JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

الإدارة الفعالة لتداخل الحمض النووي الريبي عن طريق الفم (RNAi) للبعوض الأنوفيلة الغامبية البالغة

Published: March 01, 2022
doi:
10.3791/63266
, , , , , ,
1Division of Parasitic Diseases and Malaria, Entomology Branch,Centers for Disease Control and Prevention, 2Department of Entomology,Cornell University, 3Centro de Estudios en Biotecnologia,Universidad del Valle de Guatemala, 4Department of Cell Biology,Johns Hopkins School of Medicine, 5Johns Hopkins Malaria Research Institute,Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology,Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health and Malaria Research Institute, 7Department of Cell Biology,Johns Hopkins School of Medicine, 8Biomedical Sciences Department,Idaho College of Osteopathic Medicine

Summary

تم تطبيق الإعطاء الفموي ل dsRNA الذي تنتجه البكتيريا ، وهي طريقة توصيل لتداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) التي تستخدم بشكل روتيني في Caenorhabditis elegans ، بنجاح هنا على البعوض البالغ. تسمح طريقتنا بإجراء دراسات قوية لعلم الوراثة العكسي ودراسات ناقلات منع انتقال العدوى دون استخدام الحقن.

Abstract

كان تداخل الحمض النووي الريبي أداة تستخدم بكثافة للتحليل الجيني العكسي لمدة عقدين. في البعوض البالغ ، تم تنفيذ الحمض النووي الريبي المزدوج (dsRNA) في المقام الأول عن طريق الحقن ، والذي يتطلب وقتا طويلا وغير مناسب للتطبيقات الميدانية. للتغلب على هذه القيود ، نقدم هنا طريقة أكثر كفاءة للتنشيط القوي للحمض النووي الريبي عن طريق التسليم الفموي ل dsRNA إلى Anopheles gambiae للبالغين. تم إنتاج dsRNAs طويلة في سلالة الإشريكية القولونية HT115 (DE3) ، وتم تقديم تعليق مركز للبكتيريا المحتوية على dsRNA المقتولة بالحرارة في 10٪ من السكروز على كرات القطن ad-libitum للبعوض البالغ. تم استبدال كرات القطن كل 2 أيام طوال مدة العلاج. أدى استخدام هذه الطريقة لاستهداف مزدوج الجنس (جين مشارك في التمايز بين الجنسين) أو رأس الشوكة (الذي يشفر عامل نسخ الغدة اللعابية) إلى انخفاض التعبير الجيني المستهدف و / أو إشارة التألق المناعي للبروتين ، كما تم قياسها بواسطة PCR الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR) أو المجهر البؤري الفلوري ، على التوالي. كما لوحظت عيوب في مورفولوجيا الغدة اللعابية. يمكن أن تكون هذه الطريقة المرنة للغاية وسهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة والفعالة من حيث الوقت لتوصيل dsRNA قابلة للتطبيق على نطاق واسع على الجينات المستهدفة المهمة لفسيولوجيا ناقلات الحشرات وما بعدها.

Introduction

تنتقل العديد من الأمراض عن طريق البعوض ، مما يجعل دراسة فسيولوجيا البعوض وعلم الوراثة مهمة مهمة. كان استخدام الحمض النووي الريبي في هذه الكائنات الحية بارزا في السنوات العشرين الماضية وسمح بالتوصيف الوظيفي للعديد من جينات البعوض1،2،3،4،5. كانت التقنية الأكثر استخداما لتوصيل dsRNA هي الحقن المجهري ، والذي له عيوب أنه يمكن أن يصيب البعوض ويتطلب وقتا وجهدا كبيرين. تم اختبار طرق التسليم عن طريق الفم ل RNAi ، ولكن بشكل رئيسي في مرحلة يرقات البعوض6،7،8،9. ولم يتم استكشاف التوصيل الفموي للحمض النووي الريبوزي المرسال عن طريق الفم في البعوض البالغ بشكل كامل ويمكن أن يكون أداة مفيدة لدراسة بيولوجيا النواقل ومكافحة النواقل.

تنتقل الملاريا عن طريق بعوض الأنوفيليس عندما تأخذ أنثى البعوضة المصابة وجبة دم من مضيف غير مصاب وتحقن اللعاب الذي يحتوي على طفيليات الملاريا10. لكي ينتقل الطفيلي في نهاية المطاف في لعاب البعوض ، يجب أن يتغلب على العديد من العقبات ، بما في ذلك التهرب من الجهاز المناعي للبعوض ، واجتياز حاجز الأمعاء الوسطى ، وغزو الغدد اللعابية11. تعد بنية الغدة اللعابية للبعوض (SG) مفتاحا لغزو الطفيليات ويتم التحكم في هذه البنية من خلال عوامل النسخ الرئيسية المعبر عنها في الغدة اللعابية وكذلك محددات إزدواج الشكل الجنسي. هناك حاجة إلى العديد من عوامل النسخ المحفوظة للغاية للمواصفات الخلوية والصيانة الاستتبابية للغدد اللعابية ولإنتاج وإفراز البروتينات اللعابية التي تعمل في تغذية الدم12،13،14. رأس الشوكة (Fkh) هو عامل نسخ حلزوني مجنح يعمل كمنظم رئيسي لبنية الحشرات SG ووظيفتها (استنادا إلى الدراسات التي أجريت على ذباب الفاكهة وعثة دودة القز)15،16،17،18،19،20. في SGs ذبابة الفاكهة ، يعمل Fkh مع Sage ، وهو عامل نسخ حلزوني حلزوني أساسي خاص ب SG (bHLH) ، لتعزيز بقاء SG وإنتاج اللعاب19. أحد المنظمين المشاركين المهمين والإيجابيين لإنتاج اللعاب في ذبابة الفاكهة هو CrebA ، وهو عامل نسخ سحاب الليوسين المدروس جيدا والذي ينظم التعبير عن جينات المسار الإفرازي21،22،23. هناك أيضا درجة قوية من التمايز المورفولوجي في الغدد اللعابية الأنثوية التي من المحتمل أن تلعب دورا رئيسيا ، ليس فقط في تغذية الدم ولكن أيضا في قدرة الطفيليات على غزو هذا النسيج24.

العديد من الجينات المشاركة في تحديد بقاء الغدة اللعابية ، والبنية ، وعلم وظائف الأعضاء ، وإزدواج الشكل الجنسي لها ملامح التعبير الزماني المكاني المعقدة25،26،27 ، وطرق التسليم التقليدية ل dsRNA لحث الحمض النووي الريبي ليست دائما فعالة في استهداف هذه الأنواع من الجينات في هذا النسيج أو غيره. ومع ذلك ، فقد تم استخدام التسليم الفموي ل dsRNA في مرحلة اليرقات الزاعجة المصرية والبعوض الغامبي بنجاح لإسكات الشكل الخاص بالإناث من جين dsx 9,28. وجدت الدراسات السابقة التي استخدمت dsRNA في الغدد اللعابية للبعوض أنه على الرغم من الحاجة إلى كميات كبيرة من dsRNA ، إلا أن تأثير إسكات الصوت كان طويل الأمد نسبيا (13 يوما على الأقل)29. هنا ، تم اختبار قدرة سلالة E. coli القاتلة بالحرارة HT115 (DE3) التي تعبر عن dsRNA الخاص بالتسلسل ل dsx أو fkh أو CrebA للحث على إسكات الحمض النووي الريبي لهذه الجينات في إناث البعوض البالغة. الإعطاء الفموي لل dsRNA الناجم عن ضربة قاضية للجين في An. gambiae ، مع تخفيضات واضحة في مستويات mRNA ومع الأنماط الظاهرية المتسقة مع فقدان وظيفة هذه الجينات. وبالتالي ، من المرجح أن يعمل هذا النهج على هدم وظيفة مجموعة متنوعة من جينات الغدة اللعابية.

Protocol

1. استنساخ dsRNA إلى متجه تعبير E. coli حدد تسلسل الجينات المستهدفة لإدخاله في متجه مناسب للتعبير عن dsRNA. استرداد قيم التعبير من Vectorbase.org باستخدام الطريقة التالية. ابحث عن جين ذي أهمية (على سبيل المثال، الجدول 1) في مربع البحث في الصفحة الرئيسية. في صفحة الجينات الناتجة، انتقل إلى الرقم 8. قسم النسخ . ابحث عن تجارب التعبير الجيني RNA-seq و microarray ذات الصلة. قم بنسخ القيم ذات الأهمية في برنامج جدول البيانات وإنشاء جدول بيانات. حدد بلازميد متاح تجاريا مع مروج T7 واحد على الأقل لاستخدامه. إذا كان البلازميد المختار يحتوي على مروج T7 واحد فقط (كما تفعل معظم البلازميدات التجارية) ، فقم بتضمين مروج T7 ثان في التمهيدي العكسي لاستخدامه لتضخيم dsDNA للجين محل الاهتمام.ملاحظة: يمكن اختيار تسلسل dsRNA للجينات المستهدفة باستخدام تطبيق الويب E-RNAi لتصميم كواشف RNAi30. يمكن تصميم إما dsRNA طويل (حوالي 400 نقطة أساس) أو dsRNA قصير الشعر (shRNA) بناء على تسلسلات جينية محددة. وينبغي تضخيم هذه التسلسلات وتسلسلها للتأكد من هويتها قبل استنساخها. يتم سرد مناطق الجينات المختارة والبلازميدات والمروجين المستخدمة في هذه الدراسة في الملف التكميلي 1. قم بإجراء الاستنساخ وفقا لإجراء بسيط من خطوة واحدة موصوف سابقا 9,31. لهذا الغرض ، قم بتنقية منتج PCR و ligate إلى الحمض النووي البلازميد الخطي. استخدم منتج الربط لتحويل الصدمة الحرارية لخلايا الإشريكية القولونية المختصة32. حدد الخلايا المحولة من خلال الفحص الأزرق/الأبيض. تأكد من اتجاه الإدراج باستخدام PCR T7-primer وتأكد من التسلسل باستخدام الاشعال M13.ملاحظة: يمكن استخدام الفحوصات البيضاء/الزرقاء عندما يحمل البلازميد المحدد للتحويل جين lacZ الذي يرمز β-galactosidase. يجب أن تحتوي المستعمرات البيضاء على الإدراج المطلوب داخل lacZ ويمكن تحديده لزيادة تأكيد وجود واتجاه التسلسل المستهدف33. تنقية البلازميد من التحول الأول واستخدامه لتحويل E. coli HT115 (DE3) المختص كما هو موضح سابقا34. بعد التأكد من أن البلازميد مع الإدراج موجود في E. coli HT115 (DE3) المختص ، قم بعمل مخزون الجلسرين من البكتيريا للاستخدام مرة واحدة.ملاحظة: يجب الحصول على DSRNA عنصر تحكم مناسب غير ذي صلة أو إعداده للاستخدام في كل تجربة. في هذه الحالة ، يتم استخدام تسلسل الجين غير ذي الصلة aintegumenta (النملة) من Arabidopsis thaliana . 2. تحضير البكتيريا القاتلة بالحرارة التي تعبر عن dsRNA تنمو مزرعة من مستعمرة بكتيرية واحدة من سلالة E. coli HT115 (DE3) التي تحتوي على dsRNA الذي يعبر عن البلازميد في 50 مل من مرق لوريا (LB) يحتوي على 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين و 12.5 ميكروغرام / مل من التتراسيكلين ، على شاكر منصة (180 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. قم بتخفيف الثقافة البكتيرية (1:1000) إلى وسيط 2x Yeast Tryptone (2x YT) يحتوي على 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين و 12.5 ميكروغرام / مل من التتراسيكلين. حث إنتاج dsRNA عن طريق إضافة 40 ميكرومتر (التركيز النهائي) الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). عندما تصل الخلايا إلى O.D.600 = 0.4 ، بعد حوالي 2 ساعة من الحث عند 37 درجة مئوية مع إثارة عند 180 دورة في الدقيقة ، قم بإعداد تعليق مركز للبكتيريا القاتلة بالحرارة كما هو موضح من قبل Taracena et al 9. قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي (4000 × جم ، 4 درجات مئوية ، 10 دقائق) واغسل الخلايا في حجم واحد من المخزن المؤقت لفوسفات الصوديوم (PBS). تدور مرة أخرى تحت نفس الظروف ، وتعيد التعليق في PBS إلى 1/100 من الحجم الأولي ، وتوضع عند 70 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. اصنع 400 ميكرولتر من البكتيريا القاتلة بالحرارة وخزن هذه الأليكوتات عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي (لا تخزن لأكثر من أسبوع). يحتوي هذا التعليق للبكتيريا القاتلة بالحرارة على dsRNA المحدد لتجارب RNAi. نفذ هذا الإجراء لكل من بكتيريا dsRNA الجينية المستهدفة وللتحكم في dsRNA غير ذي الصلة الذي سيتم استخدامه في كل تجربة. 3. تغذية البعوض بالبكتيريا القاتلة بالحرارة التي تعبر عن dsRNA تذويب أليكوت واحد من dsRNA (HT115 (DE3) تعليق البكتيريا) وتخلط مع 1.6 مل من محلول السكر 12 ٪ الذي يحتوي على 0.2 ٪ ميثيل بارابين. انقع كرة قطنية صغيرة في هذا المحلول وضع الكرة القطنية المنقوعة داخل قفص يحتوي على بعوض عمره 5 أيام. تأكد من أن البعوض يتغذى على هذا المحلول ، ويلتقط كل من السكر والبكتيريا المحتوية على dsRNA في وقت واحد. قم بتغيير كرة القطن المنقوعة في محلول سكر dsRNA كل يومين لمدة 8 أيام متتالية. احتفظ بأقفاص البعوض في ظل ظروف ثابتة ، أي 27 درجة مئوية ورطوبة نسبية 80٪ مع فترة ضوئية تبلغ 12 ساعة: 12 ساعة ضوء: دورة ضوئية مظلمة ، مفصولة بفترة فجر 30 دقيقة وفترة غسق 30 دقيقة. 4. فحص مستويات التعبير الجيني المستهدفة تخدير البعوض على البارد عن طريق وضع الحاوية على الجليد لمدة دقيقة أو حتى يتوقف البعوض عن الحركة. بمجرد تخدير البعوض ، ضعه على سطح بارد لعزل الإناث للتشريح. رش 70 ٪ من الإيثانول على البعوض ووضعها على سطح زجاجي مع PBS. باستخدام زوج من الملقط ، قم بتأمين رأس البعوض ثابتا واسحب الصدر ببطء شديد ، مما يسمح بإطلاق الغدد اللعابية في PBS. احتفظ بالغدد اللعابية في PBS البارد حتى يتم تشريح 10 أفراد. تجمع عشرة SGs لاستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة جوانيدينيوم ثيوسيانات – فينول – كلوروفورم. بيليه الحمض النووي الريبي في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. استخدم 1 ميكرولتر أليكوت من الحمض النووي الريبي المستخرج من SG في الخطوة السابقة ، لقراءة الامتصاص عند 260 و 280 نانومتر وحساب تركيز الحمض النووي الريبي لكل عينة عن طريق الضرب مع عامل التخفيف. تشير نسبة 260/280 من ~ 2.0 إلى الحمض النووي الريبي ذي النوعية الجيدة. استخدم 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المنقى لتوليف الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام مجموعة نسخ عكسي تجارية. قم بإجراء تخفيف 1:10 من cDNA لإعداد تفاعل RT-PCR وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. لكل عينة، قم بإعداد تفاعل للجين المستهدف وبالتوازي، قم بإعداد تفاعل مع جين التدبير المنزلي (HK). قم بتعيين كل تفاعل جيني في ثلاثية تقنية للقضاء على تأثير التباين العشوائي من الطريقة.ملاحظة: هنا ، تم استخدام جين An. gambiae ribosomal S7 (GeneBank: L20837.1) والأكتين (VectorBase: AGAP000651) كجينات HK. استخدم جميع الاشعال بتركيز نهائي يبلغ 300 نانومتر، وفقا لمؤشرات الشركة المصنعة ل SYBR-green. تضخيم مع ظروف PCR القياسية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، تليها 40 دورة من 15 ثانية عند 95 درجة مئوية و 60 ثانية عند 60 درجة مئوية.ملاحظة: لقياس التعبير الجيني، يتم استخدام طريقة دلتا-دلتا-سي تي (ΔΔCt). Delta Ct (ΔCt) هو الفرق بين Ct للجين المستهدف و Ct لجين التدبير المنزلي. ΔΔCt هو الفرق بين ΔCt للمجموعة التجريبية و ΔCt للمجموعة الضابطة35. 5. تقييم النمط الظاهري: تغذية الدم الناجحة لتقييم القدرة على تغذية الدم ، قم بتعيين مجموعات من 15 أنثى من البعوض المعالج بالهدف والتحكم في dsRNA على أقفاص صغيرة (قطرها 12 سم) وتجويعها لمدة 4 ساعات. باستخدام حمام مائي متداول مضبوط على 37 درجة مئوية ، توفر مغذيات البعوض الزجاجية (قطرها 24 مم) وغشاء بارافيلم ، دم أغنام محدد للبعوض.ملاحظة: يمكن الحصول على الدم من بائع تجاري يقوم بسحبه بشكل معقم من الحيوانات السليمة المانحة من أصل أمريكي ويقوم بنزع الشعر يدويا دون مضادات التخثر أو المواد المضافة. من خلال الملاحظة المباشرة ، قم بحساب وتسجيل عدد محاولات التحقيق للحصول بنجاح على وجبة دم من الإناث الخمس الأوائل لتصبح محتقنة بالكامل في كل مجموعة.ملاحظة: لتجنب التغيرات الأيضية الكبيرة في البعوض ، والتي يمكن أن تتداخل مع موارد الطاقة التي تؤثر على سلوك البحث عن الدم ، تم الحفاظ على الجوع إلى الحد الأدنى (4 ساعات). ونتيجة لذلك، لن تسعى كل بعوضة بشغف للحصول على وجبة الدم، وحددنا عدد الإناث المحتقنات إلى خمسة (ثلث إجمالي كل مجموعة)، للحد من تأثير المتغيرات الزمنية مثل التعرض للرائحة البشرية، وتغير درجة الحرارة بين الغرف وأسطح التغذية، وما إلى ذلك. 6. تقييم النمط الظاهري: مورفولوجيا الغدة اللعابية والتنظيم السفلي للبروتينات ذات الصلة عزل الأنسجة الطازجة في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) كما هو موضح في الخطوة 4.2 وتثبيته في الأسيتون البارد لمدة 90 ثانية. شطف عدة مرات في 1x PBS بعد إزالة الأسيتون. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع المصل المضاد (انظر جدول المواد) المخفف إلى 1x PBS.ملاحظة: انظر جدول المواد لتحديد الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في بروتينات اللعاب (بروتين الأنوفيليس المضاد للصفائح الدموية، AAPP; Mucin 2 ، MUC2) ، عوامل النسخ SG (رأس الشوكة ، fkh ؛ حكيم ، حكيم. بروتين ربط عنصر الاستجابة Cyclic-AMP A ، CrebA) ، وعلامة على الحويصلات الإفرازية (Rab11). تستخدم هذه الأجسام المضادة كقراءات لشكل SG ووظيفته. ومع ذلك ، يجب أن يكون أي جسم مضاد مناسب للتألق المناعي مناسبا لهذا البروتوكول. يغسل في 1x PBS عدة مرات. أضف الأجسام المضادة الثانوية (الفلورسنت) المخففة في 1x PBS ، واحتضنها في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. أضف أي بقعة مضادة [مثل 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; الحمض النووي)، وجرثومة القمح (WGA؛ للكيتين)، والفيلويدين (ل F-actin)، و / أو أحمر النيل (للدهون)] قبل 30 دقيقة من نهاية الحضانة لمدة 2 ساعة. يغسل ثلاث مرات في 1x PBS. بعد ذلك ، قم بتركيب الأنسجة في الجلسرين بنسبة 100٪ على شريحة مجهر قياسية مع غطاء بسماكة 1 مم وتخزينها عند -20 درجة مئوية حتى التصوير باستخدام المجهر البؤري الفلوري.ملاحظة: للحصول على بيانات كمية، يجب أن تظل إعدادات التصوير ثابتة. هنا ، تم تضمين صور الإسقاط القصوى للكثافة فقط من خلال حجم 3D بأكمله من الأنسجة ، وتم تطبيع جميع الصور الكمية بين العلاجات (داخل تجربة) بناء على إشارة DAPI في بقايا الأنسجة غير SG (الجسم الدهني أو البشرة أو الرأس) الموجودة أيضا على الشريحة.

Representative Results

للبدء ، تم استخدام بيانات تعبير microarray من VectorBase لمسح الأهداف المحتملة عبر مراحل النمو 36,37 لتحديد حالة التعبير لجميع الجينات ذات الصلة بالدراسة الحالية (الجدول 1). كما هو متوقع ، أظهرت جميع الجينات المستهدفة التي اخترناها تعبيرا في SGs البالغين. كانت مستويات aapp و sage مرتفعة بشكل خاص (الجدول 1). وتجدر الإشارة أيضا إلى المستويات العالية للتعبير عن f-Agdsx لدى الإناث البالغات SGs9. تم تقييم شرائح محددة من كل جين لاستخدامها كحمض نووي سلكي باستخدام تطبيق الويب E-RNAi لتصميم كواشف RNAi30. ثم تم استنساخ مناطق 400 نقطة أساس تحتوي على تسلسلات فريدة لكل جين مستهدف (الشكل 1A) ، وتحويلها إلى سلالات بكتيرية مناسبة ، واستخدامها لإعداد معلقات البكتيريا القاتلة حراريا ، والتي تم تحريضها لإنتاج dsRNA. تم تغذية البعوض البالغ لمدة 8 أيام على كرات القطن المنقوعة بالسكروز التي تحتوي على المعلقات البكتيرية ل dsRNA ل f-Agdsx أو fkh أو النمل (التحكم السلبي غير ذي الصلة). لتحليل تغذية الحمض النووي الريبي لإناث البعوض ، تم تحديد ما إذا كانت تغذية f-Agdsx أو fkh dsRNA تسبب في إسكات الجينات. لوحظ انخفاض بنسبة 98.8٪ (±2.1) في مستويات نسخ fkh في المجموعة التي تغذت على fkh-dsRNA (الشكل 1B) ، مما يشير إلى أن dsRNA قلل بشكل فعال للغاية من وفرة نسخ fkh في SGs. والمثير للدهشة أن مستويات fkh mRNA انخفضت بنسبة 82.0٪ (±18.9) في البعوض المعالج ب dsRNA ل f-Agdsx ، الذي كان لديه 89.86٪ (±4.48) من تخفيض f-Agdsx ، مما يشير إلى أن FKH يمكن أن يكون هدفا ل F-Dsx في الغدة اللعابية. بالتزامن مع الانخفاض الكبير في مستويات التعبير عن FKH ، أظهر البعوض الضربة القاضية fkh زيادة كبيرة في عدد محاولات التحقيق اللازمة لتغذية الدم. أظهر هذا البعوض ، في المتوسط ، محاولات تغذية أكثر بخمس مرات من المجموعة الضابطة أو البعوض الذي يتغذى على f-Agdsx dsRNA ليتم احتقانه بالكامل بالدم (الشكل 1C). أدى ذلك إلى التساؤل عما إذا كانت علاجات الحمض النووي الريبي الضربة القاضية fkh تسببت في تغييرات في توطين و / أو توزيع منظمات النسخ الرئيسية (SG TFs Sage و CrebA) (الشكل 2) ، والبروتينات المفرزة (AAPP و mucin) (الشكل 3) ، والآلات الإفرازية [أحمر النيل (الدهون) و Rab11 (الحويصلات الإفرازية)] (الشكل 4). الأهم من ذلك ، لوحظت اختلافات كبيرة في شدة التلطيخ عبر مناطق الفص المختلفة ، والفصوص ، و SGs الفردية. وكما كان متوقعا، انخفضت مستويات تلطيخ المريمية وكريبا بشكل ملحوظ في جميع فصوص SG بعد FKH RNAi (الشكل 2B) مقارنة بالحمض النووي الريبي لتحكم النمل (الشكل 2A). واقترحت التخفيضات في كل من أعلى قيم الكثافة القصوى (الخطوط الحمراء المتقطعة والتسميات الرقمية) وأدنى قيم الحد الأقصى للكثافة (الخطوط المتقطعة الزرقاء والتسميات الرقمية) في ملفات تعريف المسح الضوئي للخطوط تخفيضات في مناطق الإشارة العالية والمنخفضة داخل الأنسجة (الشكلان 2 ألف وباء). تشير هذه البيانات إلى أن An. gambiae fkh RNAi فعال وأن fkh ينظم إنتاج و / أو استقرار SG TFs Sage و CrebA في An. gambiae ، على غرار علاقتها الجينية في ذبابة الفاكهة SGs 19,38,39. عند النظر في البروتينات المكونة من اللعاب الوفيرة للغاية ، تم تقليل مستويات بروتين الأنوفيليس المضاد للصفائح الدموية (AAPP) 40,41 في جميع فصوص SG الثلاثة بعد fkh RNAi ، مقارنة بمعالجة الحمض النووي الريبي الضابطة (الشكل 3A ، B ؛ الأخضر). من ناحية أخرى ، لم يلاحظ أي تغييرات في مستويات Mucin (الشكل 3A ، B ؛ الأرجواني). تشير هذه البيانات إلى أن Fkh يساهم بشكل مختلف في التعبير عن جينات بروتين اللعاب المختلفة. وأخيرا، لوحظت علامتان للإفراز (الشكلان 4A، B): Rab11 (الحويصلات المرتبطة بإعادة تدوير الإندوسومات القمي)42 وأحمر النيل (الدهون). لوحظ انخفاض تألق Rab11 في الفصوص الجانبية البعيدة (DL) بعد علاج fkh RNAi (الشكل 4A v مقابل 4B v ؛ الأخضر). ومع ذلك ، حدثت أيضا زيادة في إشارة Rab11 في الفصوص الإنسية (M) والجانبية القريبة (PL) (الشكل 4A السابع ، التاسع مقابل 4B السابع ، التاسع ؛ الأخضر). لم يلاحظ أي اختلاف ملحوظ في إشارة النيل الحمراء (الأشكال 4A ، B ؛ الأرجواني) بعد fkh RNAi مقارنة بمعالجة RNAi الضابطة. تشير هذه البيانات إلى أن الحد من FKH قد يغير بعض إجراءات الآلات الإفرازية بطريقة معقدة تختلف بين فصوص SG. مجموعة البيانات: غولتسيف نيرا أوفييدو نيرا أوفييدو خباز خباز خباز خباز رمز الجين دالة معرف AGAP الجنين (25 ساعة) يرقات L3 L3 SG أنثى بالغةالجسم (3 أيام) ذكر بالغالجسم (3 أيام) أنثى بالغةSG (3 أيام) ذكر بالغSG (3 أيام) ااب بروتين اللعاب AGAP009974 3.92 4.38 4.33 3.81 2.46 11.92 2.69 كريبا عامل txn AGAP001464 6.28 5.22 5.92 2.99 2.96 3.27 3.13 ” عامل txn AGAP011038 4.50 4.46 5.23 2.96 2.86 3.05 2.88 دي إس إكس عامل txn AGAP004050 4.91 5.39 5.55 3.72 4.00 4.57 4.01 فخه عامل txn AGAP001671 5.18 4.67 5.25 2.99 3.09 3.21 3.05 موك2 بروتين اللعاب AGAP012020 4.59 5.53 5.63 2.96 3.07 3.08 3.26 راب11 الاتجار الحويصلي AGAP004559 10.21 7.47 8.60 4.90 3.79 3.38 2.96 حكيم عامل txn AGAP013335 5.32 5.96 8.89 3.40 3.33 7.37 7.23 الجدول 1: متوسط ملفات تعريف تعبير microarray log2 ل An. غامبيا الجينات ذات الاهتمام. تظهر أسماء الجينات والفئة الوظيفية ومعرفات Vectorbase (AGAP) وبيانات تعبير المصفوفة الدقيقة log2 التي تم جمعها من Vectorbase. تشير هذه البيانات إلى أن جيناتنا ذات الأهمية (المشاركة في بيولوجيا وإفراز خلايا الغدة اللعابية (SG) يتم التعبير عنها وإثرائها في المرحلة 3 من اليرقات (L3) و SGs البالغة ، مقارنة بالأفراد بأكملهم. الشكل 1: f-Agdsx و fkh ضربة قاضية في البالغين An. gambiae يقلل من مستويات fkh mRNA في SGs ويؤثر على قدرة الإناث على تغذية الدم. (أ) صورة تمثيلية لتصميم البلازميد المستخدم لإنتاج dsRNA في هذه المنهجية. تتم إضافة تسلسل المروج T7 الثاني إلى البلازميد عن طريق تضمينه في التمهيدي 3 ‘المستخدم لتضخيم الإدراج ليتم استنساخه في بلازميد pGEMT. ثم يتم تحويل البلازميد إلى بكتيريا E. coli HT115 (DE3) ويتكون محلول التغذية من تعليق البكتيريا المستحثة القاتلة بالحرارة في 10٪ من ماء السكر. (ب) أظهرت الحيوانات التي تتغذى على محلول تغذية dsRNA إما ل f-Agdsx أو fkh مستويات أقل بكثير من نسخ fkh (ANOVA أحادية الاتجاه مع مقارنات متعددة ؛ n = 15). ومع ذلك ، أظهرت المجموعة التي تغذت على FKH dsRNA (C) فقط اختلافا كبيرا في عدد محاولات العض اللازمة للحصول على وجبة دم. احتاج البعوض في هذه المجموعة ، في المتوسط ، إلى خمسة أضعاف عدد محاولات التحقيق للحصول على وجبة دم ناجحة مما تحتاجه المجموعة التي تغذيها المجموعة أو مجموعات dsx-dsRNA التي تتغذى عليها (ANOVA أحادية الاتجاه مع مقارنات متعددة ؛ n = 15). تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ القياسي للمتوسط (SEM). أجريت كل تجربة في ثلاث نسخ بيولوجية منفصلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: ضربة قاضية fkh في الغدد اللعابية الغامبية البالغة تقلل من مستويات عامل النسخ SG. تظهر صور تمثيلية من اليوم 13 أنثى بالغة من نوع An. gambiae SGs بعد 8 أيام (أيام 5-13) من التعرض الفموي إما (A) غير المرتبط بالتحكم في dsRNA (النملة) أو (B) dsRNA الذي يستهدف رأس شوكة SG TF (fkh ، AGAP001671) في 10٪ من السكروز الملطخ بالأصباغ DAPI (الحمض النووي ؛ الأحمر) ، المسمى جرثومة القمح agglutinin (WGA ، الكيتين / O-GlcNAcylation ؛ الأزرق) ، antisera ضد SG TFs حكيم (الأخضر) و CrebA (الأرجواني). أطوال أشرطة المقياس المعروضة هي ميكرون. يتم تحديد SGs (i) بشرطات بيضاء. تشير الخطوط الصفراء في صور الفص المكبرة (للمناطق المحاطة بمربعات صفراء ، والتي تحمل علامة “داخلية”) إلى المكان الذي تم فيه إجراء مسح الخط لشدة الإشارة. يتم رسم كثافة القناة الخضراء والأرجوانية المقابلة لمسح الخط لكل فص مكبر (دائما من اليسار إلى اليمين في SG) في الرسوم البيانية أسفل الصور ؛ المحور X = المسافة (بالبكسل) والمحور Y = الوحدة الرمادية (كثافة البكسل). يتم تحديد النطاق الديناميكي لكثافة البكسل بخطوط منقطة حمراء (قصوى) وزرقاء (الحد الأدنى) ويتم عرض القيم المقابلة على كل رسم بياني. MIP = أقصى كثافة 3D الإسقاط من خلال عمق SG بأكمله. DL: الفص الجانبي البعيد. M: الفص الإنسي. PL: الفص الجانبي القريب. SD: القناة اللعابية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: ضربة قاضية fkh في الغدد اللعابية الغامبية البالغة تقلل من مستويات البروتين الذي تفرز SG. تظهر صور تمثيلية من اليوم 13 أنثى بالغة من نوع An. gambiae SGs بعد 8 أيام (أيام 5-13) من التعرض الفموي إما (A) غير المرتبط بالتحكم في dsRNA (النملة) ، أو (B) dsRNA الذي يستهدف رأس شوكة SG TF (fkh ، AGAP001671) في 10٪ من السكروز الملطخ بالأصباغ DAPI (الحمض النووي ؛ الأحمر) ، المسمى جرثومة القمح agglutinin (WGA ، chitin/ O-GlcNAcylation ؛ أزرق) ، وبروتينات اللعاب AAPP (الأخضر) و Mucin (MUC2 ، الأرجواني). أطوال أشرطة المقياس المعروضة هي ميكرون. يتم تحديد SGs (i) بشرطات بيضاء. تشير الخطوط الصفراء في صور الفص المكبر (للمناطق المحاطة بمربعات صفراء) إلى المكان الذي أجريت فيه عمليات مسح الخط لشدة الإشارة. يتم رسم كثافة القناة الخضراء والأرجوانية المقابلة لمسح الخط لكل فص (دائما من اليسار إلى اليمين في SG) في الرسوم البيانية أسفل الصور ؛ المحور X = المسافة (بالبكسل) والمحور Y = الوحدة الرمادية (كثافة البكسل). يتم تحديد النطاق الديناميكي لكثافة البكسل بخطوط متقطعة حمراء (قصوى) وزرقاء (الحد الأدنى) ويتم عرض القيم المقابلة على كل رسم بياني. MIP = أقصى كثافة 3D الإسقاط من خلال عمق SG بأكمله. DL: الفص الجانبي البعيد. M: الفص الإنسي. PL: الفص الجانبي القريب. SD: القناة اللعابية. تشير التسميات المائلة “DL” (Bi) إلى منطقتين مرئيتين من نفس الفص DL. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: ضربة قاضية fkh في الغدد اللعابية الغامبية البالغة تقلل من علامات إفراز SG. تظهر صور تمثيلية من اليوم 13 أنثى بالغة من نوع An. gambiae SGs بعد 8 أيام (أيام 5-13) من التعرض الفموي إما (A) غير المرتبط بالتحكم في dsRNA (النملة) ، أو (B) dsRNA الذي يستهدف رأس شوكة SG TF (fkh ، AGAP001671) في 10٪ من السكروز الملطخ بالأصباغ DAPI (الحمض النووي ؛ الأحمر) ، المسمى جرثومة القمح agglutinin (WGA ، الكيتين / O-GlcNAcylation ؛ الأزرق) ، أحمر النيل (الدهون ؛ الأرجواني) ، و antisera ضد إعادة تدوير علامة الحويصلة endosome Rab11 (الأخضر). أطوال أشرطة المقياس المعروضة هي ميكرون. يتم تحديد SGs (i) بشرطات بيضاء. تشير الخطوط الصفراء في صور الفص المكبر (للمناطق المحاطة بمربعات صفراء) إلى المكان الذي أجريت فيه عمليات مسح الخط لشدة الإشارة. يتم رسم كثافة القناة الخضراء والأرجوانية المقابلة لمسح الخط لكل فص (دائما من اليسار إلى اليمين في SG) في الرسوم البيانية أسفل الصور ؛ المحور X = المسافة (بالبكسل) والمحور Y = الوحدة الرمادية (كثافة البكسل). يتم تحديد النطاق الديناميكي لكثافة البكسل بخطوط متقطعة حمراء (قصوى) وزرقاء (الحد الأدنى) ويتم عرض القيم المقابلة على كل رسم بياني. MIP = أقصى كثافة 3D الإسقاط من خلال عمق SG بأكمله. DL: الفص الجانبي البعيد. M: الفص الإنسي. PL: الفص الجانبي القريب. SD: القناة اللعابية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الملف التكميلي 1. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

إن القدرة على توصيل الحمض النووي الريبوزي المرسال بشكل فعال إلى البعوض الغامبي عن طريق التغذية الفموية لها آثار واسعة النطاق على دراسات بيولوجيا النواقل في المختبر وفي الميدان على حد سواء. منذ فترة طويلة تم قبول الحقن المجهري باعتباره الطريقة المفضلة لتوصيل المواد الكيميائية والأجسام المضادة والحمض النووي الريبي واستراتيجيات التعديل الوراثي في البعوض43,44. يمكن تجنب نتيجة التلاعب المادي الكبير ، والأضرار الخلوية ، والإجهاد عن طريق استخدام التسليم عن طريق الفم ، والتي يمكن أن تكون مناسبة أيضا للتطبيقات واسعة النطاق أو الميدانية. وقد اقترح العمل السابق أن الحمض النووي الريبي يعمل في كل مكان داخل البعوض البالغ الفرد29 ، مما يسمح بتأثيرات في جميع الأنسجة ، بما في ذلك الغدد اللعابية. من خلال إطعام البعوض بأعداد كبيرة من الإشريكية القولونية المعبرة عن dsRNA والتي يتم هضمها بشكل غير متزامن على مدى إطار زمني طويل ، يمكن للمرء أن يحقق تعرضا ثابتا وموحدا للحمض النووي الريبي عبر جميع الأفراد في قفص. تسمح هذه الطريقة بإطعام أعداد كبيرة من البعوض وتحليل التباين المحتمل للأنماط الظاهرية الناتجة اعتمادا على الجين المستهدف. ومع ذلك ، فإن أحد الاعتبارات المهمة هو إمكانية التوزيع غير المتجانس للبكتيريا ، وبالتالي dsRNA ، في ألياف القطن. تحتوي 400 ميكرولتر من البكتيريا المستخدمة يوميا لتغذية البعوض بالسكر على ما يقرب من 4.6 ≤ميكروغرام من dsRNA ، كما هو موضح ومحسوب سابقا9 ولكن كمية dsRNA التي يتناولها كل بعوض لم يتم تحديدها بشكل فردي. إذا أصبح بناء هياكل dsRNA أمرا روتينيا ، فإن بروتوكول العلاج البسيط هذا يسمح بالاستيعاب السريع لهذه التقنية من قبل أي باحث في البعوض. بداهة ، فإن الوقت الذي ينفقه العلاج (30 دقيقة في اليوم) تافه مقارنة بالوقت المستغرق للتعلم وتطبيق الحقن المجهري على أحجام عينات مماثلة.

يستخدم تغذية dsRNA بشكل روتيني لدراسات علم الوراثة العكسية في الكائن الحي النموذجي Caenorhabditis elegans45. ويؤكد هذا المستوى الثقيل من الاستخدام على قيمة نهج التسليم عن طريق الفم. إن بناء مكتبة على مستوى الجينوم على مستوى An. gambiae في الإشريكية القولونية المحولة ، على غرار تلك الموجودة في C. elegans46,47 ، سيسمح بإجراء فحص وراثي عكسي سريع في البعوض على نطاق متزايد. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن كفاءة الطريقة تعتمد إلى حد كبير على المستويات الداخلية للنسخ وإذا كان التعبير لا يقتصر على الأنسجة المستهدفة ولكن يتم التعبير عنه على نطاق أوسع 4,8,44. بالإضافة إلى ذلك ، هناك أدلة على أن بعض المبيدات الحشرية يمكن أن تحفز تجنب السلوك من البعوض48 ، والتغذية بالبكتيريا التي يحتمل أن تحفز الآثار الضارة فيها يمكن أن تؤدي إلى أنماط مماثلة من التجنب. في بيئة المختبر الخاضعة للرقابة ، حيث لم يكن لدى البعوض مصدر غذائي بديل ، لم يكن لديهم خيار لتجنب ماء السكر مع الإشريكية القولونية ، وربما تتجاوز الحاجة إلى مصدر مغذي غريزة تجنب البكتيريا. ومع ذلك ، ينبغي النظر في ذلك إذا كان من المفترض استخدام الاستراتيجية في إعدادات أقل تحكما فيها.

قد يكون من الممكن استهداف جينات متعددة في وقت واحد (باستخدام بنية واحدة أو تركيبات متعددة أو خليط من العزلات البكتيرية المتحولة) ، ولكن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتقييم الفعالية. وثمة اعتبار هام آخر لهذه النقطة هو تقييم الآثار المحتملة خارج الهدف أو الآثار التآزرية عند استخدام أهداف واحدة أو متعددة. يعد إنشاء جينات ومجموعات تحكم مناسبة جزءا مهما من التصميم التجريبي. علاوة على ذلك ، من المغري التكهن بأن هذا النهج يمكن استخدامه لاستهداف مسببات الأمراض أو الفيروسات الأخرى49. تم تنفيذ العمل السابق نحو تحريض الحمض النووي الريبي في البعوض في ظل ظروف تم فيها حقن الكاشف مباشرة ، لذلك لم تكن E. coli موجودة. قد توفر الإشريكية القولونية حجرة واقية تسمح بإطلاق أبطأ ل dsRNA بمرور الوقت ، مما يضمن أن التعرض مستمر إلى حد ما على مدى فترة أطول بكثير29.

وأخيرا، تظهر هذه النتائج أن آثار هذه التقنية قابلة للضبط عن طريق ضبط الإطار الزمني (الطول ويوم البدء) للتعرض وكمية الإشريكية القولونية المستخدمة. سمحت لنا هذه الميزة بدراسة وظائف الجينات الأساسية (dsx و fkh) من خلال تحديد ظروف الضربة القاضية المثلى عن طريق التجربة والخطأ. هذا يعزز إلى حد كبير من احتمال أن الجينات المستهدفة ذات الأهمية يمكن التحقيق فيها باستخدام هذه التقنية.

باختصار ، وجد أن توصيل الحمض النووي الريبي عن طريق الفم إلى البعوض البالغ يمكن أن يكون بسيطا ومتعدد الاستخدامات ونهجا قويا لدراسة وظيفة جين البعوض ولإنشاء أدوات جديدة ومرنة لمكافحة ناقلات الأمراض التي ينقلها البعوض.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا الموظفين والعلماء داخل فرع علم الحشرات وشعبة الأمراض الطفيلية والملاريا في مركز السيطرة على الأمراض ، وبراين تريغ وميشيل تشيو على المساعدة في إعداد البكتيريا في JHU و / أو المناقشات المفيدة لهذا العمل. نشكر JHMRI Insectary ومديرها كريس كيزيتو على الوصول إلى البعوض الغامبي وتربية البعوض الغامبي . نشكر وي هوانغ (JHSPH) على المساعدة في الحصول على البلازميدات PJet GFP و pPB47 GFP لاستخدامها في هذه الدراسة. وقدم التمويل لهذا العمل كل من: NIH R21AI153588 (إلى DJA)، وهي زمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هو ومن خلال منحة من مؤسسة Good Ventures ومشروع العمل الخيري المفتوح لمؤسسة CDC بعنوان دعم الحفظ بالتبريد وقمع نمو الإناث في البعوض للمساعدة في البحث عن الملاريا ، مشروع العمل الخيري المفتوح ، 2017. نحن نقدر تقديرا عميقا المساعدة المقدمة من موظفي مرفق المجهر JHU ودعم منحة المعاهد الوطنية للصحة المعمول به للمجهر المستخدم (NIH Grant #: S10OD016374). النتائج والاستنتاجات الواردة في هذه المخطوطة هي نتائج المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات نظر مركز السيطرة على الأمراض. استخدام الأسماء التجارية هو لتحديد الهوية فقط ولا يعني موافقة مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها أو خدمة الصحة العامة أو وزارة الصحة والخدمات الإنسانية الأمريكية.

Materials

1 Kb Plus DNA Ladder Thermo Fisher Scientific 10787018
2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium BD Difco DF0440-17
AAPP n/a n/a Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo
AccuStart II PCR Supermix Quantabio 95137-100
Agarose Millipore Sigma A9539
Ampicillin Millipore Sigma A5354
Anopheles gambiae G3 BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4) MRA-112
BugDorm BioQuip 1452
Centrifuge 5810R Eppendorf P022628181
CrebA DSHB CrebA Rbt-PC Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab
Damiens diet BioServ
DAPI Life Technologies n/a 4′,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution.
Defibrinated sheep blood HemoStat DSB050
Escherichia coli HT115 (DE3)
Ethidium bromide Millipore Sigma E7637
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific 4368814
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Millipore Sigma I5502
JM109 Competent cells Promega L2005
Luria Broth Media Thermo Fisher Scientific 10855001
Mucin 2 Proteintech Muc2; 27 675-1-AP Antisera. 1:100 dilution (mouse).
Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific
Nile Red Sigma n/a Lipid dye; 1:50 dilution.
Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis Thermo Fisher Scientific Model B2
pGEMT easy Promega A3600
Power SYBR-green PCR master MIX Applied Biosystems 4367659
PureLink PCR purification kit Thermo Fisher Scientific K31001
QuantaStudio 6 Applied Biosystems
QuantStudio6 Real Time PCR System Applied Biosystems
Rab11 n/a n/a Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab
Rh-WGA Vector Labs n/a Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution
Sage n/a n/a Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab
T4 DNA ligase Promega M1801
Tetracycline Millipore Sigma 87128
Trizol Thermo Fisher Scientific 15596018
Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope Zeiss
ANTIBODIES
Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific A21472
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific A28181
IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A27034
Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A27012
PRIMERS
ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA CDC Biotechnology Core Facility Branch n/a qRT-PCR primer
ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC
CGGA		 CDC Biotechnology Core Facility Branch n/a qRT-PCR primer
FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA CDC Biotechnology Core Facility Branch n/a qRT-PCR primer
FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC CDC Biotechnology Core Facility Branch n/a qRT-PCR primer
newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT CDC Biotechnology Core Facility Branch n/a qRT-PCR primer
newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA CDC Biotechnology Core Facility Branch n/a qRT-PCR primer
S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC CDC Biotechnology Core Facility Branch n/a qRT-PCR primer
S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC CDC Biotechnology Core Facility Branch n/a qRT-PCR primer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Hoa, N. T., Keene, K. M., Olson, K. E., Zheng, L. Characterization of RNA interference in an Anopheles gambiae cell line. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 33, 949-957 (2003).
  2. Caplen, N., Zheng, Z., Falgout, B., Morgan, R. Inhibition of viral gene expression and replication in mosquito cells by dsRNA-triggered RNA interference | Elsevier enhanced reader. Molecular Therapy. 6, 243-251 (2002).
  3. Brown, A. E., Catteruccia, F. Toward silencing the burden of malaria: progress and prospects for RNAi-based approaches. BioTechniques. , 38-44 (2006).
  4. Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, (2017).
  5. Blandin, S., et al. Reverse genetics in the mosquito Anopheles gambiae: targeted disruption of the Defensin gene. EMBO Reports. 3 (9), 852-856 (2002).
  6. Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi assays in adult mosquitoes (A. gambiae). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (5), e230 (2007).
  7. Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8, 96 (2015).
  8. Wiltshire, R. M., Duman-Scheel, M. Advances in oral RNAi for disease vector mosquito research and control. Current Opinion in Insect Science. 40, 18-23 (2020).
  9. Taracena, M. L., Hunt, C. M., Benedict, M. Q., Pennington, P. M., Dotson, E. M. Downregulation of female doublesex expression by oral-mediated RNA interference reduces number and fitness of Anopheles gambiae adult females. Parasites & Vectors. 12, 170 (2019).
  10. Grassi, B. Studi di uno zoologo sulla malaria. Real Accademia dei Lincei. 3, 229 (1901).
  11. Smith, R. C., Jacobs-lorena, M. Plasmodium – Mosquito interactions: A tale of roadblocks and detours. Advances in Insect Physiology. 39, (2010).
  12. Das, S., et al. Transcriptomic and functional analysis of the Anopheles gambiae salivary gland in relation to blood feeding. BMC Genomics. 11, 1-14 (2010).
  13. Francischetti, I. M. B., Valenzuela, J. G., Pham, V. M., Garfield, M. K., Ribeiro, J. M. C. Toward a catalog for the transcripts and proteins (sialome) from the salivary gland of the malaria vector Anopheles gambiae. Journal of Experimental Biology. 205, 2429-2451 (2002).
  14. Henderson, K. D., Isaac, D. D., Andrew, D. J. Cell fate specification in thedrosophila salivary gland: The integration of homeotic gene function with the DPP signaling cascade. Biologia dello sviluppo. 205, 10-21 (1999).
  15. Mach, V., Ohno, K., Kokubo, H., Suzuki, Y. The Drosophila fork head factor directly controls larval salivary gland-specific expression of the glue protein gene Sgs3. Nucleic Acids Research. 24 (12), 2387-2394 (1996).
  16. Weiserova, M., et al. Mini-Mu transposition of bacterial genes on the transmissible plasmid. Folia Microbiologica. 32 (5), 368-375 (1987).
  17. Abrams, E. W., Mihoulides, W. K., Andrew, D. J. Fork head and Sage maintain a uniform and patent salivary gland lumen through regulation of two downstream target genes, PH4αSG1 and PH4αSG2. Development. 133, 3517-3527 (2006).
  18. Myat, M. M., Isaac, P. P., Andrew, D. J. Early genes required for salivary gland fate determination and morphogenesis in Drosophila melanogaster. Advances in Dental Research. 14, 89-98 (2000).
  19. Fox, R. M., Vaishnavi, A., Maruyama, R., Andrew, D. J. Organ-specific gene expression: the bHLH protein Sage provides tissue specificity to Drosophila FoxA. Development of Cell Biology. 140, 2160-2171 (2013).
  20. Maruyama, R., Grevengoed, E., Stempniewicz, P., Andrew, D. J. Genome-wide analysis reveals a major role in cell fate maintenance and an unexpected role in endoreduplication for the Drosophila FoxA gene fork head. PLOS ONE. 6, 20901 (2011).
  21. Johnson, D. M., et al. CrebA increases secretory capacity through direct transcriptional regulation of the secretory machinery, a subset of secretory cargo, and other key regulators. Traffic. 21, 560-577 (2020).
  22. Fox, R. M., Hanlon, C. D., Andrew, D. J. The CrebA/Creb3-like transcription factors are major and direct regulators of secretory capacity. Journal of Cell Biology. 191, 479-492 (2010).
  23. Abrams, E. W., Andrew, D. J. CrebA regulates secretory activity in the Drosophila salivary gland and epidermis. Development. 132, 2743-2758 (2005).
  24. Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238 (2019).
  25. Pei-Wen, L., Xiao-Cong, L., Jin-Bao, G., Yan, L., Xiao-Guang, C. Molecular cloning, characterization and expression analysis of sex determiantion gene doublesex from Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Acta Entomologica Sinica. 58 (2), 122-131 (2015).
  26. Scali, C., Catteruccia, F., Li, Q., Crisanti, A. Identification of sex-specific transcripts of the Anopheles gambiae doublesex gene. The Journal of Experimental Biology. 208, 3701-3709 (2005).
  27. Price, D. C., Egizi, A., Fonseca, D. M. Characterization of the doublesex gene within the Culex pipiens complex suggests regulatory plasticity at the base of the mosquito sex determination cascade. BMC Evolutionary Biology. 15, 1-13 (2015).
  28. Mysore, K., et al. siRNA-mediated silencing of doublesex during female development of the dengue vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9, 1-21 (2015).
  29. Boisson, B., et al. Gene silencing in mosquito salivary glands by RNAi. FEBS Letters. 580, 1988-1992 (2006).
  30. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents-2010 update. Nucleic Acids Research. 38, 332-339 (2010).
  31. Taracena, M. L., et al. Genetically modifying the insect gut microbiota to control chagas disease vectors through systemic RNAi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9, (2015).
  32. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).
  33. Ullmann, A., Jacob, F., Monod, J. Characterization by in vitro complementation of a peptide corresponding to an operator-proximal segment of the β-galactosidase structural gene of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 24, 339-343 (1967).
  34. Timmons, L. Bacteria-mediated RNAi-General outline. Carnegie Institution of Washington. , (2000).
  35. Pfaffl, M. W. Relative quantification. Real-time PCR. , 63-82 (2004).
  36. Neira-Oviedo, M., et al. The RNA-Seq approach to studying the expression of mosquito mitochondrial genes. Insect Molecular Biology. 20, 141-152 (2011).
  37. Baker, D. A., et al. A comprehensive gene expression atlas of sex- and tissue-specificity in the malaria vector, Anopheles gambiae. BMC Genomics. 12, (2011).
  38. Loganathan, R., Hoon, J., Wells, M. B., Andrew, D. J. Secrets of secretion – How studies of the Drosophila salivary gland have informed our understanding of the cellular networks underlying secretory organ form and function. Cellular Networks in Development. , 143 (2021).
  39. Chung, S., Hanlon, C. D., Andrew, D. J. Building and specializing epithelial tubular organs: The Drosophila salivary gland as a model system for revealing how epithelial organs are specified, form and specialize. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 3, 281-300 (2014).
  40. Yoshida, S., et al. Inhibition of collagen-induced platelet aggregation by anopheline antiplatelet protein, a saliva protein from a malaria vector mosquito. Blood. 111, 2007-2014 (2008).
  41. Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).
  42. Takahashi, S., et al. Rab11 regulates exocytosis of recycling vesicles at the plasma membrane. Journal of Cell Science. 125, 4049-4057 (2012).
  43. Catteruccia, F., Levashina, E. A. RNAi in the malaria vector, Anopheles gambiae. Methods in Molecular Biology. 555, 63-75 (2009).
  44. Balakrishna Pillai, A., et al. RNA interference in mosquito: understanding immune responses, double-stranded RNA delivery systems and potential applications in vector control. Insect Molecular Biology. 26, 127-139 (2017).
  45. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  46. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
  47. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  48. Carrasco, D., et al. Behavioural adaptations of mosquito vectors to insecticide control. Current Opinion in Insect Science. 34, 48-54 (2019).
  49. Magalhaes, T., et al. Induction of RNA interference to block Zika virus replication and transmission in the mosquito Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. , 111 (2019).

Tags

RNA InterferenceRNAiOral DeliveryAnopheles GambiaeMosquitoesDouble-stranded RNAGene SilencingReverse GeneticsBacterial CultureIPTG InductionHeat-killed BacteriaSugar SolutionCotton Ball Feeder

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Taracena, M., Hunt, C., Pennington, P., Andrew, D., Jacobs-Lorena, M., Dotson, E., Wells, M. Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes. J. Vis. Exp. (181), e63266, doi:10.3791/63266 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image