Drosophila melanogaster Larva Enjeksiyon Protokolü
Summary
Drosophila melanogaster yetişkin sinekleri, konakçı antimikrobiyal doğuştan gelen immün yanıtların ve mikrobiyal enfeksiyon stratejilerinin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için model organizmalar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. D. melanogaster larva aşamasını ek veya alternatif bir model sistem olarak tanıtmak için, bir larva enjeksiyon tekniği tanımlanmıştır.
Abstract
Doğuştan gelen bağışıklık ve patojen virülansını incelemek için geleneksel olmayan modellerin kullanılması, maliyetli olabilecek ve etik sorunları gündeme getirebilecek memeli modellerine değerli bir alternatif sunmaktadır. Geleneksel olmayan modeller çok ucuz, kullanımı kolay ve kültürlüdür ve fazla yer kaplamaz. Genetik olarak uygundurlar ve tam genom dizilimlerine sahiptirler ve kullanımları etik bir husus sunmaz. Örneğin, meyve sineği Drosophila melanogaster, çeşitli davranış, gelişim, metabolizma ve bağışıklık araştırmaları hakkında büyük bilgiler sağlamıştır. Daha spesifik olarak, D. melanogaster yetişkin sinekleri ve larvaları, omurgalı hayvanlarla paylaşılan birkaç doğuştan gelen savunma reaksiyonuna sahiptir. İmmün yanıtları düzenleyen mekanizmalar çoğunlukla D. melanogaster modelinde genetik ve moleküler çalışmalarla ortaya konmuştur. Burada, D. melanogaster larvalarında doğuştan gelen bağışıklık süreçlerinin araştırılmasını daha da teşvik edecek ve çok çeşitli mikrobiyal enfeksiyonların patogenezini araştıracak yeni bir larva enjeksiyon tekniği sunulmaktadır.
Introduction
Drosophila melanogaster, biyolojik ve biyomedikal araştırmalarda birkaç on yıldır yoğun bir şekilde kullanılmaktadır, çünkü sofistike genetik ve moleküler araçlar dizisi çok çeşitli çalışmaların analizi için istikrarlı bir şekilde gelişmiştir1,2,3,4. D. melanogaster’deki gelişim, homeostaz ve doğuştan gelen bağışıklığın evrimsel olarak korunmuş yönleri, onu çeşitli insan ve böcek hastalıklarını incelemek için değerli bir model organizma haline getirmiştir5,6. Özellikle, D. melanogaster modelinin bağışıklığı incelemek için temel rolü, yetişkin sinek çalışmalarında büyük ölçüde örneklenmiştir. Bununla birlikte, D. melanogaster larva çalışmaları da mevcut bilgiye katkıda bulunmuş ve esas olarak böcek kütikülünden kaynaklanan yaban arısı ve nematod enfeksiyonları için hücresel bağışıklık tepkilerini araştırmıştır7,8,9,10. Drosophila melanogaster larvaları, topluca hemositler olarak adlandırılan üç farklı kan hücresi tipine sahiptir: plazmatositler, kristal hücreler ve lamellositler11,12,13. Bu hücreler, D. melanogaster larvaları bakteri, mantar, virüs ve parazitler gibi patojenlerle enfekte olduğunda bir dizi bağışıklık tepkisi oluşturabilir14,15,16. Hücresel immün yanıtlar, küçük moleküllerin veya bakterilerin doğrudan yutulmasını (fagositoz), melanizasyonu, parazitoid yumurtalar gibi daha büyük patojenlerin kapsüllenmesini ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve Nitrik oksit sentezlerinin (NOS) üretimini içerir 17,18,19.
Buna karşılık, humoral immün yanıtları analiz etmek için D. melanogaster larva modelinin kullanımı hakkında daha az çalışma yayınlanmıştır. Bunun temel nedeni, D. melanogaster larvalarının oral enfeksiyonu için beslenme tahlillerinin uygulanması ve larvaların hassas bir şekilde ele alınması ve özellikle penetrasyon sırasında mikroiğnenin uygun kullanımı da dahil olmak üzere mikroenjeksiyon larvaları ile ilişkili çeşitli zorluklardır20,21. Bu nedenle, larva enfeksiyonu ve teknik zorluklar (yani yüksek mortalite) hakkındaki sınırlı bilgi, D. melanogaster larva modelinin kullanımını zorlaştırmıştır. Bir larva modeli, konakçı-patojen etkileşimleri ve patojenik enfeksiyonlara karşı spesifik konakçı doğuştan gelen immün yanıtların indüksiyonu hakkında daha fazla bilgi sağlayacak yeni moleküler mekanizmaları tanımlama potansiyeline sahip olacaktır.
Burada, D. melanogaster larvalarını bakteri gibi çeşitli patojenlerle enjekte etmek için kullanılabilecek basit ve etkili bir protokol ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Özellikle, D. melanogaster larvaları, insan patojeni Photorhabdus asymbiotica ve patojenik olmayan bakteri Escherichia coli ile enjeksiyonlar için kullanılır. Bu yöntem, D. melanogaster’in çeşitli mikrobiyal enfeksiyonlara karşı bağışıklık tepkilerinin manipülasyonu ve analizi için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila melanogaster, çeşitli mikrobiyal enfeksiyonların doğuştan gelen bağışıklığı ve patogenezinin araştırılmasında kullanılan en değerli, deneysel olarak manipüle edilmiş modeller arasındadır. Bunun nedeni, basit ve hızlı yaşam döngüsü, laboratuvarda basit bakım, köklü evrimsel genetik ve çeşitli genetik araç kutusudur. Hibrit bir mikroakışkan cihaz veya bir Narishige mikromanipülatörü kullanmak gibi önceki D. melanogaster larva enjeksiyonları yöntemleri, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
George Washington Üniversitesi (GWU) Biyolojik Bilimler Bölümü üyelerine makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz. GT, GWU’dan bir Harlan yaz bursu ile desteklendi. Tüm grafik figürler BioRender kullanılarak yapılmıştır.
Materials
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes – plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
Riferimenti
- Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
- Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
- Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372 (2019).
- Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
- Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214 (2020).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084 (2019).
- Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host’s blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615 (2021).
- Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
- Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724 (2017).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210 (2020).
- Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
- Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
- Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
- Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81 (2015).
- Honti, V., Csordás, G., Kurucz, &. #. 2. 0. 1. ;., Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
- Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676 (2021).
- Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
- Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. Genetica. 214 (1), 3-48 (2020).
- Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101 (2007).
- Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
- Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644 (2013).
- Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16 (2016).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).
