Utilizzo della colorazione rosso alizarina per rilevare la perdita ossea indotta chimicamente nelle larve di zebrafish
Summary
Qui, abbiamo usato la colorazione rosso alizarina per dimostrare che l’esposizione all’acetato di piombo provoca un cambiamento di massa ossea nelle larve di zebrafish. Questo metodo di colorazione può essere adattato allo studio della perdita ossea nella perdita di larve di zebrafish indotta da altre sostanze tossiche pericolose.
Abstract
La perdita ossea indotta chimicamente dovuta all’esposizione al piombo (Pb) potrebbe innescare una serie di impatti avversi sui sistemi scheletrici sia umani che animali. Tuttavia, gli effetti e i meccanismi specifici del pesce zebra rimangono poco chiari. Il rosso alizarina ha un’alta affinità per gli ioni calcio e può aiutare a visualizzare l’osso e illustrare la massa minerale scheletrica. In questo studio, abbiamo mirato a rilevare la perdita ossea indotta dall’acetato di piombo (PbAc) nelle larve di zebrafish utilizzando la colorazione rosso alizarina. Gli embrioni di zebrafish sono stati trattati con una serie di concentrazioni di PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) tra 2 e 120 ore dopo la fecondazione. La colorazione scheletrica a montaggio intero è stata condotta sulle larve a 9 giorni dopo la fecondazione e l’area totale colorata è stata quantificata utilizzando il software ImageJ. I risultati hanno indicato che i tessuti mineralizzati erano colorati in rosso e l’area colorata diminuiva significativamente nel gruppo di esposizione al PbAc, con un cambiamento dose-dipendente nella mineralizzazione ossea. Questo documento presenta un protocollo di colorazione per studiare i cambiamenti scheletrici nei difetti ossei indotti da PbAc. Il metodo può essere utilizzato anche nelle larve di zebrafish per la rilevazione della perdita ossea indotta da altre sostanze chimiche.
Introduction
Studi recenti hanno confermato che l’osteoporosi dovuta a glucocorticoidi, inibitori dell’aromatasi e consumo eccessivo di alcol è comune 1,2. Il piombo (Pb) è un metallo tossico presente nelle piante, nel suolo e negli ambienti acquatici3. Sebbene gli effetti avversi del Pb sul corpo umano abbiano attirato molta attenzione, il suo impatto irreversibile sull’osso deve essere studiato ulteriormente. L’intossicazione da piombo provoca una vasta gamma di cambiamenti patologici sia nello scheletro in via di sviluppo che in quello adulto, influenzando le normali attività della vita. Gli studi hanno trovato un’associazione tra esposizione cronica a Pb e danno osseo4, tra cui strutture ossee compromesse5,6, ridotta densità minerale ossea e persino aumento del rischio di osteoporosi7.
Il tessuto mineralizzato è di grande importanza per la resistenza ossea8 e la deposizione della matrice di mineralizzazione ossea è un indice critico della formazione ossea9. Il rosso alizarina ha un’alta affinità per gli ioni calcio e la colorazione rosso alizarina è una procedura standard per valutare la formazione ossea10. Secondo questo metodo, il tessuto mineralizzato è colorato di rosso, mentre tutto il resto del tessuto rimane trasparente. L’area colorata viene quindi quantificata mediante analisi digitale delle immagini11.
Il pesce zebra è un importante organismo modello ampiamente utilizzato nella scoperta di farmaci e nei modelli di malattia. Studi genetici nel pesce zebra e nell’uomo hanno dimostrato somiglianze nei meccanismi alla base della morfogenesi scheletrica a livello molecolare12. Inoltre, lo screening di farmaci o biomolecole ad alto rendimento è più fattibile in grandi covate di zebrafish rispetto ai modelli murini, facilitando lo studio meccanicistico di molecole proosteogeniche o osteotossiche13. La colorazione differenziale dello scheletro in toto10 è frequentemente utilizzata nello studio della displasia scheletrica nei piccoli vertebrati e nei feti di mammiferi. La colorazione rossa dell’alizarina è stata eseguita per studiare la tossicità dello sviluppo osseo delle sostanze chimiche nelle larve di zebrafish. Qui, abbiamo usato il piombo come esempio per descrivere un protocollo per rilevare difetti ossei indotti dall’acetato di piombo nelle larve di zebrafish.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il pesce zebra è un modello adatto per studiare la malattia metabolica ossea. Rispetto ai modelli di roditori, i modelli di zebrafish sono relativamente veloci da stabilire e la misurazione della gravità della malattia è più facile. Nelle larve di zebrafish wild-type, la mineralizzazione dello scheletro della testa avviene a 5 dpf e lo scheletro assiale a 7 dpf15. Pertanto, le ossa craniche come PS, OP, CB e NC sono ben sviluppate a 9 dpf. Dopo che le larve sono state completamente decolorate …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81872646; 81811540034; 81573173) e dal Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
Materials
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
Riferimenti
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