Modellierung parakriner nichtkanonischer Wnt-Signalwege in vitro
Summary
Die vorliegende Studie skizziert eine hochgradig reproduzierbare und handhabbare Methode, um parakrine nichtkanonische Wnt-Signalereignisse in vitro zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde angewendet, um die Auswirkungen der parakrinen Wnt5a-Signalübertragung in murinen Neuralleistenzellen und Myoblasten zu bewerten.
Abstract
Der nichtkanonische Wnt-Signalweg reguliert die intrazelluläre Aktinfilamentorganisation und die polarisierte Migration von Vorläuferzellen während der Embryogenese. Dieser Prozess erfordert komplexe und koordinierte parakrine Interaktionen zwischen signalsendenden und signalempfangenden Zellen. Da diese Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen unterschiedlicher Linien auftreten können, kann die In-vivo-Bewertung zellspezifischer Defekte eine Herausforderung darstellen. Die vorliegende Studie beschreibt eine hochreproduzierbare Methode zur Bewertung der parakrinen nichtkanonischen Wnt-Signalgebung in vitro. Dieses Protokoll wurde mit der Fähigkeit entwickelt, (1) funktionelle und molekulare Bewertungen der nicht-kanonischen Wnt-Signalübertragung zwischen zwei beliebigen Zelltypen von Interesse durchzuführen; (2) die Rolle von signalsendenden versus signalempfangenden Molekülen im nicht-kanonischen Wnt-Signalweg analysieren; und (3) phänotypische Rettungsexperimente mit molekularen oder pharmakologischen Standardansätzen durchführen.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die nicht-kanonische Wnt-Signalisierung in Myoblasten zu bewerten. Das Vorhandensein von NCCs ist mit einer erhöhten Anzahl von Phalloidin-positiven zytoplasmatischen Filopodien und Lamellipodien in Myoblasten und einer verbesserten Myoblastenmigration in einem Wundheilungstest verbunden. Die Wnt5a-ROR2-Achse wurde als entscheidender nichtkanonischer Wnt-Signalweg zwischen NCC- und Kardiomyoblasten-Vorläuferzellen des zweiten Herzfelds (SHF) identifiziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dies ein sehr gut handhabbares Protokoll ist, um parakrine nichtkanonische Wnt-Signalmechanismen in vitro zu untersuchen.
Introduction
Der nichtkanonische Wnt-Signalweg ist ein evolutionär konservierter Signalweg, der die zelluläre Filamentorganisation und die gerichtete Migration reguliert. Dieser Signalweg wurde an mehreren biologischen Prozessen beteiligt, einschließlich der embryonalen Gewebemorphogenese 1,2,3, der lymphatischen und vaskulären Angiogenese4,5,6,7 und des Krebswachstums und der Metastasierung 8,9,10 . Auf zellulärer Ebene wird die nichtkanonische Wnt-Signalisierung durch koordinierte parakrine Interaktionen zwischen signalsendenden und signalempfangenden Zellen durchgeführt. Diese Wechselwirkungen treten häufig zwischen Zellen verschiedener Linien oder Typen auf und umfassen ein vielfältiges molekulares Netzwerk, das bis zu 19 Liganden und mehrere Rezeptoren, Co-Rezeptoren und nachgeschaltete Signaltransduktionseffektoren umfasst11. Frühere Studien haben gezeigt, dass Liganden-Rezeptor-Kombinationen kontext- und gewebeabhängig variieren können 12,13 und dass dieselben Quellliganden, die die nichtkanonische Wnt-Signalisierung in signalempfangenden Zellen antreiben, von mehreren signalsendenden Zelltypen produziert werden können 14,15 . Angesichts der zellulären und molekularen Komplexität, die mit der nichtkanonischen Wnt-Signalgebung verbunden ist, war die Fähigkeit, individuelle und klinisch relevante Mechanismen in vivo zu untersuchen, begrenzt.
Es wurden Versuche unternommen, die nicht-kanonische Wnt-Signalisierung mit Zellkulturtechniken in vitro zu untersuchen. Zum Beispiel wurden Wundheilungsassays, die in zellulären Monoschichten durchgeführt wurden, verwendet, um die zelluläre gerichtete Migration funktionell zu beurteilen 4,16,17,18,19. Immunfärbungstechniken wurden verwendet, um räumliche Analysen der Oberflächenproteinexpression durchzuführen, um nicht-kanonische Wnt-induzierte Veränderungen in der zellulären Morphologie 7,10, Architektur und asymmetrischen Polarisation18,19,20 zu bewerten. Obwohl diese Ansätze wichtige Werkzeuge zur Charakterisierung von Wnt-bezogenen Phänotypen in Signalempfangszellen geliefert haben, schränkt das Fehlen von signalsendenden Komponenten in diesen Protokollen ihre Fähigkeit ein, parakrine Signalmechanismen, die in vivo beobachtet wurden, genau zu modellieren. Daher besteht nach wie vor ein dringender Bedarf an der Entwicklung von In-vitro-Systemen, die eine robuste und reproduzierbare Bewertung parakriner Signalwechselwirkungen zwischen signalsendenden und empfangenden Zellen des nicht-kanonischen Wnt-Signalwegs, insbesondere zwischen Zellen verschiedener Zelltypen, ermöglichen.
Zu diesem Zweck war das primäre Ziel dieser Studie, ein Protokoll zur Modellierung parakriner nichtkanonischer Wnt-Signalwechselwirkungen in vitro zu erstellen. Wir entwickelten ein berührungsloses Kokultursystem, das signalsendende und signalempfangende Komponenten dieser Interaktionen rekapituliert und die Verwendung molekularer, genetischer oder pharmakologischer Standardansätze ermöglicht, um spezifische Ligandenrezeptormechanismen im nichtkanonischen Wnt-Signalweg unabhängig voneinander zu untersuchen. Mechanismen der NCC-vermittelten Wnt-Signalübertragung wurden in Myoblasten mit etablierten murinen Zelllinien untersucht. Als Beweis des Prinzips wurde dieses Modell verwendet, um Ergebnisse früherer In-vivo-Studien an Mäusen zu bestätigen, die die Wnt5a-ROR2-Achse als relevanten nicht-kanonischen Wnt-Signalweg zwischen NCCs21 und SHF-Kardiomyoblasten-Vorläuferzellen 3,22,23 implizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der nichtkanonische Wnt/Planarzellpolaritäts-Signalweg (PCP) ist ein kritisch wichtiger zellulärer Signalweg, der an multiplen Entwicklungsprozessen 24,25 und Krankheitsprozessen 24,26 beteiligt ist. Während der embryonalen Entwicklung beinhaltet die nichtkanonische Wnt-Signalübertragung ein ausgedehntes Netzwerk molekularer Signale von signalsendenden Zellen, die letztendlich Veränderungen …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH-Auszeichnungen F30HL154324 an O.T. und K08HL121191 und R03HL154301 an S.R.K. unterstützt. Die Autoren möchten anerkennen, dass das Schema in Abbildung 1 in diesem Manuskript mit biorender.com erstellt wurde.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
Riferimenti
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