Protocolos Otimizados de Amostragem Óssea para a Recuperação de DNA Antigo de Vestígios Arqueológicos

Todas as pesquisas aqui apresentadas foram realizadas em conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Instituto Max Planck para a Ciência da História Humana, Jena, Alemanha, para trabalhar com restos humanos antigos. Antes de executar qualquer etapa deste protocolo, certifique-se de aderir a todos os requisitos éticos locais / estaduais / federais relativos à obtenção de permissão para o estudo científico e ao uso de restos humanos para amostragem destrutiva em sua área. Todos os procedimentos/armazenamento de produtos químicos devem ser realizados de acordo com as diretrizes de segurança institucionais individuais. 1. Considerações antes do processamento da amostra Trate as amostras com cuidado, pois os restos antigos são um recurso irreplicável e finito (por exemplo, a amostragem deve ser o menos desperdiçadora possível, e todos os restos devolvidos aos seus respectivos fornecedores legais, se possível). Execute todas as etapas em um ambiente de sala limpa, de preferência em uma instalação dedicada ao DNA antigo17,18,19. Use equipamentos de proteção individual (EPIs) que consistam em macacões microporosos estéreis com capuz, luvas estéreis (dois pares), máscara cirúrgica, óculos de proteção e botas estéreis ou sapatos antiderrapantes com capas estéreis (consulte Tabela de Materiais). Troque as luvas com frequência, especialmente entre as amostras. Limpe e desinfete completamente todos os equipamentos e superfícies com solução de descontaminação de água sanitária/DNA/etanol e irradiação UV (comprimento de onda: 254 nm) sempre que possível (por exemplo, brocas, brocas, vises/grampos, etc.). Finalmente, é altamente recomendável fazer pausas ergonômicas regulares (a cada 2-3 h, se possível) para evitar o excesso de exaustão devido ao ambiente de sala limpa.NOTA: Todos os restos esqueléticos devem ser adequadamente documentados (por exemplo, fotografados, pesados e, se possível, micro-TC digitalizados, imagens 3D, etc.) antes da amostragem (protocolos para documentação apropriada não são cobertos neste manuscrito). Todos os protocolos de amostragem podem ser pausados entre as iterações de amostragem e as amostras podem ser armazenadas indefinidamente em um ambiente seco, com temperatura controlada (25 °C), estéril. 2. Pré-tratamento Descontaminar todos os locais de amostragem anatômica antes da geração do pó ósseo para minimizar o risco de contaminação18.NOTA: A eficácia da lixívia e/ou remoção de superfície (ver NOTA na etapa 3.3.2 para as etapas de remoção de superfície) para a descontaminação de amostras ainda é uma questão de debate entre os pesquisadores de aDNA 8,19,20,21,22,23,24,25, pois ambas podem influenciar o rendimento geral de DNA, especialmente em amostras altamente degradadas. Dessa forma, as etapas a seguir são consideradas opcionais e estão incluídas aqui, pois foram utilizadas em todas as amostras para gerar os resultados representativos apresentados neste trabalho. Recomenda-se que o uso desses protocolos de pré-tratamento seja determinado caso a caso com base na aplicação molecular, idade, raridade e nível de degradação morfológica de cada conjunto de amostras.Realize toda a amostragem em uma sala limpa dedicada sob um exaustor de reação em cadeia da polimerase (PCR) equipado com luz UV ou gabinete de biossegurança com o fluxo de ar desligado. Espalhe a folha de alumínio estéril pela bancada para capturar qualquer pó/fragmento de osso perdido. Certifique-se de que todos os fragmentos ósseos sejam recuperados (para repatriação) antes de descartar a folha. Troque a folha entre o tratamento de cada elemento esquelético. Eliminar a folha usada num saco/recipiente de risco biológico autoclavável. Remova o máximo possível de sujeira/detritos soltos dos locais de amostragem anatômica limpando suavemente a área com uma limpeza estéril seca e sem fiapos (consulte Tabela de Materiais). Eliminar os toalhetes em sacos ou recipientes de risco biológico autoclaváveis. Descontaminar a superfície limpa limpando com um lenço umedecido estéril humedecido com lixívia comercial diluída (~0,01% v/v, diluído com água ultrapura isenta de DNase/RNase) e deixar incubar durante 5 min. Eliminar os toalhetes em sacos ou recipientes de risco biológico autoclaváveis.CUIDADO: A água sanitária é um produto químico altamente corrosivo e reativo; por conseguinte, devem existir precauções de segurança adequadas antes da sua utilização. Remova o máximo de água sanitária residual possível do local de amostragem anatômica com um lenço umedecido estéril com água ultrapura isenta de DNase/RNase. Eliminar os toalhetes em sacos ou recipientes de risco biológico autoclaváveis. Exponha todos os locais de amostragem anatômica limpos à radiação UV por 30 minutos (comprimento de onda: 254 nm) e, em seguida, deixe secar totalmente à temperatura ambiente. Certifique-se de que os locais de amostragem anatômica estejam completamente secos antes de prosseguir com a amostragem ou retornar ao armazenamento para não apenas facilitar a geração de pó ósseo, mas também para evitar uma maior degradação da amostra (por exemplo, mofo).CUIDADO: A exposição à radiação UV pode ser prejudicial para os olhos. Deslocar-se imediatamente para a amostragem ou armazenar elementos esqueléticos num ambiente seco e estéril com temperatura controlada (25 °C). 3. Geração de pó ósseo NOTA: Os protocolos a seguir destinam-se ao uso na extração de DNA seguindo o protocolo26 de Dabney et al. 2019. Amostragem de pars petrosaNOTA: Este protocolo é adaptado dos procedimentos descritos em Pinhasi et al. 20194 e é apresentado aqui para facilitar o uso. Este protocolo não representa o método atual, menos destrutivo, para a amostragem de pars petrosa. Como tal, recomenda-se a utilização do protocolo descrito por Sirak et al. 201713 ou Orfanou et al. 202014 para amostras cuja preservação morfológica é de máxima importância.Realize toda a amostragem em uma sala limpa dedicada sob um exaustor de PCR equipado com luz UV ou gabinete de biossegurança (comprimento de onda: 254 nm) com o fluxo de ar desligado. Espalhe a folha de alumínio estéril pela bancada para capturar qualquer pó/fragmento de osso perdido. Certifique-se de que todos os fragmentos ósseos e o máximo de pó possível sejam recuperados (para repatriação) antes de descartar a folha. Troque a folha entre cada amostragem. Eliminar a folha utilizada num saco/recipiente de risco biológico autoclavável. Prenda o elemento seco e descontaminado usando um grampo ou vise esterilizado. Cortar a pars petrosa ao meio ao longo do sulco petrosus superior (ver figura 1) utilizando uma serra de joalharia padrão equipada com uma lâmina de 0,6 mm (ver Tabela de Materiais) a uma velocidade média para evitar o sobreaquecimento (ver NOTA abaixo passo 3.1.6).CUIDADO: A pars petrosa é muito densa e, como tal, pode ser difícil de cortar. Tome cuidado para manter o elemento firmemente preso para evitar lesões. Descarte todas as lâminas de serra quebradas no recipiente apropriado dos perfurocortantes. Remova as porções petrosas da braçadeira. Recupere e salve qualquer material solto/excedente. Coloque o papel de pesagem em um barco de pesagem estéril Segure a porção petrosa sobre o papel de pesagem, cortado lateralmente inclinado em direção à bandeja de pesagem. Perfure o osso cortical denso entre o canal facial e o antro mastoideo (parece mais brilhante do que o material circundante, ver Figura 1) usando uma broca dentária equipada com um bit de calibre pequeno (ver Tabela de Materiais) e ajustada para velocidade média, torque médio para produzir pó ósseo.NOTA: A perfuração/corte deve ser feita em rajadas curtas a velocidades baixas a médias para evitar o superaquecimento do osso e potencialmente destruir/danificar o DNA. Curiosamente, quando a porção densa do petroso começa a superaquecer, um cheiro descrito como bacon de cozimento pode ser observado. Pare de perfurar/serrar imediatamente e deixe o osso descansar até arrefecer suficientemente antes de retomar. Repetir a perfuração até que aproximadamente 50-100 mg de pó sejam coletados no papel de pesagem, conforme medido usando uma balança fechada com precisão de pelo menos 0,01 mg (ver Tabela de Materiais).NOTA: Sempre que possível, sugere-se reunir 100 mg de pó ósseo para permitir duas repetições de extração de DNA de 50 mg cada. No entanto, isso nem sempre pode ser possível com base na limitação dos próprios locais de amostragem anatômica (por exemplo, a falange distal, a câmara da polpa dentária) ou na necessidade de preservação morfológica. Para outros locais, como o cemento, podem estar disponíveis consideravelmente menos de 50 mg do material. No entanto, o cemento, a câmara da polpa dentária e a falange distal demonstraram produzir DNA endógeno significativo 11,27,28, apesar da menor entrada inicial de pó ósseo do processo de extração. Transfira o pó do papel de pesagem para um tubo de 2 mL rotulado com baixa ligação e trava segura para extração ou armazenamento. Conservar as amostras a -20 °C, por tempo indeterminado. Armazenar o osso remanescente/excesso de pó em um ambiente seco e estéril com temperatura controlada (25 °C) até que o retorno/repatriamento possa ser concluído. Eliminar todos os resíduos em sacos ou recipientes de risco biológico autoclaváveis. Esterilizar/descontaminar todos os equipamentos reutilizáveis (por exemplo, grampos, brocas, brocas, serras, etc.) usando água sanitária/solução de descontaminação de DNA/etanol e exposição UV (comprimento de onda: 254 nm), conforme aplicável, entre cada amostragem. Figura 1: Osso temporal incluindo a pars petrosa. (A) Pré-corte de amostra mostrando as localizações da pirâmide petrosa e do sulco petrosa. (B) Porção petrosa pós-corte destacando as áreas densas a serem perfuradas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Amostragem de molares permanentesNOTA: Para a amostragem de molares permanentes, pré-selecione in situ molares com raízes fundidas e, idealmente, vazios de cáries, rachaduras no esmalte ou desgaste excessivo para melhores resultados. Remova qualquer amostragem de cálculo dentário e armazene a -20 °C para possíveis análises futuras do microbioma oral (procedimento não abordado aqui).Amostragem do cementoRealize toda a amostragem em uma sala limpa dedicada sob um exaustor de PCR equipado com luz UV ou gabinete de biossegurança (comprimento de onda: 254 nm) com o fluxo de ar desligado. Espalhe a folha de alumínio estéril pela bancada para capturar qualquer pó/fragmento de osso perdido. Certifique-se de que todos os fragmentos ósseos e o máximo de pó possível sejam recuperados (para repatriação) antes de descartar a folha. Troque a folha entre cada amostragem. Eliminar a folha usada num saco/recipiente de risco biológico autoclavável. Coloque uma folha de papel de pesagem em uma bandeja de pesagem estéril. Segure/prenda o molar descontaminado pelo esmalte, raiz para baixo, sobre uma bandeja de pesagem usando uma braçadeira de mão, como uma chave ajustável (consulte Tabela de materiais). Equipe uma broca dentária com uma roda de corte circular com bordas de diamante. Com a broca ajustada para uma configuração de velocidade/torque média, toque levemente a borda do bit na raiz em um ângulo de aproximadamente -20°. Raspe para baixo na bandeja para remover / coletar o material amarelo e mais externo da raiz (cemento). Pare a coleta quando o material mais claro (branco) da dentina se tornar visível.NOTA: É importante combinar a direção de rotação do bit de corte em relação à bandeja de coleta para evitar que o pó se torne aerossolizado e potencialmente desperdice a amostra por perder a bandeja inteiramente. O cemento é particularmente rico em DNA; no entanto, os rendimentos típicos de material são muito menores do que outros locais de amostragem anatômica (~7-20 mg)11,27,28. Registar a massa de pó recolhida em papel de pesagem utilizando uma balança fechada com uma precisão de, pelo menos, 0,01 mg (ver Tabela de Materiais). Transfira o pó do papel de pesagem para um tubo de bloqueio seguro e de baixa ligação de 2 mL para extração. Conservar a -20 °C, por tempo indeterminado. Amostragem da câmara pulparApós a coleta do cemento (se desejado), corte o molar ao longo da junção cemento-esmalte usando uma serra de joalheiro para remover a coroa (ver Figura 2). Coloque uma nova folha de papel de pesagem em uma nova bandeja de pesagem. Prenda a seção da coroa em uma braçadeira ou viseira portátil, sobre a bandeja de pesagem. Segure o lado cortado inclinado para baixo e o material de perfuração/raspagem como a primeira passagem com uma broca dentária equipada com uma pequena broca de calibre (consulte Tabela de Materiais) ao longo das bordas da câmara de celulose dentro da porção da coroa (ver Figura 2).NOTA: Apenas a primeira passagem do interior da câmara pulpar deve ser coletada e rotulada como material pulpar (rendimento típico de 5-15 mg), qualquer coisa mais profunda no dente é considerada dentina. Vire o dente com a porção inferior voltada para baixo, bata no grampo com um martelo e colete o pó liberado no papel de pesagem. Registar o peso do pó recolhido no papel de pesagem utilizando uma balança fechada com uma precisão de, pelo menos, 0,01 mg (ver Tabela de Materiais). Transfira o pó do papel de pesagem para um tubo de 2 mL de baixa ligação e bloqueio seguro para extração. Conservar a -20 °C, por tempo indeterminado. Amostragem da dentinaColoque uma nova folha de papel de pesagem em uma nova bandeja de pesagem. Manter a secção da coroa sobre o tabuleiro de pesagem (de acordo com o passo 3.2.2.3), perfurar e recolher mais 50-100 mg de dentina, medidos utilizando uma balança fechada com precisão de 0,01 mg (ver Tabela de Materiais) do interior da câmara pulpar da mesma forma para posterior amostragem da dentina (ver figura 2). Transfira o pó ósseo do papel de pesagem para um tubo de 2 mL de baixa ligação e trava segura para extração. Conservar a -20 °C, por tempo indeterminado. Armazenar as peças dentárias restantes / excesso de pó em um ambiente seco, com temperatura controlada (25 °C) estéril até que o retorno/repatriação possa ser concluído. Eliminar todos os resíduos em sacos ou recipientes de risco biológico autoclaváveis. Esterilizar/descontaminar todos os equipamentos reutilizáveis (por exemplo, grampos, brocas, brocas, serras, etc.) usando as exposições de lixívia/solução de descontaminação de DNA/etanol e UV (comprimento de onda: 254 nm), conforme aplicável, entre cada amostragem. Figura 2: Pré-amostragem molar permanente . (A) Molar pré-tratado antes da amostragem, mostrando coroa, cemento (camada amarelada da raiz) e o local de corte na junção cemento-esmalte. (B) A mesma coleção molar pós-cemento, mostrando o local de corte na junção cemento-esmalte. (C) Pós-corte molar e amostragem mostrando locais de amostragem anatômica para a câmara da polpa dentária e dentina dentro da coroa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Amostragem das vértebras torácicasAmostragem do corpo vertebralRealize toda a amostragem em uma sala limpa dedicada sob um exaustor de PCR equipado com luz UV ou gabinete de biossegurança (comprimento de onda: 254 nm) com o fluxo de ar desligado. Espalhe a folha de alumínio estéril pela bancada para capturar qualquer pó/fragmento de osso perdido. Certifique-se de que todos os fragmentos ósseos e o máximo de pó possível sejam recuperados (para repatriação) antes de descartar a folha. Troque a folha entre cada amostragem. Eliminar a folha usada num saco/recipiente de risco biológico autoclavável. Coloque uma pequena folha de papel de pesagem em uma bandeja de pesagem padrão. Prenda as vértebras com um grampo ou viseira de mão, com o corpo vertebral para fora. Segure as vértebras sobre a bandeja de pesagem com o corpo vertebral inclinado para baixo. Usando uma broca dentária equipada com uma broca de perfuração de calibre pequeno (ver Tabela de Materiais) ajustada para torque alto torque de baixa velocidade, perfure ao longo da borda mais externa (inferior e superior) do osso cortical ao redor do tecido interno esponjoso do corpo vertebral (ver Figura 3). Raspe o bit contra a camada cortical sobre uma bandeja de pesagem padrão até que 50-100 mg de material sejam coletados, conforme medido usando uma balança fechada com precisão de 0,01 mg (ver Tabela de Materiais). Transfira o pó ósseo do papel pesado para um tubo de bloqueio seguro e de baixa ligação de 2 mL para extração. Conservar a -20 °C, por tempo indeterminado. Amostragem do arco vertebral superiorObservação : esta etapa é opcional. Remova e descarte a camada mais externa do osso cortical do arco vertebral superior usando uma broca dentária equipada com uma broca de perfuração de calibre pequeno (ver Tabela de Materiais), raspando-a ao longo da superfície19. Isto não é sugerido para amostragem do corpo vertebral, uma vez que a camada de osso cortical é geralmente muito fina e é provável que seja totalmente esgotada por este processo (ver NOTA na secção 2).Coloque uma pequena folha de papel de pesagem em uma bandeja de pesagem padrão. Prenda as vértebras em uma braçadeira / vise de mão com o processo vertebral para fora, aspecto superior para baixo. Enquanto segura as vértebras, aspecto superior para baixo, sobre uma bandeja de pesagem, perfure para cima no centro do entalhe em forma de V formado pela fusão do processo espinhoso com as lamelas (ver Figura 3) usando uma broca dentária com um pequeno bit de calibre (ver Tabela de Materiais) ajustado para baixa velocidade e alto torque. Pare de perfurar quando houver uma queda perceptível na resistência. Altere ligeiramente a posição de perfuração e repita até que 50-100 mg de pó ósseo sejam coletados, conforme medido usando uma balança fechada com precisão de 0,01 mg (ver Tabela de Materiais). Transfira o pó ósseo do papel pesado para um tubo de baixa ligação de 2 mL para extração. Conservar a -20 °C, por tempo indeterminado. Armazenar o osso remanescente/excesso de pó num ambiente seco e estéril com temperatura controlada (25 °C) até à devolução/repatriamento. Eliminar todos os resíduos em sacos ou recipientes de risco biológico autoclaváveis. Esterilizar/descontaminar todos os equipamentos reutilizáveis (por exemplo, grampos, brocas, brocas, serras, etc.) utilizando água sanitária/solução de descontaminação de DNA/etanol e exposição UV (comprimento de onda: 254 nm), conforme aplicável, entre cada amostragem. Figura 3: Locais de amostragem anatômica do corpo vertebral e do osso cortical superior do arco vertebral superior da vértebra torácica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Amostragem da falange distalObservação : esta etapa é opcional. Remover e descartar a camada mais externa do osso cortical do eixo e/ou tufo apical usando uma broca dentária equipada com uma pequena broca de perfuração, raspando-a ao longo da superfície19. Isto pode não ser possível para amostras com osso cortical excessivamente fino ou restos juvenis (ver NOTA na secção 2).Realize toda a amostragem em uma sala limpa dedicada, sob um exaustor de PCR equipado com luz UV ou gabinete de biossegurança (comprimento de onda UV: 254 nm) com o fluxo de ar desligado. Espalhe a folha de alumínio estéril pela bancada para capturar qualquer pó/fragmento de osso perdido. Certifique-se de que todos os fragmentos ósseos e o máximo de pó possível sejam recuperados (para repatriação) antes de descartar a folha. Troque a folha entre cada amostragem. Eliminar a folha usada num saco/recipiente de risco biológico autoclavável. Coloque uma pequena folha de papel de pesagem em uma bandeja de pesagem padrão. Prenda a amostra em braçadeira/viseira portátil, lado superior para cima. Segure a amostra sobre a bandeja de pesagem, recolha o pó ósseo do osso cortical do lado inferior do tufo apical e do eixo perfurando as camadas densas mais exteriores (ver Figura 4) utilizando uma broca dentária equipada com uma broca de perfuração de calibre pequeno (ver Tabela de Materiais). Pare de perfurar quando houver uma diminuição acentuada na resistência, pois isso significa material mais leve e esponjoso. Repita este processo, irradiando para fora da perfuração inicial até que pelo menos 50-100 mg de pó ósseo sejam coletados, conforme medido usando uma balança fechada com precisão de 0,01 mg (ver Tabela de Materiais). Transfira o pó ósseo do papel de pesagem para um tubo de 2 mL de baixa ligação e trava segura para extração. Conservar a -20 °C, por tempo indeterminado. Conservar o osso restante/excesso de pó num ambiente seco e estéril com temperatura controlada (25 °C) até à devolução/repatriamento. Eliminar todos os resíduos em sacos ou recipientes de risco biológico autoclaváveis. Esterilizar/descontaminar todos os equipamentos reutilizáveis (por exemplo, grampos, brocas, brocas, serras, etc.) usando água sanitária/solução de descontaminação de DNA/etanol e exposição UV, conforme aplicável, entre cada amostragem.NOTA: Para amostras menores (por exemplo, amostras juvenis) pode haver consideravelmente menos do que os 50-100 mg sugeridos de osso cortical disponíveis para amostra. No entanto, mesmo em baixas quantidades, esse local de amostragem anatômica tem se mostrado particularmente rico em DNA11. Figura 4: Falange distal mostrando a localização do osso cortical denso ao longo da diáfise e do lado inferior do tufo apical. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Amostragem do TalusRealize toda a amostragem em uma sala limpa dedicada sob um exaustor de PCR equipado com luz UV ou gabinete de biossegurança (comprimento de onda: 254 nm) com o fluxo de ar desligado. Espalhe a folha de alumínio estéril pela bancada para capturar qualquer pó/fragmento de osso perdido. Certifique-se de que todos os fragmentos ósseos e o máximo de pó possível sejam recuperados (para repatriação) antes de descartar a folha. Troque a folha entre cada amostragem. Eliminar a folha usada num saco/recipiente de risco biológico autoclavável. Coloque uma pequena folha de papel de pesagem em uma bandeja de pesagem padrão. Prenda a amostra em braçadeira/viseira portátil, cúpula para cima. Segure o tálus, a cúpula para cima e a superfície medial em direção ao coletor, sobre a bandeja de pesagem. Raspe o osso cortical do colo do tálus a uma profundidade de ~1 mm (ver Figura 5) usando uma broca dentária com um bit de calibre baixo (ver Tabela de Materiais) ajustado para baixa velocidade e alto torque. Altere ligeiramente a posição de perfuração e repita até que aproximadamente 50-100 mg de pó ósseo sejam coletados, conforme medido usando uma balança fechada com precisão de 0,01 mg (ver Tabela de Materiais). Transfira o pó ósseo do papel pesado para um tubo de baixa ligação de 2 mL para extração. Conservar a -20 °C, por tempo indeterminado. Armazenar o osso restante/excesso de pó num ambiente seco e estéril com temperatura controlada (25 °C) até que o retorno/repatriamento possa ser concluído. Eliminar todos os resíduos em sacos ou recipientes de risco biológico autoclaváveis. Esterilizar/descontaminar todos os equipamentos reutilizáveis (por exemplo, grampos, brocas, brocas, serras, etc.) usando água sanitária/solução de descontaminação de DNA/etanol e exposição UV (comprimento de onda: 254 nm), conforme aplicável, entre cada amostragem. Figura 5: Área de amostragem do tálus para recuperação óssea cortical. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. NOTA: O tálus tem muito pouco osso cortical (uma fina camada externa). O material não deve ser apenas coletado da superfície, mas também da camada densa subjacente de osso esponjoso.