优化的骨采样方案，用于从考古遗迹中提取古代DNA

本文介绍的所有研究均按照德国耶拿马克斯普朗克人类历史科学研究所制定的古代人类遗骸指南进行。在执行本协议的任何步骤之前，请确保遵守与获得科学研究许可和使用人类遗骸在您所在地区进行破坏性采样有关的所有地方/州/联邦道德要求。所有程序/化学品储存应根据个别机构的安全指南进行。 1. 样品处理前的注意事项 小心对待样本，因为古代遗骸是一种不可复制和有限的资源（例如，取样应尽可能减少浪费，如果可能的话，所有遗骸都应归还给各自的合法提供者）。 在洁净室环境中执行所有步骤，最好是在专用的古代DNA设施17，18，19。使用个人防护装备（PPE），包括带头罩的无菌微孔工作服，无菌手套（两副），外科口罩，防护眼镜和无菌靴或带无菌盖的防滑鞋（见材料表）。经常更换手套，尤其是在样品之间。 尽可能使用漂白剂/DNA 去污溶液/乙醇和紫外线照射（波长：254 nm）（例如钻头、钻头、虎钳/夹具等）彻底清洁和消毒所有设备和表面。最后，强烈建议定期进行符合人体工程学的休息（如果可能，每 2-3 小时一次），以避免由于洁净室环境而导致过度疲惫。注意：在取样之前，所有骨骼遗骸都应适当记录（例如，拍照，称重，如果可能，显微CT扫描，3D成像等）（本手稿未涵盖适当记录的方案）。所有采样方案都可以在采样迭代之间暂停，样品可以无限期地储存在干燥、温度受控（25°C）的无菌环境中。 2. 预处理 在骨粉生成之前对所有解剖采样位置进行净化，以最大程度地降低污染风险18.注意：漂白剂和/或表面去除（有关表面去除步骤，请参见步骤3.3.2中的注释）对样品净化的有效性仍然是aDNA研究人员争论的问题8，19，20，21，22，23，24，25，因为两者都可能影响整体DNA产量，特别是在高度降解的样品中。因此，以下步骤被认为是可选的，并包含在此处，因为它们已用于所有样本中以生成本文中介绍的代表性结果。建议根据每个样品组的分子应用、年龄、稀有性和形态降解水平逐案确定这些预处理方案的使用。在配备紫外线的聚合酶链反应（PCR）罩或关闭气流的生物安全柜下的专用洁净室中进行所有采样。将无菌铝箔铺在工作台上，以捕捉任何散落的骨粉/碎片。 在处理箔片之前，确保所有骨头碎片都已恢复（用于遣返）。在每个骨骼元件的处理之间更换箔片。将用过的箔纸丢弃在可高压灭菌的生物危害袋/容器中。 用不起毛的干燥无菌湿巾轻轻擦拭该区域，从解剖取样位置尽可能多地去除松散的污垢/碎屑（见 材料表）。将湿巾丢弃在可高压灭菌的生物危害袋或容器中。 用蘸有稀释商业漂白剂（~0.01% v / v，用超纯DNase / RNase无水稀释）的无菌擦拭擦拭来净化清洁的表面，并孵育5分钟。将湿巾丢弃在可高压灭菌的生物危害袋或容器中。注意：漂白剂是一种高腐蚀性和反应性化学物质;因此，在使用前应采取适当的安全预防措施。 用用超纯脱氧核糖核酸酶/无核糖核酸酶的水润湿的无菌擦拭布从解剖取样位置尽可能多地去除残留的漂白剂。将湿巾丢弃在可高压灭菌的生物危害袋或容器中。 将所有清洁的解剖采样位置暴露在紫外线辐射下30分钟（波长：254nm），然后在室温下完全干燥。在进行取样或返回储存之前，确保解剖取样位置完全干燥，不仅使骨粉生成更容易，而且防止样本（例如霉菌）进一步降解。注意：暴露于紫外线辐射可能对眼睛有害。 立即在干燥、温度受控（25°C）的无菌环境中取样或储存骨骼元件。 3. 骨粉生成 注意：以下协议旨在用于Dabney等人2019年协议26之后的DNA提取。 抽样 pars petrosa注意：本协议改编自Pinhasi等人2019中描述的程序4 为了便于使用，此处提供。该协议不代表当前用于采样的破坏性最小的方法 pars petrosa.因此，建议使用 Sirak 等人描述的协议。 201713 或奥法努等人 202014 适用于形态保存最为重要的样品。在配备紫外线的PCR罩或生物安全柜（波长：254 nm）关闭气流的专用洁净室中进行所有采样。将无菌铝箔铺在工作台上，以捕捉任何散落的骨粉/碎片。 在处理箔纸之前，确保回收所有骨头碎片和尽可能多的粉末（用于遣返）。在每次采样之间更换箔片。将用过的箔纸丢弃在可高压灭菌的生物危害袋/容器中。 使用无菌夹子或虎钳固定干燥、去污的元件。 使用配备0.6毫米刀片的标准珠宝商锯（见材料表）以中速将石沟沿上岩沟切成两半（见图1），以避免过热（见步骤3.1.6下面的注释）。注意： 石油油非常 密集，因此可能难以切割。注意保持元件牢固夹紧，以免受伤。将任何破损的锯片丢弃在适当的锐器容器中。 从夹子上取下岩质部分。恢复并保存任何松散/多余的材料。 将秤纸放入无菌称量舟中 将岩质部分放在秤纸上，切面朝称量托盘倾斜。使用配备小规格钻头的牙钻入面管和乳突窦之间的致密皮质骨（看起来比周围材料更有光泽，见图1），并设置为中速，中等扭矩以产生骨粉。注意：钻孔/切割应在中低速下短时间内完成，以避免骨骼过热并可能破坏/破坏DNA。有趣的是，当岩的致密部分开始过热时，可能会观察到一种被称为烹饪培根的气味。立即停止钻孔/锯切，让骨头休息，直到足够冷却后再恢复。 重复钻孔，直到在称量纸中收集约50-100 mg粉末，使用精确到至少0.01 mg的封闭天平测量（参见 材料表）。注意：在可能的情况下，建议收集100毫克骨粉，以便进行两次重复DNA提取，每次50毫克。然而，基于解剖取样位置本身的限制（例如，远端指骨、牙髓室）或形态学保存的需要，这可能并不总是可行的。对于其他位置，例如牙骨质，可用的材料可能远少于50毫克。然而，牙骨质、牙髓室和远端指骨都被证明会产生显着的内源性 DNA11，27，28，尽管提取过程中骨粉的初始输入较低。 将粉末从称量纸转移到 2 mL 标记的低结合安全锁定管中进行提取或储存。无限期地将样品储存在-20°C。 将剩余的骨头/多余的粉末储存在干燥，温度受控（25°C）的无菌环境中，直到可以完成返回/遣返。 将所有废物丢弃在可高压灭菌的生物危害袋或容器中。在每次采样之间，使用漂白剂/DNA 净化溶液/乙醇和紫外线（波长：254 nm）暴露（如适用）对所有可重复使用的设备（例如夹具、钻头、钻头、锯子等）进行消毒/净化。 图1：颞骨，包括 岩部。 （A）显示岩金字塔和 岩沟 位置的样品预切割。（B）岩石部分后切突出要钻探的密集区域。 请点击此处查看此图的大图。 恒磨牙取样注意：对于恒磨牙的采样，请预先选择 in situ 臼齿具有融合的根部，理想情况下没有龋齿、牙釉质裂缝或过度磨损以获得最佳效果。取出任何牙结石取样并储存在-20°C，以便将来可能对口腔微生物组进行分析（此处未涵盖的程序）。牙骨质取样在配备紫外线的PCR罩或生物安全柜（波长：254 nm）关闭气流的专用洁净室中进行所有采样。将无菌铝箔铺在工作台上，以捕捉任何散落的骨粉/碎片。 在处理箔纸之前，确保回收所有骨头碎片和尽可能多的粉末（用于遣返）。在每次采样之间更换箔片。将用过的箔纸丢弃在可高压灭菌的生物危害袋/容器中。 将一张秤纸放入无菌称量托盘中。 使用手持夹具（如可调节扳手）将去污的磨牙根向下固定在称重托盘上（见 材料表）。 为牙钻配备金刚石边圆形切割轮。将钻头设置为中等速度/扭矩设置后，以大约 -20° 的角度将钻头边缘轻轻接触根部。 向下刮入托盘中，从根部（牙骨质）中去除/收集黄色的最外层材料。当牙本质的较浅（白色）材料变得可见时停止收集。注意： 重要的是使切割钻头相对于收集盘的旋转方向相匹配，以避免粉末雾化并可能因完全错过托盘而浪费样品。牙骨质的DNA特别丰富;然而，材料的典型产量远小于其他解剖采样位置（~7-20 mg）11，27，28。 使用精确到至少0.01 mg的封闭天平记录在秤纸中收集的粉末质量（参见 材料表）。 将粉末从称量纸转移到 2 mL 低粘合安全锁管中进行提取。无限期储存在-20°C。 纸浆室取样收集牙骨质后（如果需要），使用珠宝商的锯将磨牙沿水泥-牙釉质连接处切片以去除牙冠（见 图 2）。 将一张新秤纸放入新的称量托盘中。 将冠部固定在手持式夹具或虎钳中，固定在称量托盘上。保持切割面向下倾斜，并用配备小规格钻头的牙钻（见材料表）沿着牙冠部分内的纸浆室边缘钻孔/刮擦 材料（见 图2）。注意：只有牙髓室内部的第一道将被收集并标记为牙髓材料（5-15毫克典型产量），任何深入牙齿的东西都被认为是牙本质。 将牙齿向下转动，用锤子敲击夹子，然后将释放的粉末收集在秤纸上。 使用精确到至少0.01 mg的随附天平记录在秤纸中收集的粉末的重量（参见 材料表）。 将粉末从称量纸转移到 2 mL 低结合安全锁管中进行提取。无限期储存在-20°C。 牙本质取样将一张新秤纸放入新的称量托盘中。 将冠部放在称量托盘上（按照步骤3.2.2.3），钻出并进一步收集50-100毫克的牙本质，使用精确到0.01毫克的封闭天平以同样的方式从纸浆室内部测量（见材料 表），以进行进一步的牙本质采样（见 图2）。 将骨粉从秤纸转移到 2 mL 低结合安全锁定管中进行提取。无限期储存在-20°C。 将剩余的牙片/多余的粉末存放在干燥，温度受控（25°C）的无菌环境中，直到可以完成返回/遣返。 将所有废物丢弃在可高压灭菌的生物危害袋或容器中。在每次采样之间，使用漂白剂/DNA 去污溶液/乙醇和紫外线（波长：254 nm）暴露（如适用）对所有可重复使用的设备（例如夹具、钻头、钻头、锯子等）进行消毒/净化。 图 2：永久性 磨牙预采样。 （A）取样前预处理的磨牙，显示牙冠，牙骨质（根部的淡黄色层）和水泥-牙釉质连接处的切割部位。（B）相同的牙骨质后臼齿集合，显示水泥-牙釉质连接处的切割部位。（C） 磨牙切割后和取样，显示牙髓室和牙冠内牙本质的解剖取样位置。 请点击此处查看此图的大图。 胸椎取样椎体取样在配备紫外线的PCR罩或生物安全柜（波长：254 nm）关闭气流的专用洁净室中进行所有采样。将无菌铝箔铺在工作台上，以捕捉任何散落的骨粉/碎片。 在处理箔纸之前，确保回收所有骨头碎片和尽可能多的粉末（用于遣返）。在每次采样之间更换箔片。将用过的箔纸丢弃在可高压灭菌的生物危害袋/容器中。 将一小张秤纸放入标准称量托盘中。 用夹子或手钳固定椎骨，椎体向外。 将椎骨放在称重托盘上，椎体向下倾斜。使用配备有设置为低速高扭矩的小规格钻头（见 材料表）的牙钻，沿着椎体松质内组织周围的皮质骨的最外缘（下缘和上缘）钻孔（见 图3）。 在标准配重托盘上刮擦皮质层，直到收集到50-100 mg的材料，使用精确到0.01 mg的封闭天平测量（参见 材料表）。 将骨粉从称量纸转移到 2 mL 低结合安全锁管中进行提取。无限期储存在-20°C。 上椎弓取样注意：此步骤是可选的。使用配备有小规格钻头的牙钻（见 材料表）沿表面刮擦，去除并丢弃上椎弓皮质骨的最外层19。不建议从椎体取样，因为皮质骨层通常非常薄，并且可能在此过程中完全耗尽（见第2节中的注释）。将一小张秤纸放入标准称量托盘中。 将椎骨固定在手夹/虎钳中，椎突向外，上侧向下。 在保持椎骨的同时，上侧向下，在称重托盘上，使用具有小规格钻头（见材料表）设置为低速和高扭矩的牙钻，向上钻入由棘突与薄片融合形成的 V 形凹口的中心（见图 3）。 当阻力明显下降时停止钻孔。稍微改变钻孔位置并重复直到收集50-100mg骨粉，使用精确到0.01mg的封闭天平测量（见 材料表）。 将骨粉从称量纸转移到 2 mL 低结合管中进行提取。无限期储存在-20°C。 将剩余的骨头/多余的粉末储存在干燥，温度受控（25°C）的无菌环境中，直到返回/遣返。 将所有废物丢弃在可高压灭菌的生物危害袋或容器中。在每次采样之间，使用漂白剂/DNA 去污溶液/乙醇和紫外线（波长：254 nm）暴露（如适用）对所有可重复使用的设备（例如夹具、钻头、钻头、锯子等）进行消毒/净化。 图3：椎体和胸椎的上椎弓皮质骨解剖采样位置。 请点击此处查看此图的大图。 远端指骨取样注意：此步骤是可选的。使用配备有小规格钻头的牙钻沿表面刮擦，去除并丢弃轴和/或顶端簇的皮质骨的最外层19。对于皮质骨或幼年遗骸过薄的样品，这可能是不可能的（见第2节的注）。在专用洁净室中，在配备紫外线的PCR罩或生物安全柜（紫外线波长：254 nm）下进行所有采样，并关闭气流。将无菌铝箔铺在工作台上，以捕捉任何散落的骨粉/碎片。 在处理箔纸之前，确保回收所有骨头碎片和尽可能多的粉末（用于遣返）。在每次采样之间更换箔片。将用过的箔纸丢弃在可高压灭菌的生物危害袋/容器中。 将一小张秤纸放入标准称量托盘中。 将样品固定在手持式夹具/虎钳中，上侧朝上。 将样品放在称量托盘上，使用配备小规格钻头的牙钻（见材料表）钻穿最外层致密层（见图4），从顶端簇和轴的下侧从皮质骨中收集骨粉。 当阻力明显降低时停止钻孔，因为这意味着较轻的松质材料。重复此过程，从初始钻孔向外辐射，直到收集至少50-100mg骨粉，使用精确到0.01mg的封闭天平测量（见 材料表）。 将骨粉从秤纸转移到 2 mL 低结合安全锁定管中进行提取。无限期储存在-20°C。 将剩余的骨头/多余的粉末储存在干燥，温度受控（25°C）的无菌环境中，直到返回/遣返。 将所有废物丢弃在可高压灭菌的生物危害袋或容器中。在每次采样之间，使用漂白剂/DNA 去污溶液/乙醇和紫外线照射（如适用）对所有可重复使用的设备（例如夹具、钻头、钻头、锯子等）进行消毒/净化。注意：对于较小的样本（例如，青少年样本），可用于样本的皮质骨可能远少于建议的50-100毫克皮质骨。然而，即使数量很少，这个解剖采样位置也被证明特别富含DNA11。 图 4：远端指骨，显示沿顶端簇轴和下侧的致密皮质骨的位置。 请点击此处查看此图的大图。 距骨取样在配备紫外线的PCR罩或生物安全柜（波长：254 nm）关闭气流的专用洁净室中进行所有采样。将无菌铝箔铺在工作台上，以捕捉任何散落的骨粉/碎片。 在处理箔纸之前，确保回收所有骨头碎片和尽可能多的粉末（用于遣返）。在每次采样之间更换箔片。将用过的箔纸丢弃在可高压灭菌的生物危害袋/容器中。 将一小张秤纸放入标准称量托盘中。 将样品固定在手持式夹具/虎钳中，圆顶向上。 将距骨、圆顶向上和内侧表面朝向收集器，放在称量托盘上。使用低轨钻头（见材料表）设置为低速和高扭矩的牙钻从距骨颈部刮皮质骨至~1毫米的深度（见图5）。 稍微改变钻孔位置并重复，直到收集大约50-100mg骨粉，使用精确到0.01mg的封闭天平测量（见 材料表）。 将骨粉从称量纸转移到 2 mL 低结合管中进行提取。无限期储存在-20°C。 将剩余的骨头/多余的粉末储存在干燥，温度受控（25°C）的无菌环境中，直到可以完成返回/遣返。 将所有废物丢弃在可高压灭菌的生物危害袋或容器中。在每次采样之间，使用漂白剂/DNA 净化溶液/乙醇和紫外线（波长：254 nm）暴露（如适用）对所有可重复使用的设备（例如夹具、钻头、钻头、锯子等）进行消毒/净化。 图 5：用于皮质骨恢复的距骨采样区域。 请点击此处查看此图的大图。 注意：距骨的皮质骨很少（薄的外层）。材料不仅应从表面收集，还应从松质骨的致密层中收集。