アクチンダイナミクス、クラッチカップリング、成長コーンアドバンスの牽引力の解析

実験動物を用いた実験は、奈良科学技術大学の動物医療・利用委員会で行われました。調査官は、実験動物のケアと使用のための彼らの制度的および国家動物規制委員会によって確立されたガイドラインに従う必要があります。 1. ソリューションとメディアの準備 補足ファイル 1 に要約したソリューションとカルチャ メディアを準備する 2. ポリD-リジン(PDL)/ラミニンコーティング基質の調製 直径14mmのガラス底皿に100μg/mL PDLをコーティングし、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)に溶解し、37°Cの加湿インキュベーターで一晩インキュベートします。注:この手順の後、ガラス表面を乾かさないで下す PDL溶液とピペット1 mLのPBSをガラス上で10回3回取り出します。 5 μg/mL ラミニンで皿をコーティングし、PBSに溶解し、37°Cの加湿インキュベーターで一晩インキュベートします。 ガラスの上にラミニン溶液とピペット1mLのPBSを10回3回取り出します。 PBSを取り出し、ガラス表面に0.5mLの神経基底培地を置きます。37 °Cの加湿インキュベーターに料理を保管してください。注:PDL/ラミニンコーティングされた食器は、37°Cの加湿インキュベーターに2〜3日間保存することができます。 海馬の解剖と解離 子宮頸部脱臼により、妊娠中のマウスを安楽死させる。注:本研究では市販のマウスを使用しています( 材料表を参照)。研究者は、殺菌された環境で飼育され、人道的に処理されたマウスを使用する必要があります。 胚性16日目(E16)マウス胚を解剖し、氷の上に置く。 層流フードで、はさみで脳を解剖し、10 mLの氷冷解剖液を含む無菌10cm皿の上に置きます。 解剖ステレオ顕微鏡では、慎重に大脳半球の髄液を剥がし、鉗子を使用して海馬を解剖する。 海馬を15mLチューブ内の氷冷消化液5mLに移します。海馬を水浴で37°Cで20分間インキュベートします。 消化液を取り除き、解剖液の3 mLを追加します。 パスツールピペットでカバピピを4回軽くピペットします。 海馬を水浴で37°Cで20分間インキュベートします。 細胞懸濁液を50 mL遠心チューブに移します。解離されていない組織に3 mLの解剖液を加えます。 海馬が完全に解約されるまで、ステップ3.7-3.9を繰り返します。 パスツールピペットで旋回し、吸引することによって、細胞懸濁液からDNAの浮遊凝集体を除去します。細胞懸濁液を180xgで4°Cで20分間遠心分離する。注:損傷した細胞から得られたDNAは遠心分離プロセスを妨げるでしょう。ニューロンが上清に残っている場合は、DNAを慎重に除去した後に再び細胞懸濁液を遠心分離する。 10%のウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン(100 U/mL)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)を含む神経基底培地を、37°Cの加湿インキュベーターで5%CO2で平衡化した。 4. トランスフェクションと培養ニューロン 上清を取り除き、50 mLチューブに5mLの氷冷PBSを加えます。穏やかなピペットによって細胞ペレットを再懸濁する。 細胞懸濁液10μLをマイクロ遠心チューブに移し、0.5%のトリパンブルー溶液の10μLを加え、ヘモサイトメーターで細胞数を数えます。 50 mLチューブ内の細胞懸濁液を180 x g で4°Cで20分間遠心分離する。 一方、トランスフェクションのアリコート、pFN21A-ハロタガアクチン1μg、pmNeonGreen-N1-ビアクト3 μg/1 x 106 細胞、マイクロ遠心チューブに。 遠心分離後、上清を取り除き、100 μLのエレクトロポレーション媒体(トランスフェクションキットで提供)を50 mLチューブに加えます。ピペット処理により細胞ペレットを再懸濁する。 細胞懸濁液をアリクォートDNA溶液と混合し、キュベット(トランスフェクションキットによって提供される)に混合物を移す。注:気泡がエレクトロポレーションを邪魔するので、細胞懸濁液からそれらを取り除きます。 キュベットをエレクトロポレーション装置(材料表)に挿入し、プログラムO-005を用いてエレクトロポレーションを行います。 10S、ペニシリン(100 U/mL)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)を含む予温および平衡化された神経基底培地をすぐに1mL加えます。 プラスチックピペット(トランスフェクションキットによって提供される)を使用して、セル懸濁液を15 mL遠心管に移します。 細胞懸濁液10μLをマイクロチューブに移し、0.5%のトリパンブルー溶液を10μL加え、ヘモサイトメーターで細胞数を数えます。 インキュベーターからPDL/ラミニンコーティングガラス底皿を取り出し、神経基底培地を取り除きます。 1皿あたり2.0 x 105 細胞を含む細胞懸濁液のピペット0.5mLを、37°Cで加湿インキュベーターにインキュベートし、5%CO2 で3時間培養する。 培地を2%B-27サプリメント、グルタミン(1mM)、ペニシリン(100 U/mL)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)を含む神経基底培地の0.5mLに交換してください。5%CO2で37°Cで3日間加湿インキュベーターでニューロンを培養します。 5. ニューロン成長コーンでのシングルスペックルイメージング イン ビトロ (DIV)3日に、テトラメチルロダミン(TMR)リガンドで、培養培地中の1:2000希釈の希釈でニューロンを治療する。5%CO2で37°Cで1時間のニューロンを維持します。 TMRリガンドを、あらかじめ温めたPBSで3回洗います。 2%B-27サプリメント、グルタミン(1mM)、ペニシリン(100 U/mL)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)を含む、温めたライボヴィッツのL-15培地のPBSおよびピペット0.5mLを取り除きます。 37°Cで1時間ニューロンを維持する。 蛍光顕微鏡をオンにし、ステージトップインキュベーターを37°Cに設定します。注:本プロトコルは、相補的な金属酸化物半導体カメラ、100x/1.40 NA油浸し対物レンズ、水銀ランプ、画像取得ソフトウェアを搭載した蛍光顕微鏡を使用しています( 材料表参照)。同等の仕様を有する他の蛍光顕微鏡もこの分析に使用することができる。 TMRリガンド処理したニューロンをガラス底皿に加えて、温めたステージトップインキュベーターに置きます。 画像取得パラメータを次のように設定します: 曝露時間、ライフアクトおよびハロタグアクチン蛍光チャネルの 500 ms;ビン、1 x 1 (0.065 μm ×ピクセルあたり 0.065 μm)時間間隔、3秒。期間、50フレーム。 ライフアクトを強く表現し、ハロタグアクチンを弱く発現する成長コーンを選択します。注: Lifeact の発現は、成長コーン形態を可視化するのに十分な強度を持つ必要があります。ハロタグアクチン発現は、検出するには弱く不十分であるべきである(図2A)。蛍光タンパク質のレベルは、トランスフェクション用のDNA量を変化させることで調整できます。 ダイヤフラムのフィールドを閉じて、成長コーンを含む最小領域を照らします(図2B)。注:最小領域の照明は、バックグラウンド信号を低減し、ノイズ(S/N)比に蛍光信号を増加させ、アクチン斑点の検出を可能にします(図2B)。S/N比をさらに高めるには、中性密度フィルタにより光を減らさずに成長コーンを照明することが推奨されます。 タイムラプス画像(補足ファイル2)を取得します。マルチチャンネルタイムラプススタックイメージ(tiff形式)として保存します。 6. 画像処理および解析ソフトウェアフィジーを用いたF-アクチン流速と重合速度の定量化 メモ:F-アクチンの流速とアクチン重合率を定量化するための実践データについては 、補足ファイル3 を参照してください。 フィジーでマルチチャネルタイムラプススタック画像を開きます。 [ スケール>分析]を選択し、画像のピクセルサイズを設定します。 フィロポディアまたはラメリポディアのFアクチンバンドル内の最低5つの時間枠のために逆行的に流れるアクチンスペックルを見つけます。 イメージ >変形>回転を選択し、F-アクチンバンドルが上向きになるように画像の角度を調整します(図3A)。 ツールバーの 矩形 をクリックし、アクチンの斑点とF-actinバンドルの先端を含むボックスを描きます(図3B、1、2)。注:ハロタグアクチン斑点の信号は弱いです。さらに、成長コーンの遠位先端におけるLifeactシグナルは弱く、弱い(図2B)成長コーンの遠位先端が近位部に比べて薄いため(図2B)。研究者は、F-アクチンの流速と重合速度の定量を最適化するために信号を強化する必要があります(図3B)。近位成長コーンでのLifeactシグナルは飽和状態になるが、これはF-アクチンの遠位端の決定を妨げない(図3E、黄色の線)。 [ イメージ>複製] を選択し、5つのタイムフレームを入力します(図3B、3-5)。 [イメージ > スタック>モンタージュを作成] を選択し、パラメータを入力します。行、1;スケール係数、1。 [OK] をクリックします。画像モンタージュが画面に表示されます。 [イメージ>カラー>スプリットチャンネル] を選択します。これは2つの蛍光チャネルを分離する。 Fアクチン流速の定量化 [ 測定>分析]を選択し、[ 面積 ]および[ 外接する四角形]を選択します。 ツールバーの オーバル をクリックし、アクチンのスペックルに円を描きます(図3C、1、2)。 [ イメージ>オーバーレイ>選択を追加] を選択します。円はイメージモンタージュ上に重ねられます(図3C、3、および4)。注: オーバーレイの色は、[ 色の編集] >オプション>変更できます。 残りの斑点について円のオーバーレイを繰り返します(図3C、5)。注: アクチンスペックルの中心を正確に特定するには、調査員が斑点に円を重ねるようにしてください。 ツールバーの [ 直線 ] をクリックし、円の中心をリンクする線を描画します(図 3D、1、2)。 [ メジャー>分析] を選択します。結果が画面に表示されます(図3D、3)。注: 結果に表示される 高さは 、観察中のアクチンスペックルの転座距離を示します(図3D、3)。 転座距離を観測時間で割ってFアクチン流速を計算します。 F-アクチン重合率の定量化。 F-アクチンバンドルの先端をリンクする線を描きます(図3E、1)。 [ >測定の分析] を選択します。結果が画面に表示されます(図3E、2)。注: 結果の 高さは 、観察中の F-アクチンバンドルの延長長さを示します(図 3E,2)。 延長長を観測時間で割ってFアクチン延長率を計算する。 F-アクチンの流速と伸長速度の和としてFアクチン重合率を計算します(図3F)。 7. 牽引力顕微鏡とニューロン培養のためのPAAゲルの調製 牽引力顕微鏡に必要なPAAゲルの調製(図4) ピペット0.5mLのNaOH(100 mM)、蒸留H2O、直径27mmガラス底皿に溶解し、室温(RT)で15分間インキュベートする。 3-アミノプロピルトリメチオキシシラン(APTMS)の50 μLを皿のNaOH溶液に加え、穏やかなピペットで溶液を混合し、RTで15分間インキュベートします。 ガラス底の食器を蒸留したH2Oで洗い、乾かします。 ピペット0.5 mLの0.5%グルタルアルデヒド溶液は、PBSに溶解し、APTMS処理ガラス底皿に溶解し、RTで30分間インキュベートする。 ガラス底の食器を蒸留したH2Oで洗い、乾かします。 蒸留H2O(412 μL)、30%(w/v)アクリルアミド溶液(63μL)、ビスアクリルアミド溶液(6μL)2.5%(6μL)、カルボンシル酸修飾マイクロスフィア(蛍光ビーズ)溶液(20μL)を含む溶液を調製します。注:蛍光ビーズ溶液は、アクリルアミド溶液に添加する前に凝集ビーズを解体するボルテックス。 RTで30分間真空チャンバーで溶液を脱気する。 この溶液に、10%(w/v)の過硫酸アンモニウム(APS)の1μLを加え、蒸留H2Oに溶解し、1μLのN,N,N’,N’,N’-テトラメチルエチレンアミン(TEMED)を加え、穏やかなピペットで混合します。 15 mL 遠心管のキャップにガラスカバースリップ(直径18mm)を置きます。 すぐに溶液の25 μLをカバースリップに加え、その後、蓋の上に逆ガラス底皿をそっと置きます。アクリルアミドをRTで1時間重合させる。 蒸留したH2Oをカバースリップに塗布し、曲がった先端を持つ注射針を使用してゲルから剥がします。 H2Oを取り出し、硫化塩SANPAH(1mM)を加え、PBSに溶解し、ゲルに溶解させた。 滅菌条件下では、ゲルを紫外線に5分間照射します。ゲルをPBSで3回、15分間洗浄します。 微小球の字下げ法を用いたゲル剛性の決定(図5A)44。 直径と密度に指定されたマイクロスフィアをゲルに移し、レーザー走査共焦点顕微鏡の標本ステージに置きます。 ゲル表面に焦点を合わせ、Z位置を記録します(図5B)。 同様に、微小球の底面に焦点を当て、z位置を記録します(図5C)。 ゲルサーフェスのZ位置と微小球の底部の差によって決定されるインデント深度を計算します。 ゲルのヤング率 E を計算します:ここで、fは微小球の浮力補正重量、dはゲルのインデント深度、rは微小球の半径、vはポアソン比(値は46で決定された0.3)です。 セクション2に記載されているように、PDLとラミニンでゲルをコーティングします。 セクション3および4に記載されているように、E16マウス胚を解剖し、海馬を解離し、1.0 x 106 細胞あたり5μgのpEGFP-C1でトランスフェクトする。PDL/ラミニンコーティングゲルに2.0 x 105 細胞をシードします。注:牽引力分析では、蛍光標識細胞の顕微鏡イメージングが成長コーン領域を決定するために必要です。 8. ニューロン成長コーンにおける牽引力顕微鏡 DIV3では、培養培地を、2%B-27サプリメント、グルタミン(1mM)、ペニシリン(100 U/mL)、ストレプトマイシン(100μg/mL)を含む、0.5mLの温めたライボヴィッツのL-15培地に置き換えます。37°Cで1時間ニューロンを維持する。 レーザー走査型共焦点顕微鏡をオンにし、ステージトップインキュベーターを37°Cに設定します。注:本研究では、63x/1.2 NA水浸し対物レンズと画像取得および解析ソフトウェアを搭載したレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用しています( 材料表参照)。 事前に温めたステージトップインキュベーターの上にガラス底皿にニューロンを置きます。 次のように画像取得パラメータを設定します: スキャンサイズ、512 ×512ピクセル;スキャン領域、1.5-3倍ズーム;スキャン速度、フレームあたり〜1秒。レーザー波長、561 nm(蛍光ビーズの励起波長)および488nm(強化された緑色蛍光タンパク質(EGFP)の励起波長)。時間間隔、3秒。期間、50フレーム。 成長コーン形態を可視化するには、EGFPを強く表現する成長コーンを選択します。 ゲル表面に焦点を合わせ、タイムラプス画像を取得します(図6A および 補足ファイル4)。注:トラクション分析には、2つの蛍光チャネル(蛍光ビーズとEGFP用)と明視野チャンネル(差動干渉コントラスト(DIC)または位相コントラスト画像のキャプチャが推奨されます)を使用してください。 画像処理ソフトウェア(フィジーなど)を使用して、単一チャンネルのタイムラプスRGB画像スタックを生成し、これらの画像をtiffファイルとして保存します。注: 調査官が生データも保存することが重要です。 100 μLのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を、蒸留H2Oに溶解し、基質からニューロンを放出してゲル基板を弛緩させるガラス底皿に塗布する。37°Cで5分間インキュベートし、温度を安定させます。注: 訓練されていない基板内のビーズの画像は、牽引力解析中に元のビーズの位置を参照するために使用されます(図6C)。SDS溶液の適用は、インキュベーターの熱変化および細胞誘導変形の緩和によるxyz位置を変化させる。したがって、調査官は、焦点面とx-y位置を修正する必要があります。 ゲル表面に焦点を当て、訓練を受けていない基板内のビーズの画像を取得する(図6B)。 訓練されていない基板内のビーズの単一チャンネルRGB画像を生成し、tiffファイルとして保存します。 フィジーを用いた非訓練基質におけるビーズ画像のx-y位置の補正 フィジーでは、訓練されていない基板のビーズ画像と蛍光ビーズのタイムラプススタック画像を開きます。 [ イメージ> スタック] を選択>ツール>連結します。画面にダイアログボックスが表示されます(図7A、1)。 非訓練基板内のビーズ画像と 、Image1 および Image2の蛍光ビーズのタイムラプススタック画像をそれぞれ選択します(図7A、2)。 [OK] をクリックします。非訓練基板中のビーズ画像は、タイムラプススタック画像に追加される(図7A、3)。 スクロールバー(図7B、1、赤枠)を使用して、スタック画像の2番目のフレーム(赤い矢印)を表示します。 StackReg >プラグインを選択します(図7B、2)。画面にダイアログボックスが表示されます(図7B、3)。 ドロップダウン リストから [リジッド ボディ ] を選択し (図 7B、3、赤枠)、[OK] をクリック します。x-y 位置の補正が開始されます。 スクロール バーを使用して、x-y 位置補正スタック イメージの最初のフレームを表示します。 [イメージ>複製]を選択します(図7C、1)。画面にダイアログボックスが表示されます(図7B、2)。 範囲に 1 を入力し、重複スタック (図 7C、2) の選択を解除して、「OK」をクリックします。訓練されていない基板内のx-y位置補正ビーズ画像が画面に表示されます(図7C、3)。このイメージを tiff ファイルとして保存します。 牽引力の定量化注: トラクションフォース解析の方法では、MATLAB と 2 つの MATLAB ツールボックス 「イメージ処理ツールボックス」 と 「並列コンピューティング ツールボックス」を使用します。調査官は、分析の前にそれらをインストールする必要があります。牽引力分析コードはMATLABバージョン2018aに基づいて開発されました。したがって、分析には MATLAB バージョン 2018a (またはそれ以降) を使用する必要があります。牽引力分析に使用したアルゴリズムは、前に22を説明した。 補足ファイル5からトラクションフォース分析コードTFM2021をダウンロードしてください。TFM 2021をMATLABで開く TFM2021で メイン.m を開き、実行します。グラフィカル・ユーザー・インターフェース (GUI) が画面に表示されます (図 8A)。 [訓練されていない基板画像をロード]をクリックし、訓練されていない基板内のx-y位置補正ビード画像を選択します。 蛍光ビーズ画像をロードして、ビーズのタイムラプススタック画像を選択します。 [明視野画像をロード]をクリックし、明視野のタイムラプススタック画像を選択します。 GFP イメージの読み込みをクリックし、EGFP のタイムラプス スタック イメージを選択します。 GUI のドロップダウン リストから GFP を選択します(図 8A、赤いボックス)。 GUI に表示されるセル イメージ上の 2 つのポイントをクリックして、グロース コーンを含む目的の四角形領域 (ROI) を指定するには、[ ROI ] をクリックします(図 8B)。 GUI の [保存 ]ボタンをクリックします(図8A、赤い矢印)。選択したスタック イメージと ROI は、.mat ファイル (MATLAB 形式ファイル) に保存されます。 スポット検出をクリックします。画面にダイアログボックスが表示されます。 ダイアログ ボックスに値 (通常は 50 ~ 150) を入力して、ビード検出のしきい値を決定します。[ OK] を クリックすると、計算が開始されます。 計算が終了したら、 プロットトラック をクリックしてステップ8.12.8で選択した領域を拡大し、検出されたビーズを白い点で表示します(図8C、1)。注:ビード検出(白い点)が蛍光ビーズと重なっているかどうかを確認します。ビード検出は、バックグラウンドノイズを検出することもできます。この外部干渉を軽減するには、スポット検出でしきい値を変更します。さらに、ステップ 8.12.13 で正しいドットを手動で選択します。 [ビーズを選択]をクリックし、成長円錐の下に正しいドットを含むポリゴン領域を区切ります。キーボードの Enter キーを押します。ポリゴン領域内の白い点は赤い色に変わります(図8C、2)。 GUI の [推定力 ] をクリックします。次に、次のパラメータの入力値:ピクセルサイズ、μm/ピクセル;ヤング率、ステップ7.2.5で計算された値。ポアソンの比率、0.3。 計算を開始するために推定力を実行します。ソフトウェアは、計算結果をスプレッドシート形式のファイルに自動的に保存します。注: スプレッドシートには、X 成分、y 成分、および各タイムフレームにおける力の大きさが表示されます(図 8D)。牽引力を定量化するための実践データについては 、補足ファイル6 を参照してください。