1+/NKX6.1+12,19. Tuttavia, rispetto alle colture in sospensione, le colture di differenziazione 2D sono più economiche, fattibili e convenienti per l’applicazione su più linee cellulari5. Abbiamo recentemente dimostrato che le colture di differenziazione monostrato producono più del 90% di PDX1+/NKX6.1+ co-espressione dei progenitori pancreatici derivati da hPSC20,21,22. Il metodo riportato ha conferito un’elevata capacità di replicazione ai progenitori pancreatici generati e ha impedito specifiche di destino alternativo come la linea epatica21. Pertanto, questo protocollo dimostra un metodo altamente efficiente per la differenziazione delle hPSCs in precursori delle cellule beta pancreatiche che co-esprimono PDX1 e NKX6.1. Questo metodo utilizza la tecnica di dissociazione dell’endoderma derivato da hPSC e manipolazione della densità cellulare, seguita da una segnalazione estesa di FGF e retinoidi, nonché dall’inibizione di Hedgehog per promuovere la co-espressione di PDX1 e NKX6.1 (Figura 1). Questo metodo può facilitare una generazione scalabile di precursori delle cellule beta pancreatiche derivate da hPSC per la terapia dei trapianti e la modellizzazione della malattia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo lavoro descrive un protocollo avanzato per la generazione di progenitori pancreatici da hPSC con un’elevata co-espressione di PDX1 e NKX6.1. La dissociazione e la riplaccatura dell’endoderma derivato da hPSC a metà densità sulla matrice fresca hanno portato a PDX1 e NKX6.1 più elevati nei progenitori pancreatici derivati da hPSC.
Sebbene il cocktail di fattori di crescita per ogni stadio sia molto simile a P1-ND 27, è stato dimostrato che un trattamento più esteso dello stadio 3 ch…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041).
Materials
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
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