Analyses de la dynamique de l’actine, de l’accouplement d’embrayage et de la force de traction pour l’avancement du cône de croissance

Toutes les expériences utilisant des animaux de laboratoire ont été réalisées avec le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut des sciences et de la technologie de Nara. Les chercheurs devraient suivre les lignes directrices établies par leurs comités institutionnels et nationaux de réglementation des animaux pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. 1. Préparation des solutions et des supports Préparer les solutions et les milieux de culture tels que résumés dans le fichier supplémentaire 1 2. Préparation de substrats revêtus de poly-D-lysine (PDL)/laminine Enduire les plats à fond de verre de 14 mm de diamètre avec 100 μg/mL de PDL, dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4), et incuber pendant la nuit dans un incubateur humidifié à 37 °C.REMARQUE: Ne pas sécher les surfaces vitrées après cette étape Retirez la solution PDL et pipetez 1 mL de PBS sur le verre pendant 10 s trois fois. Enduire les plats de laminine de 5 μg/mL, dissous dans du PBS, et incuber toute la nuit dans un incubateur humidifié à 37 °C. Retirer la solution de laminine et pipeter 1 mL de PBS sur le verre pendant 10 s trois fois. Retirez le PBS et placez 0,5 mL du milieu neurobasal sur les surfaces vitrées. Conserver la vaisselle dans un incubateur humidifié à 37 °C.REMARQUE: Les plats enduits de PDL / laminine peuvent être conservés pendant 2-3 jours dans un incubateur humidifié à 37 ° C. 3. Dissection et dissociation de l’hippocampe Euthanasier une souris enceinte par luxation cervicale.REMARQUE : La présente étude utilise des souris disponibles dans le commerce (voir tableau des matériaux). Les chercheurs devraient utiliser des souris élevées et traitées sans cruauté dans un environnement stérilisé. Disséquez les embryons de souris du jour 16 (E16) et placez-les sur de la glace. Dans une hotte à écoulement laminaire, disséquez les cerveaux avec des ciseaux et placez-les sur un plat stérile de 10 cm contenant 10 mL de solution de dissection glacée. Avec un stéréomicroscope à dissection, décollez soigneusement les méninges des hémisphères cérébraux, puis disséquez l’hippocampe à l’aide d’une pince. Transférer l’hippocampe dans 5 mL de solution de digestion glacée dans un tube de 15 mL. Incuber l’hippocampe au bain-marie pendant 20 min à 37 °C. Retirer la solution de digestion et ajouter 3 mL de solution de dissection. Pipettez doucement l’hippocampe quatre fois avec une pipette Pasteur. Incuber l’hippocampe au bain-marie pendant 20 min à 37 °C. Transférer la suspension de la cellule dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. Ajouter 3 mL de nouvelle solution de dissection au tissu non dissocié. Répétez les étapes 3.7-3.9 jusqu’à ce que les hippocampes soient complètement dissociés. Retirez les agrégats flottants d’ADN de la suspension cellulaire en tourbillonnant et en aspirant avec une pipette Pasteur. Centrifuger la suspension de la cellule à 180 x g pendant 20 min à 4 °C.REMARQUE: L’ADN dérivé de cellules endommagées perturbera le processus de centrifugation. Si les neurones restent dans le surnageant, centrifugez à nouveau la suspension cellulaire après avoir soigneusement retiré l’ADN. Équilibrer le milieu neurobasal contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (100 μg/mL) dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2. 4. Transfection et culture des neurones Retirez le surnageant et ajoutez 5 mL de PBS glacé dans le tube de 50 mL. Remettre en suspension la pastille de cellule par pipetage doux. Transférer 10 μL de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation, ajouter 10 μL de solution de bleu de trypan à 0,5%, puis compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre. Centrifuger la suspension de la cellule dans le tube de 50 mL à 180 x g pendant 20 min à 4 °C. En attendant, aliquote pour la transfection, 1 μg de pFN21A-HaloTag-actine et 3 μg de pmNeonGreen-N1-Lifeact pour 1 x 106 cellules, dans un tube de microcentrifugation. Après centrifugation, retirer le surnageant et ajouter 100 μL de milieu d’électroporation (fourni par kit de transfection) dans le tube de 50 mL. Remettre en suspension la pastille de cellule par pipetage. Mélanger la suspension cellulaire avec la solution d’ADN aliquoted et transférer le mélange dans une cuvette (fournie par le kit de transfection).REMARQUE: Puisque les bulles d’air perturbent l’électroporation, retirez-les de la suspension de la cellule. Insérez la cuvette dans l’appareil d’électroporation (Table des matériaux) et effectuez l’électroporation à l’aide du programme O-005. Ajouter immédiatement 1 mL du milieu neurobasal préchauffé et équilibré contenant 10 % de FBS, de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (100 μg/mL) à la cuvette. Transférer la suspension de la cellule dans un tube de centrifugeuse de 15 mL à l’aide d’une pipette en plastique (fournie par le kit de transfection). Transférer 10 μL de la suspension cellulaire dans un microtube, ajouter 10 μL de solution de bleu de trypan à 0,5%, puis compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre. Retirez les plats à fond de verre enduits de PDL / laminine de l’incubateur et retirez le milieu neurobasal. Pipette 0,5 mL de la suspension cellulaire contenant 2,0 x 105 cellules par plat et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 3 h. Remplacer le milieu par 0,5 mL de milieu neurobasal contenant 2 % de supplément de B-27, de glutamine (1 mM), de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (100 μg/mL). Cultiver les neurones dans un incubateur humidifié pendant 3 jours à 37 °C avec 5% de CO2. 5. Imagerie par mouchetures uniques aux cônes de croissance neuronale Le jour in vitro (DIV) 3, traiter les neurones avec du ligand tétraméthyl-rhodamine (TMR) à une dilution de 1:2000 dilution dans un milieu de culture. Maintenir les neurones pendant 1 h à 37 °C avec 5% de CO2. Lavez le ligand TMR trois fois avec du PBS préchauffé. Retirer le PBS et pipeter 0,5 mL de milieu L-15 de Leibovitz réchauffé contenant 2 % de supplément de B-27, de glutamine (1 mM), de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (100 μg/mL). Maintenir les neurones pendant 1 h à 37 °C. Allumez un microscope à épifluorescence et réglez l’incubateur sur scène à 37 °C.REMARQUE: Le présent protocole utilise un microscope à épifluorescence équipé d’une caméra semi-conductrice à oxyde métallique complémentaire, d’un objectif d’immersion dans l’huile 100x / 1,40 NA, d’une lampe au mercure et d’un logiciel d’acquisition d’images (voir tableau des matériaux). D’autres microscopes à épifluorescence avec des spécifications équivalentes peuvent également être utilisés pour cette analyse. Placez les neurones traités par ligand TMR dans la boîte à fond de verre de l’incubateur chauffé. Définissez les paramètres d’acquisition d’image comme suit : temps d’exposition, 500 ms pour les canaux fluorescents Lifeact et HaloTag-actine ; binning, 1 x 1 (0,065 μm × 0,065 μm par pixel); intervalle de temps, 3 s; durée, 50 images. Sélectionnez un cône de croissance qui exprime fortement Lifeact et exprime faiblement HaloTag-actin.REMARQUE: L’expression de Lifeact doit être assez forte pour visualiser la morphologie du cône de croissance. L’expression de HaloTag-actine doit être faible et insuffisante pour être détectée (Figure 2A). Les niveaux d’expression des protéines fluorescentes peuvent être ajustés en faisant varier la quantité d’ADN pour la transfection. Fermez le champ du diaphragme pour éclairer une zone minimale comprenant le cône de croissance (Figure 2B).REMARQUE: L’éclairage d’une zone minimale réduit le signal de fond et augmente le rapport signal de fluorescence sur bruit (S / N), permettant la détection des taches d’actine (Figure 2B). Pour augmenter encore le rapport S / N, il est recommandé d’éclairer le cône de croissance sans réduire la lumière par des filtres à densité neutre. Acquérir des images time-lapse (fichier supplémentaire 2). Enregistrez en tant qu’image de pile time-lapse multicanal (format tiff). 6. Quantifications de la vitesse d’écoulement et du taux de polymérisation de la F-actine à l’aide d’un logiciel de traitement et d’analyse d’images Fidji REMARQUE : Reportez-vous au fichier supplémentaire 3 pour obtenir des données pratiques sur la quantification de la vitesse d’écoulement de la F-actine et du taux de polymérisation de l’actine. Ouvrez l’image de pile time-lapse multicanal sur Fidji. Sélectionnez Analyser > Définir l’échelle, puis définissez la taille en pixels des images. Trouvez une tache d’actine qui s’écoule rétrogradement pendant au moins cinq périodes dans un faisceau de F-actine dans les filopodes ou les lamellipodies. Sélectionnez Image > Transformer > Faire pivoter, puis ajustez l’angle des images de sorte que le faisceau F-actine pointe vers le haut (Figure 3A). Cliquez sur Rectangle dans la barre d’outils et dessinez une boîte qui comprend des taches d’actine et la pointe du faisceau F-actine (Figure 3B, 1 et 2).REMARQUE: Les signaux des taches HaloTag-actine sont faibles. De plus, les signaux Lifeact aux extrémités distales du cône de croissance sont faibles et faibles (Figure 2B) parce que les extrémités distales du cône de croissance sont minces par rapport à la partie proximale. Les chercheurs devraient améliorer les signaux afin d’optimiser les quantifications de la vitesse d’écoulement et du taux de polymérisation de la F-actine (figure 3B). Bien que le signal Lifeact au niveau du cône de croissance proximal devienne saturé, cela ne perturbera pas la détermination de l’extrémité distale des F-actines (Figure 3E, ligne jaune). Sélectionnez Image > Dupliquer et entrez les cinq délais (Figure 3B, 3-5). Sélectionnez Image > Stacks > Make Montage, puis entrez les paramètres suivants : Colonnes, 5 ; Lignes, 1; Facteur d’échelle, 1. Cliquez sur OK. Le montage d’image apparaîtra à l’écran. Sélectionnez Image > Couleur > Couches fractionnées. Cela sépare les deux canaux fluorescents. Quantification de la vitesse d’écoulement de la F-actine. Sélectionnez Analyser > Définir les mesures, puis choisissez Zone et rectangle englobant. Cliquez sur Ovale dans la barre d’outils et dessinez un cercle sur une tache d’actine (Figure 3C, 1 et 2). Sélectionnez Image > Superposition > Ajouter une sélection. Le cercle est superposé sur le montage de l’image (Figure 3C, 3 et 4).REMARQUE : La couleur de la superposition peut être modifiée dans Modifier > Options > Couleurs. Répétez la superposition de cercles pour les taches restantes (Figure 3C, 5).REMARQUE: Pour déterminer avec précision les centres de moucheture d’actine, les enquêteurs doivent superposer des cercles sur les mouchetures. Cliquez sur Droite dans la barre d’outils et tracez une ligne qui relie les centres des cercles (Figure 3D, 1 et 2). Sélectionnez Analyser > mesure. Le résultat apparaîtra à l’écran (Figure 3D, 3).REMARQUE : La hauteur affichée dans le résultat indique la distance de translocation de la moucheture d’actine pendant l’observation (Figure 3D, 3). Calculer la vitesse d’écoulement de l’actine F en divisant la distance de translocation par le temps d’observation. Quantification du taux de polymérisation de la F-actine. Tracez une ligne qui relie les extrémités du faisceau F-actine (Figure 3E, 1). Sélectionnez Analyser > mesure. Le résultat apparaîtra à l’écran (Figure 3E, 2).REMARQUE : La hauteur dans le résultat indique la longueur d’extension du faisceau de F-actine pendant l’observation (Figure 3E, 2). Calculez le taux d’extension de la F-actine en divisant la durée de l’extension par le temps d’observation. Calculer le taux de polymérisation de la F-actine comme la somme de la vitesse d’écoulement de la F-actine et de la vitesse d’extension (Figure 3F). 7. Préparation d’un gel PAA pour la microscopie à force de traction et les cultures de neurones Préparation des gels PAA nécessaires à la microscopie à force de traction (Figure 4) Pipette 0,5 mL de NaOH (100 mM), dissous dans du H2O distillé, sur des plats à fond de verre de 27 mm de diamètre, et incuber pendant 15 min à température ambiante (RT). Ajouter 50 μL de 3-aminopropyltriméthyoxysilane (APTMS) dans la solution de NaOH sur les plats et mélanger les solutions par pipetage doux, et incuber pendant 15 min à TA. Lavez la vaisselle à fond de verre avec du H2O distillé et séchez-les. Pipeter 0,5 mL de solution de glutaraldéhyde à 0,5 %, dissoute dans du PBS, sur la cuve à fond de verre traitée APTMS, et incuber pendant 30 min à TA. Laver la vaisselle à fond de verre avec du H2O distillé et sécher. Préparer une solution contenant du H2O distillé (412 μL), une solution d’acrylamide à 30 % (p/v) (63 μL), une solution de bis-acrylamide à 2,5 % (p/v) (6 μL) et une solution de microsphère modifiée par carboxylate (bille fluorescente) (20 μL).REMARQUE: Vortex la solution de billes fluorescentes pour dissocier les billes agrégées avant de les ajouter à la solution d’acrylamide. Dégazez la solution dans une chambre à vide pendant 30 min à RT. À cette solution, ajouter 1 μL de persulfate d’ammonium (APS) à 10 % (p/v), dissous dans du H2O distillé, et 1 μL de N,N,N’,N’-tétraméthyléthylènediamine (TEMED), et mélanger par pipetage doux. Placez un couvercle en verre (18 mm de diamètre) sur le capuchon d’un tube de centrifugeuse de 15 mL. Ajouter immédiatement 25 μL de la solution sur le couvercle, puis placer doucement un plat à fond de verre inversé sur le couvercle. Laisser l’acrylamide polymériser pendant 1 h à TA. Appliquez du H2O distillé sur le couvercle et retirez-le du gel à l’aide d’une aiguille de seringue avec une pointe pliée. Retirer le H2O et ajouter le sulfo-SANPAH (1 mM), dissous dans le PBS, au gel. Dans des conditions stériles, exposez les gels à la lumière ultraviolette pendant 5 min. Lavez le gel trois fois avec du PBS pendant 15 minutes par lavage. Détermination de la rigidité du gel à l’aide d’une méthode d’indentation de microsphère (figure 5A)44. Transférez une microsphère spécifiée pour le diamètre et la densité au gel, puis placez-la sur l’étage d’échantillon d’un microscope confocal à balayage laser. Concentrez-vous sur la surface du gel et enregistrez la position z (Figure 5B). De même, concentrez-vous sur le fond de la microsphère et enregistrez la position z (Figure 5C). Calculez la profondeur d’indentation déterminée par la différence entre les positions z de la surface du gel et du fond de la microsphère. Calculer le module E de Young du gel par :où f est le poids corrigé de la flottabilité de la microsphère, d est la profondeur d’indentation du gel, r est le rayon de la microsphère et v est le rapport de Poisson (dont la valeur est de 0,3, comme déterminé précédemment46). Enduire les gels de PDL et de laminine comme décrit à la rubrique 2. Comme décrit aux rubriques 3 et 4, disséquer les embryons de souris E16, dissocier l’hippocampe et transfecter avec 5 μg de pEGFP-C1 pour 1,0 x 106 cellules. Semer 2,0 x 105 cellules sur des gels enrobés de PDL/laminine.REMARQUE: Pour l’analyse de la force de traction, l’imagerie microscopique des cellules marquées par fluorescence est nécessaire pour déterminer la zone du cône de croissance. 8. Microscopie à force de traction au niveau des cônes de croissance neuronale Sur DIV3, remplacer le milieu de culture par 0,5 mL de milieu L-15 de Leibovitz réchauffé contenant 2 % de supplément de B-27, de glutamine (1 mM), de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (100 μg/mL). Maintenir les neurones pendant 1 h à 37 °C. Allumez un microscope confocal à balayage laser et réglez l’incubateur sur scène à 37 °C.REMARQUE : La présente étude utilise un microscope confocal à balayage laser équipé d’une lentille d’objectif à immersion dans l’eau de 63 x 1,2 NA et d’un logiciel d’acquisition et d’analyse d’images (voir tableau des matériaux). Placez les neurones dans le plat à fond de verre sur l’incubateur préchauffé. Définissez les paramètres d’acquisition d’image comme suit : taille de numérisation, 512 × 512 pixels ; zone de numérisation, zoom 1,5-3x; vitesse de numérisation, ~ 1 s par image; longueur d’onde laser, 561 nm (longueur d’onde d’excitation pour les billes fluorescentes) et 488 nm (longueur d’onde d’excitation pour la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP)); intervalle de temps, 3 s; durée, 50 images. Pour visualiser la morphologie du cône de croissance, sélectionnez un cône de croissance qui exprime fortement l’EGFP. Concentrez-vous sur la surface du gel et acquérez des images en accéléré (Figure 6A et Fichier supplémentaire 4).REMARQUE: Pour l’analyse de traction, utilisez deux canaux fluorescents (pour les billes fluorescentes et EGFP) et un canal de champ lumineux (la capture d’images de contraste d’interférence différentielle (DIC) ou de contraste de phase est recommandée). Utilisez un logiciel de traitement d’image (par exemple, Fidji) pour produire des piles d’images RVB time-lapse à canal unique et enregistrez ces images sous forme de fichiers tiff.REMARQUE: Il est essentiel que les enquêteurs enregistrent également les données brutes. Appliquer 100 μL de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 % (p/v), dissous dans du H2O distillé, sur la boîte à fond de verre pour détendre le substrat du gel en libérant les neurones du substrat. Incuber le plat pendant 5 min à 37°C pour stabiliser la température.REMARQUE : L’image des billes dans un substrat non contraint est utilisée pour référencer les positions originales des billes lors de l’analyse de la force de traction (Figure 6C). L’application de la solution SDS modifie les positions xyz en raison du changement thermique dans l’incubateur et de la relaxation de la déformation induite par la cellule. Les enquêteurs doivent donc corriger le plan focal et la position x-y. Concentrez-vous sur la surface du gel et obtenez une image des billes dans le substrat non contraint (Figure 6B). Produisez une image RVB monocanal des perles dans le substrat non contraint et enregistrez cette image sous forme de fichier tiff. Correction de la position x-y de l’image de la perle dans le substrat non contraint à l’aide de Fidji Aux Fidji, ouvrez l’image de perle dans le substrat non contraint et l’image de pile time-lapse de perles fluorescentes. Sélectionnez Piles > d’images > Outils > Concaténer. Une boîte de dialogue s’affiche à l’écran (Figure 7A, 1). Sélectionnez l’image de perle dans le substrat non contraint et l’image de pile en accéléré de perles fluorescentes dans Image1 et Image2, respectivement (Figure 7A, 2). Cliquez sur OK. L’image de perle dans le substrat non contraint est ajoutée à l’image de pile time-lapse (Figure 7A, 3). À l’aide de la barre de défilement (Figure 7B, 1, cadre rouge), affichez la deuxième image de l’image de la pile (flèche rouge). Sélectionnez Plugins > StackReg (Figure 7B, 2). Une boîte de dialogue s’affiche à l’écran (Figure 7B, 3). Sélectionnez Corps rigide dans la liste déroulante (Figure 7B, 3, cadre rouge) et cliquez sur OK. La correction de la position x-y commence alors. Utilisez la barre de défilement pour afficher la première image de l’image de pile corrigée de la position x-y. Sélectionnez Image > dupliquer (Figure 7C, 1). Une boîte de dialogue s’affiche à l’écran (Figure 7B, 2). Entrez 1 dans la plage, désélectionnez Pile en double (Figure 7C, 2), puis cliquez sur OK. L’image de perle corrigée de la position x-y dans le substrat non contraint apparaîtra à l’écran (Figure 7C, 3). Enregistrez cette image en tant que fichier tiff. Quantification de la force de tractionREMARQUE : La méthode décrite ici pour l’analyse de la force de traction utilise MATLAB et deux boîtes à outils MATLAB, « Image Processing Toolbox » et « Parallel Computing Toolbox ». Les enquêteurs devront les installer avant l’analyse. Le code d’analyse de la force de traction a été développé sur la base de la version MATLAB 2018a. Par conséquent, MATLAB version 2018a (ou ultérieure) doit être utilisé pour l’analyse. Les algorithmes utilisés pour l’analyse de la force de traction ont été décrits précédemment22. Téléchargez le code d’analyse de la force de traction TFM2021 à partir du fichier supplémentaire 5. Ouvrir TFM 2021 dans MATLAB Ouvrez main.m dans TFM2021 et exécutez-le. Une interface utilisateur graphique (GUI) apparaîtra à l’écran (Figure 8A). Cliquez sur Charger l’image du substrat non tendu et sélectionnez l’image de perle corrigée de la position x-y dans le substrat non contraint. Cliquez sur Charger des images de perles fluorescentes et sélectionnez l’image de pile time-lapse des perles. Cliquez sur Charger les images en champ lumineux et sélectionnez l’image de pile time-lapse de champ lumineux. Cliquez sur Charger les images GFP et sélectionnez l’image de pile time-lapse d’EGFP. Sélectionnez GFP dans la liste déroulante de l’interface graphique (Figure 8A, zone rouge). Cliquez sur ROI pour spécifier la région rectangulaire d’intérêt (ROI), y compris le cône de croissance, en cliquant sur deux points sur l’image de cellule affichée sur l’interface graphique (Figure 8B). Cliquez sur le bouton Enregistrer de l’interface graphique (Figure 8A, flèche rouge). Les images de pile sélectionnées, ainsi que le retour sur investissement, seront enregistrés dans un fichier .mat (fichier au format MATLAB). Cliquez sur Spot detect. Une boîte de dialogue apparaîtra à l’écran. Entrez une valeur (généralement 50-150) dans la boîte de dialogue pour déterminer un seuil de détection de perles. Cliquez sur OK pour lancer le calcul. Une fois le calcul terminé, cliquez sur Tracer la piste pour agrandir la région sélectionnée à l’étape 8.12.8 et afficher les perles détectées sous forme de points blancs (Figure 8C, 1).REMARQUE: Vérifiez si la détection de perles (points blancs) chevauche les perles fluorescentes. La détection de perles peut également détecter un bruit de fond. Pour réduire ces interférences externes, modifiez la valeur de seuil à Détection ponctuelle. En outre, sélectionnez manuellement les points corrects à l’étape 8.12.13. Cliquez sur Sélectionner les perles et délimitez une région polygonale qui comprend les points corrects sous le cône de croissance. Appuyez sur Entrée sur le clavier. Les points blancs dans la région polygonale deviennent rouges (Figure 8C, 2). Cliquez sur Estimer la force sur l’interface graphique. Ensuite, entrez des valeurs pour les paramètres suivants : taille du pixel, μm/pixel ; Module de Young, la valeur calculée à l’étape 7.2.5; Ratio de Poisson, 0,3. Exécutez la force d’estimation pour lancer le calcul. Le logiciel enregistrera automatiquement les résultats de calcul dans un fichier au format feuille de calcul.REMARQUE : La feuille de calcul montre l’amplitude du composant x, du composant y et de la force à chaque période (Figure 8D). Reportez-vous au dossier supplémentaire 6 pour obtenir des données pratiques sur la quantification de la force de traction.