使用捕获测定法检测基于病毒样颗粒（VLP）的疫苗上显示的抗原中和敏感表位

1. 样品制备 在293-F表达培养基中以每mL0.5×106个细胞的低细胞密度播种来自293-F细胞的293-F细胞单独或与env 30协同作用的VLP生产者悬浮细胞系。 让它们在37°C和8%CO 2 下在振荡器培养箱旋转中膨胀3-4天，轨道为5厘米，每分钟135轮（rpm）。 通过以100× g 离心5分钟沉淀生产细胞。使用0.45μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜注射器过滤澄清的上清液以除去残留的细胞和细胞碎片，以获得无细胞细胞培养上清液（CFSN）。注意：协议可以在此处暂停。CFSN可以在4°C下储存过夜。 直接使用CFSN进行实验，或者使用超速离心（112，700× g，4°C，1.5小时）从35 mL CFSN中沉淀VLP。 超速离心后，弃去上清液并将VLP沉淀悬浮在每离心管200μL15%（w / v）海藻糖溶液中。注意：VLP颗粒通常肉眼不可见。该协议可以在此处暂停。VLP可以储存在-80°C。 在VLP捕获测定之前，使用ELISA测定含有VLP的样品中的病毒核心蛋白浓度。此步骤对于标准化捕获测定输入非常重要。 2. VLP捕获测定 注意：工作流的概述如图 2 所示。 通过上下移液或在旋转器上以50 rpm的速度混合至少5分钟来悬浮磁珠。 同时，制备含有bNAbs的抗体溶液。每次反应在200μL抗体结合和洗涤缓冲液中使用10μg每个bNAb（见 材料表）。注意：抗体量可能因所用VLP上bNAb的亲和力和抗原修饰密度而异。 每次反应使用50μL磁珠溶液（见 材料表），并将磁珠转移到1.5mL反应管中。将管子放在磁分离架上。注意：或者，每个管都可以使用一个强力的单磁体来将珠子与上清液分开。 等待几分钟，直到珠子聚集在管壁上，以确保收集所有珠子。除去上清液。 取出磁铁并将磁珠悬浮在步骤2.2中制备的200μLbNAb溶液中。在室温下以50rpm在旋转器上孵育30分钟至3小时。 再次将反应管放入磁分离架中，等待并取出上清液。 从磁铁中取出试管，通过重悬于200μL抗体结合和洗涤缓冲液来洗涤磁珠。 重复步骤 2.4。尽可能多地去除洗涤缓冲液。 将样品加入磁珠结合的bNAbs中。注意：使用HIV衍生颗粒进行捕获测定的VLP输入应为每个反应至少15ng的病毒核心蛋白。VLP量可能因bNAb的亲和力和所用VLP上的抗原修饰密度而异。 如果步骤2.9中添加的样品体积低于1 mL，则加入PBS以将样品体积调节至1 mL。通过移液轻轻悬浮珠子。 将样品和珠子在室温下在旋转器上孵育2.5小时。确保珠子保持在悬浮液中，并且在孵育过程中将溶液充分混合。 将试管放在磁铁上并除去上清液。 通过将磁珠悬浮在200μL洗涤缓冲液中来洗涤磁珠（见 材料表）。重复洗涤步骤三次。 将磁珠悬浮在100μL洗涤缓冲液中，并将悬浮液转移到清洁（耐热）反应管中。 将管子放在磁分离架上（ 见材料表），然后完全除去上清液。 按照步骤2.16.1-2.16.2制备变性SDS-PAGE样品，或按照步骤2.16.3-2.16.5从磁珠中洗脱VLP来制备非变性样品。 为了制备变性的SDS-PAGE样品，将珠子悬浮在20-80μL Laemmli缓冲液（每1ng p55 Gag测定输入0.8μL Laemmli缓冲液）中，并在95°C下孵育5分钟。 直接使用SDS-PAGE或将样品储存在-20°C。注意：Laemmli缓冲液含有2-巯基乙醇和十二烷基硫酸钠。戴上防护手套和护目镜。避免接触皮肤、眼睛和衣服。不要吸入蒸气。在通风良好的空间工作，例如通风橱。注意：协议可以在此处暂停。 或者，执行非变性洗脱步骤以获得具有保留天然蛋白质结构的VLP。 向磁珠中加入25μL洗脱缓冲液（通常与磁珠一起提供），并在室温下孵育2-5分钟。 取出珠子并将洗脱液转移到干净的管中。将洗脱液用于后续测定或将其储存在4°C。注意：协议可以在此处暂停。 3. 分析捕获的 VLP 样本 注：要分析捕获的VLP，请进行SDS-PAGE，然后进行蛋白质印迹分析31，32。 将样品管放在磁性架上，将磁珠与溶液分离。 将每个样品的10μL上样到凝胶的单个孔中。注意：在该协议中，通过使用针对HIV Gag的多克隆兔抗体和继发性多克隆鸡抗兔IgG与辣根过氧化物酶（HRP）抗体偶联来检测病毒p55 Gag核心蛋白。使用化学发光检测可视化病毒核心蛋白。 图2：使用无细胞上清液进行VLP捕获测定的关键步骤示意图。 （1）VLP捕获测定从HIV-1 bNAbs与蛋白质G偶联磁珠的结合开始。同时，制备具有定义p55浓度的VLP溶液。无细胞培养物上清液由p55 Gag VLP、宿主细胞蛋白和核酸的混合物组成。（2）将偶联到bNAbs和VLP溶液的磁珠转移到1.5mL反应管中，然后在旋转下孵育。（3）抗原显示VLP被bNAbs包被的珠子捕获。这些免疫复合物与宿主细胞衍生污染物的分离是在磁场中进行的。（4）通过移液除去上清液，并将磁珠洗涤三次以除去未结合的VLP。（5）在下一步中，将减少蛋白质上样缓冲液加入到由包有bNAbs和捕获的VLP的磁珠组成的免疫复合物中。 （6）煮沸样品可解离bNAbs并从磁珠中靶向抗原并裂解VLP。（8）蛋白质样品经受SDS-PAGE。（9）进行蛋白质印迹分析以检测病毒p55 Gag核心蛋白。请点击此处查看此图的放大版本。