内因性 ショウジョウバエ 一過性受容器電位チャネルの精製
Summary
INADタンパク質複合体の組み立て機構に基づいて、このプロトコールでは、内因性 ショウジョウバエ TRPチャネルを精製するための改変アフィニティー精製プラス競合戦略が開発された。
Abstract
ショウジョウバエ の光形質導入は、既知の最速のGタンパク質結合シグナル伝達経路の1つである。このカスケードの特異性と効率を確保するために、カルシウム(Ca2+)透過性陽イオンチャネル、一過性受容器電位(TRP)は、足場タンパク質に強固に結合し、不活性化後電位D(INAD)、および眼特異的プロテインキナーゼC(ePKC)およびホスホリパーゼCβ/無受容体電位A(PLCβ/NORPA)との大きなシグナル伝達タンパク質複合体を形成する。しかしながら、 ショウジョウバエ TRPチャネルの生化学的特性は依然として不明である。INADタンパク質複合体の集合機構に基づいて、内因性TRPチャネルを精製するための改変アフィニティー精製+競合戦略が開発された。まず、精製ヒスチジン(His)タグ付きNORPA 863-1095フラグメントをNiビーズに結合させ、 ショウジョウバエ 頭部ホモジネートから内因性INADタンパク質複合体をプルダウンするための餌として使用した。次いで、過剰に精製されたグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)タグ付きTRP 1261〜1275フラグメントをNiビーズに添加し、TRPチャネルと競合させた。最後に、上清中のTRPチャネルを、サイズ排除クロマトグラフィーによって過剰なTRP 1261〜1275ペプチドから分離した。この方法は、 ショウジョウバエ TRPチャネルのゲーティング機構を生化学的および構造的角度の両方から研究することを可能にする。精製 ショウジョウバエ TRPチャネルの電気生理学的特性は、将来的にも測定することができる。
Introduction
光形質導入は、吸収された光子がニューロンの電気コードに変換されるプロセスです。脊椎動物と無脊椎動物の両方でオプシンと以下のGタンパク質結合シグナル伝達カスケードを独占的に中継する。ショウジョウバエでは、5つのPDZドメインを用いて、足場タンパク質不活性化後電位D(INAD)が、一過性受容器電位(TRP)チャネル、ホスホリパーゼCβ/No受容体電位A(PLCβ/NORPA)、および眼特異的プロテインキナーゼC(ePKC)からなる超分子シグナル伝達複合体を組織する1。この超分子シグナル伝達複合体の形成は、ショウジョウバエの光形質導入機構の正しい細胞内局在化、高効率、および特異性を保証する。この複合体において、光感受性TRPチャネルは、NORPAの下流エフェクターとして作用し、カルシウム流入および光受容体の脱分極を媒介する。以前の研究は、ショウジョウバエTRPチャネルの開放がプロトン、局所脂質環境の破壊、または機械的力によって媒介されることを示した2,3,4。ショウジョウバエTRPチャネルはまた、カルモジュリン5と相互作用し、正および負の両方のフィードバック6,7,8によってカルシウムによって調節される。
これまでのところ、ショウジョウバエTRPおよびTRP様(TRPL)チャネルのゲーティング機構に関する電気生理学的研究は、摘出された膜パッチ、解離した野生型ショウジョウバエ光受容体からの全細胞記録、およびS2、SF9、またはHEK細胞2、9、10、11、12、13におけるヘテロ発現チャネルに基づいていたが、精製チャネルでは基づいていなかった。全長ショウジョウバエTRPチャネルの構造情報も不明のままである。再構成された膜環境における精製タンパク質の電気生理学的特性を研究し、全長ショウジョウバエTRPチャネルの構造情報を得るためには、哺乳動物のTRPチャネル研究で使用される方法論と同様に、精製全長TRPチャネルを得ることは必要な第1ステップである14、15、16、17。
最近、INADタンパク質複合体18、19、20の集合機構に基づいて、ストレプトアビジンビーズ5によってショウジョウバエ頭部ホモジネートからTRPチャネルを精製するためのアフィニティー精製プラス競合戦略が最初に開発された。ストレプトアビジンビーズの低容量で高価なコストを考慮して、Hisタグ付き餌タンパク質と、はるかに高い容量の対応する低コストのNiビーズを使用する改良された精製プロトコルがここで紹介されています。提案手法は,TRPチャネルのゲーティング機構を構造的角度から研究し,精製タンパク質を用いてTRPチャネルの電気生理学的性質を測定するのに役立つ.
Protocol
Representative Results
Discussion
5つのPDZドメインを含むINADは、ショウジョウバエの光形質導入機構の中核をなす組織者です。以前の研究では、INAD PDZ3がTRPチャネルC末端尾部に絶妙な特異性(KD=0.3μM)で結合することを示していました18。INAD PDZ45タンデムは、非常に高い結合親和性(KD=30nM)を有するNORPA 863−1095断片と相互作用する。これらの知見は、アフィニティー精製と競合戦略を設計…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(第31870746号)、深セン基礎研究費補助金(JCYJ20200109140414636)、および中国広東省自然科学財団(第2021A1515010796号)の支援を受けてW. L.私たちは、この原稿の準備中に言語的支援をしてくれたLetPub(www.letpub.com)に感謝します。
Materials
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
Riferimenti
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