이 프로토콜은 인간 혈액-뇌 장벽(BBB) 시험관내 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 내피 세포와 혈관주위세포는 삽입 필터의 양쪽(혈액 구획)에 파종되고 성상세포는 하단 웰(뇌 구획)에 파종됩니다. 상기 모델 특성화는 나노입자 수송 실험에 사용되었다.
뇌로의 약물 전달은 뇌 실질에 대한 접근을 제어하고 제한하는 혈액-뇌 장벽(BBB)의 매우 특이적이고 제한적인 특성으로 인해 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 그러나 나노 기술의 발달로 약물 전달을 개선하기 위해 새로운 나노 물질의 대형 패널이 개발되어 전임상 분석 프레임에서 뇌 침투를 예측하기 위해 신뢰할 수있는 시험관 내 마이크로 시스템의 필요성이 강조되었습니다. 다음은 인간 세포만을 사용하여 BBB를 모델링하는 미세생리학적 시스템을 설정하는 간단한 방법입니다. 그 구성에서 모델은 뇌 유사 내피 세포 (BREC), 혈관 주위 세포 및 성상 세포를 포함하는 삼중 배양으로 구성되며, 세 가지 주요 BBB 세포 행위자는 화합물을 조일 필요없이 BBB 특성을보다 생리 학적 방식으로 유도하고 조절하는 데 필요합니다. 삼중 배양 6일 후 준비된 12웰 플레이트 형식으로 개발된 이 모델은 물리적 특성, 유전자 및 단백질 발현을 특징으로 하며 고분자 나노겔 수송 측정에 사용됩니다. 이 모델은 건강하고 병리학적인 조건에서 광범위한 실험에 사용할 수 있으며 분자 및 입자 수송의 전임상 평가는 물론 세포 간 및 세포 내 트래피킹에 유용한 도구입니다.
뇌 모세 혈관 내피 세포 (EC) 수준에 국한된 BBB는 뇌 항상성과 신경 세포의 기능을 유지하는 데 중요한 뇌 실질에 대한 접근을 제어하고 조절합니다 1,2. 그러나 뇌 병리학의 경우 뇌 실질에 대한 접근 부족은 치료 전략 개발에 실질적인 장애물을 나타냅니다.
BBB EC는 세포 간 경로 1,2,3을 제어하는 유출 펌프, 특정 수송체 및 수용체 시스템과 관련된 세포 간 공간을 밀봉하는 TJ (tight junction) 단백질을 포함한 복잡한 특성 세트를 가지고 있습니다. 또한, 이러한 모든 특성은 BBB EC 기저막에 내장 된 혈관 주위 세포 및 말단이 뇌 모세 혈관 1,2,3을 둘러싸고있는 성상 세포와의 통신 덕분에 유도되고 유지됩니다. 따라서 BBB를 시험관 내에서 연구하는 것은 구조의 복잡성과 신경 혈관 단위 (NVU)를 구성하는 다양한 세포 유형 간의 통신을 고려할 때 어려운 과제입니다.2. 더욱이, 상이한 세포 유형은 BBB 특성의 유도 및 유지에 중요하며 결과적으로 BBB를 통한 교차의 예측에 영향을 미친다. 뇌로의 약물 전달을 위한 상이한 전략은 BBB제한된 특성4을 우회하기 위한 전술의 큰 패널을 사용하여 이미 테스트되었다. 보다 최근에는 나노 기술의 발전과 함께 약물 운반체 5,6으로 응용하기위한 새로운 재료가 개발되고 있습니다. 더 높은 부하, 독성 감소 및 약물의 생체 이용률 증가 외에도이 새로운 나노 물질은 BBB를 가로 지르고 실질 5,6의 세포를 특이 적으로 표적으로하는 트로이 목마 전략을 위해 기능화 될 수 있습니다. 평가되는 다양한 유형의 나노 물질 중에서 나노 젤은 주로 콜로이드 특성과 자극 반응 특성 7,8,9,10,11,12,13,14,15를 도입하기 위해 화학 구조를 조정할 수있는 능력으로 인해 상당한 관심을 끌었습니다.
시험관내 모델은 현재 약물16의 뇌 침투를 예측하기 위해 인간 세포를 사용하는 전임상 연구를 위해 개발되고 있다. 이러한 모델의 다양한 설정은, 뇌 EC의 단층으로부터 다중 셀 시스템(16)에 이르기까지 이용가능하다. BBB 유도 및 유지에서 NVU 세포의 중요성과 병리학 적 환경에 대한 조정 된 반응을 고려할 때, BBB in vitro 모델은 예측 2,17의 관련성을 향상시키기 위해 이러한 모든 주인공을 고려해야합니다.
현재의 방법은 특정 세포 및 인간 분자 메커니즘을 연구하기 위해 인간 세포와 함께 완전히 개발 된 인간 BBB의 삼중 배양 시험관 내 모델을 설정하는 것을 설명합니다. 생리학적으로 관련되기 위해, 상기 모델은 조임 화합물을 사용하지 않고 BBB 특성을 유도하고 유지하는 데 필요한 BBB의 주요 3개의 세포 행위자(EC, pericytes 및 성상세포)로 구성되며, 시험관내 BBB 모델16,18로서 고려되는 데 필요한 특성 세트를 나타낸다. 이 모델은 혈액 및 뇌 구획을 구분하는 구성으로 설정되며, 뇌 침투를 예측하기 위한 약물 및 입자 수송의 전임상 연구에 적합합니다. 모델의 유용성은 고분자 나노겔의 수송을 측정함으로써 설명된다.
뇌 질환의 치료는 약물이 뇌 실질의 세포 및 분자 표적에 도달하기 위해 BBB를 넘어 장애물을 통과하는 어려움을 고려할 때 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다.
뇌 질환에 대한 약물 개발은 전임상 모델에서 유망한 결과를 나타내는 대부분의 약물이 클리닉에서 사용될 때 어떤 이점도 보여주지 못했기 때문에 현재 낮은 성공률을 보입니다. 실험에 사용되는 동물의 수를 줄이는 것을 목표로하는 “3R 규칙”에 따라, BBB의 시험관 내 모델은 뇌 병리를 연구하고 약물29의 뇌 침투를 예측하기 위해 개발된다. BBB의 시험관내 모델은 주로 동물 세포를 사용하여 개발되었으며 얻어진 결과의 관련성을 향상시키기 위해 더욱 정교해졌습니다(16). 인간 세포 사용의 중요한 발전 중 하나는 인간 질병 메커니즘을 연구하기 위해 세포 및 분자 수준에서 부인할 수없는 새로운 통찰력과 더 많은 특이성을 제공합니다16. 그러나 관련 모델의 개발은 동물 모델 덕분에 BBB in vitro 모델 설정의 개선과 발생하는 지식을 고려해야합니다. 따라서, BBB 아키텍처의 복잡성 및 생리학적 및 병리학적 조건 하에서 BBB를 연구하기 위한 세포-세포 통신의 중요성을 고려할 필요가 있다(30).
여기에 제시된 프로토콜은 뇌 조직에 대한 접근의 제한 없이 BBB의 세 가지 주요 세포 유형을 포함하는 완전한 인간 BBB 시험 관내 모델을 설정하는 방법을 기술한다. 다중 세포 시스템으로서, BBB 특성의 유도 및 유지는, 조임 화합물의 인위적인 사용 없이, 그러나 세포-세포 통신에 의해 유도되는 대신에 BBB 특성의 생체내 유도와 일치하고 보다 생리학적으로 관련된다31. 따라서 프로토콜의 연대기에 대한 존중은 프로토콜의 성공을 위해 가장 중요합니다. 더욱이, 삼중 배양의 설정 동안의 배양 시간 및 일단 3개의 세포 유형이 조립되면 프로토콜의 주요 중요 단계를 나타낸다.
ECs에서의 BBB 특성은 공동-배양 모델24에 대해 설명된 바와 같이, 주위세포와의 공동-배양에 의해 유도된다. 따라서 삽입 필터의 뒷면에서 혈관 주위 세포의 배양이 가장 중요한 지점이며 BBB 특성의 유도를 위해 충분한 주변 세포가 없을 위험이 있으므로 프로토콜을 엄격하게 따라야합니다. 우선, 코팅 절차 및 세포 파종 중에 페트리 접시의 덮개가 코팅과 접촉하지 않도록주의해야하며 세포가 파종되면 여과기의 양호한 코팅을 보장하고 세포를 잃지 않도록 배지를 넣어야합니다 (2.2.1 및 2.2.4 단계). 또한, pericytes가 파종되면, 다른 쪽에서 EC의 코팅 및 파종을 위해 삽입 필터를 되돌리기 전에 pericytes의 부착을 위해 표시된 시간 (단계 2.2.4)을 기다리는 것이 필수적입니다 (단계 2.2.5 및 2.3). 일단 파종되면, 세포-세포 통신을 통해 BBB 특성을 유도하기 위해 6일이 필요하다(단계 2.4).
삼중 배양 모델의 EC는 검증된 공동 배양 모델과 유사한 BBB 무결성 마커에 대한 투과성 값을 표시하고 검증된 동물 또는 인간 모델 16,27,32에서도 측정되기 때문에 모델은 제한된 투과성(단단한 접합부의 설정과 관련됨) 측면에서 검증됩니다. 더욱이, 시험관내 BBB 모델의 검증은 제한된 투과성 이외에, NVU의 다른 세포 유형에 대한 반응성 및 기능적 수용체 및 수송체(16)의 발현을 요구한다. 또한 이 모델은 재현 가능하며 여러 삽입 필터와 웰을 생성하여 세포 분류 방법 없이 각 세포 유형에 대해 개별적으로 수많은 분석(유전자 및 단백질 발현, 형광 염색, 독성 테스트)을 수행합니다.
이 모델은 0.4μm 공극 크기 필터를 사용하여 개발되어 삽입 필터의 각 측면에 하나의 셀 유형이 있습니다. 삽입 필터 시스템은 생리적 조건에서 세포-세포 통신을 잘 포함된 성상세포에 전달하여 연구할 수 있었습니다. 시스템 내의 성상교세포의 존재는 초기 시험관내 공동 배양 모델24와 비교하여 플러스 값을 나타낸다. 실제로, BBB의 생리학에서 성상 세포의 중요성을 고려할 때,이 세 번째 세포 유형은 BBB 내의 세포 – 세포 통신에 대한 더 깊은 이해를 가능하게합니다. 또한, 삼중 세포 배양 시스템은 성상 세포가 필수적인 역할을하는 뇌졸중과 같은 병리학 적 상태에서도 연구 될 수있다(33,34,35). 또한, 삽입 필터의 양면에 있는 BLEC/pericytes의 디자인은 뇌암(23)과 같은 병리학적 상태를 모방하기 위해 다른 세포 유형 상에 용이하게 배치될 수 있다.
삽입 필터의 기공 크기는 BBB를 가로지르는 세포 이동과 같은 일부 실험에서 제한을 가져올 수 있습니다. 그러나, 더 큰 공극 크기를 갖는 모델의 개발은 다중 층이 아닌 ECs의 생리학적 단층의 형성을 보장하기 위한 프로토콜의 적응을 필요로 하며, 이는 BBB36을 모방하는 것과 생리학적으로 관련이 없다.
이 모델의 적용 가능성은 다세포 시스템을 사용하여 수송 실험을 수행 할 수있는 가능성을 보여주는 NG 수송 실험을 사용하여 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고 각 나노 구조가 고유한 특성 세트(분자량, 전하, 모양, 물리적 특성, 단백질 코로나 형성)를 나타내기 때문에 NG와 유사한 특성을 공유하는 수송 실험을 위한 대조 화합물 또는 분자를 갖는 데 어려움이 있음을 인식해야 합니다.
상기 모델의 하나의 한계는 전단 응력의 부재이며, 이는 ECs의 분화 및 TJ 단백질37의 발현에 영향을 미치는 것으로 입증되었다. 그러나 뇌 모세관을 모방 한 유체 시스템을 개발하는 것은 다중 세포 시스템에서 특정 장치가 필요한 유체 부분을 추가하는 복잡성을 고려할 때 어렵습니다. 더욱이, 특정 장치는 일반적으로 상업적으로 이용 가능하지 않으며 많은 복제를 허용하지 않으므로 유체 시스템이 고 처리량 사용에 적합하지 않습니다.
요약하면, 인간 세포로 구성된이 삼중 배양 시스템은 BBB의 구조를 시험관 내에서 재현합니다. 화합물의 광범위한 스크리닝에 사용할 수 있는 많은 인서트를 생성할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 NANOSTEM 프로젝트의 일환으로 Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (ITN) (Fellowship Eleonora Rizzi)의 보조금 계약 No 764958에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램에 의해 부여됩니다. 이 연구는 ‘Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais'(Clémence Deligne에 대한 펠로우십), “Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l’Enfant et de l’adolescent”(SFCE), Association “l’étoile de Martin”및 Association”Cassandra contre la leucémie”에 의해 부여됩니다.
Cell Culture | |||
Astocyte Medium (AM) | ScienCell | 1801 | |
Astrocyte Growth Supplement | ScienCell | 1852 | Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set. |
Cell culture dish 100 mm | Corning | 430293 | 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting |
Cell culture dish 150 mm | Corning | 430599 | The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model. |
Collagen I | Corning | 354236 | Rat tail |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 31600-083 | Powder |
Endothelial Cell Growth Supplement | ScienCell | 1051 | Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set. |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fetal Calf Serum | Sigma | F7524 | |
Gelatin | Sigma | G2500 | 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF |
Gentamicin | BiochromA6 | A-2712 | |
Glucose | Sigma | G6152 | Powder |
Glutamine | Merck | 1002891000 | |
Human Brain Cortex Astrocytes | ScienCell | 1800-SC | |
Malassez cell counting chamber | vWR | HECH40453702 | The count was performed manually. |
Matrigel | Corning | 354230 | Extracellular matrix-based hydrogel |
Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 0503 | Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets. |
Poly-L-lysine | ScienCell | 0413 | |
Steritop | Millipore System | SCGPT0SRE | 0.22 µm pore size |
Transwell insert | Corning | 3401 | 0.4 µm pore polycarbonate filter |
Trypsin/EDTA neutralization solution | ScienCell | 0113 | |
Trypsin/EDTA solution | ScienCell | 0103 | |
Immunocytochemistry | |||
SEA BLOCK blocking buffer | ThermoScientific | 37527 | |
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody | Thermofisher | A11031 | Dilution 1:500 |
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody | Thermofisher | A11036 | Dilution 1:500 |
Anti-Claudin-5 primary antibody | InVitrogen | 34-1600 | Dilution 1:100 |
Anti-Desmin primary antibody | Abcam | ab6322 | Dilution 1:200 |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody | Dako | Z0334 | Dilution 1:500 |
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody | Abcam | ab51090 | Dilution 1:200 |
Anti-VE-cadherin primary antibody | Abcam | ab207732 | Dilution 1:200 |
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody | InVitrogen | 61-7300 | Dilution 1:200 |
Normal Goat Serum | Sigma | G6767 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36962 | |
Gene expression | |||
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit | Macherey-Nagel | 740,933,250 | |
96 multiplate well | Biorad | HSP9601 | |
iSCRIPT | Biorad | 1708841 | |
Sealer sheet | Biorad | MSB1001 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | Biorad | 172-5201 | |
Protein expression | |||
2x Laemli Sample Buffer | Biorad | 161-0737 | Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay. |
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody | Abcam | ab207732 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Claudin-5 primary antibody | Abcam | ab15106 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody | Millipore | 07-1401 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Mouse secondary antibody | Dako | P0447 | Dilution 1:5000 in TBS-Tween |
Anti-P-glycoprotein primary antibody | Genetex | GTX23364 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT |
Anti-Rabbit secondary antibody | Dako | P0448 | Dilution 1:8000 in TBS-Tween |
Anti-Transferrin Receptor primary antibody | Abcam | ab84036 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Zona occludens-1 primary antibody | Abcam | ab216880 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Criterion TGX Gel | Biorad | 5678083 | |
ECL Prime Solution | Amersham | RPN2236 | Revelation solution to keep in the dark |
Phospatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
Phospatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
Protease Inhibitor | Sigma | P8340 | |
Protein Standards | Biorad | 161-0373 | Molecular weight markers |
RIPA 10x | Millipore | 20-188 | |
TBS 10x | Biorad | 1706435 | |
TRIS-Glycine | Biorad | 1610771 | |
Tween | Biorad | 1706531 | |
BBB integrity assay | |||
Sodium Fluorescein | Ampresco | 0681 | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Elacridar | Sigma | SML0486 | GF120918 |
FITC-Dextran 20 kDa | Sigma | FD-20S | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Rhodamine 123 | Sigma | R8004 | λex= 501 nm; λem= 538 nm |
SynergyTM H1 | BioTek Instruments | Fluorescent multiplate reader | |
Nanogel Transport | |||
Syringe | Terumo | SS+01T1 | 1 mL syringe |
Filter | FisherScientific | 15161499 | 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter |
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels | The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. |