Dit protocol beschrijft een methode om een menselijk bloed-hersenbarrière (BBB) in vitro model vast te stellen. De endotheelcellen en pericyten worden aan elke kant van een insertfilter (bloedcompartiment) gezaaid en astrocyten worden in de onderste put (hersencompartiment) gezaaid. Het gekarakteriseerde model werd gebruikt voor nanodeeltjestransportexperimenten.
De levering van medicijnen aan de hersenen blijft een uitdaging vanwege de zeer specifieke en beperkende eigenschappen van de bloed-hersenbarrière (BBB), die de toegang tot het hersenparenchym regelt en beperkt. Met de ontwikkeling van nanotechnologieën werden echter grote panels van nieuwe nanomaterialen ontwikkeld om de toediening van geneesmiddelen te verbeteren, wat de noodzaak benadrukte van betrouwbare in vitro microsystemen om hersenpenetratie te voorspellen in het kader van preklinische testen. Hier is een eenvoudige methode om een microfysiologisch systeem op te zetten om de BBB te modelleren met uitsluitend menselijke cellen. In zijn configuratie bestaat het model uit een drievoudige cultuur, waaronder hersenachtige endotheelcellen (BCC’s), pericyten en astrocyten, de drie belangrijkste BBB-cellulaire actoren die nodig zijn om de BBB-eigenschappen op een meer fysiologische manier te induceren en te reguleren zonder de vereiste van aanscherpingsverbindingen. Het model ontwikkeld in een 12-wells plaatformaat, klaar na 6 dagen drievoudige cultuur, wordt gekenmerkt door fysische eigenschappen, gen- en eiwitexpressies en gebruikt voor polymere nanogel-transportmeting. Het model kan worden gebruikt voor een uitgebreid scala aan experimenten in gezonde en pathologische omstandigheden en vormt een waardevol hulpmiddel voor preklinische beoordelingen van molecuul- en deeltjestransport, evenals inter- en intracellulaire handel.
De BBB, gelokaliseerd op het niveau van hersencapillaire endotheelcellen (EC’s), controleert en reguleert de toegang tot het hersenparenchym, wat cruciaal is voor het handhaven van de homeostase van de hersenen en de functie van neurale cellen 1,2. In het geval van hersenpathologie vormt het gebrek aan toegang tot het hersenparenchym echter een echt obstakel voor het ontwikkelen van therapeutische strategieën.
De BBB EC’s bezitten een complexe reeks eigenschappen, waaronder tight junction (TJ) eiwitten, die de intercellulaire ruimte afdichten, geassocieerd met een systeem van effluxpompen, specifieke transporters en receptoren, die de transcellulaire routeregelen 1,2,3. Bovendien worden al deze eigenschappen geïnduceerd en onderhouden, dankzij communicatie met de pericyten ingebed in het BBB EC-keldermembraan en de astrocyten, waarvan de eindvoeten de hersencapillairen omringen 1,2,3. Daarom is het bestuderen van de BBB in vitro een uitdaging gezien de complexiteit van de architectuur en de communicatie tussen de verschillende celtypen die de neurovasculaire eenheid (NVU)2 vormen. Bovendien zijn de verschillende celtypen cruciaal voor de inductie en het onderhoud van BBB-eigenschappen en hebben ze bijgevolg invloed op de voorspelling van de kruising door de BBB. Verschillende strategieën voor medicijnafgifte aan de hersenen werden al getest met behulp van een groot aantal tactieken om de BBB-beperkte eigenschappen te omzeilen4. Meer recent, met de vooruitgang van nanotechnologieën, worden nieuwe materialen ontwikkeld voor toepassingen als medicijndragers 5,6. Naast hun hogere belasting, verminderde toxiciteit en verhoogde biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen, kunnen deze nieuwe nanomaterialen worden gefunctionaliseerd voor een Trojaanse paard-strategie om de BBB te passeren en specifiek cellen in het parenchym te richten 5,6. Onder de verschillende soorten nanomaterialen die worden geëvalueerd, hebben nanogels veel aandacht getrokken, voornamelijk vanwege hun colloïdale eigenschappen en het vermogen om de chemische structuur aan te passen om stimuli-responsieve eigenschappen te introduceren 7,8,9,10,11,12,13,14,15.
In vitro modellen zijn nu ontwikkeld voor preklinische studies met behulp van menselijke cellen om de hersenpenetratie van geneesmiddelente voorspellen 16. Er zijn verschillende instellingen van deze modellen beschikbaar, van monolagen van hersen-EC’s tot meerdere celsystemen16. Gezien het belang van de NVU-cellen in de BBB-inductie en -onderhoud en de gecoördineerde respons op de pathologische omgeving, moeten BBB-in vitromodellen rekening houden met al deze protagonisten om de relevantie van de voorspelling te verbeteren 2,17.
De huidige methode beschrijft het opzetten van een triple culture in vitro model van de menselijke BBB, dat volledig is ontwikkeld met menselijke cellen om specifieke cellulaire en menselijke moleculaire mechanismen te bestuderen. Om fysiologisch relevant te zijn, bestaat het model uit de drie belangrijkste cellulaire actoren van de BBB (EC’s, pericyten en astrocyten) die nodig zijn om de BBB-eigenschappen te induceren en te behouden, zonder het gebruik van aanscherpingsverbindingen en het vertonen van een reeks eigenschappen die nodig zijn om te worden beschouwd als een in vitro BBB-model16,18. Het model is opgezet in een configuratie die het bloed- en hersencompartiment afbakent, geschikt voor preklinische studies van medicijn- en deeltjestransport om hersenpenetratie te voorspellen. Het nut van het model wordt geïllustreerd door het transport van polymere nanogels te meten.
Behandeling van hersenziekten blijft een uitdaging gezien de moeilijkheid van de medicijnen om over de BBB te lopen om hun cellulaire en moleculaire doelen in het hersenparenchym te bereiken.
De ontwikkeling van geneesmiddelen voor hersenziekten vertoont momenteel een laag slagingspercentage, omdat de meeste geneesmiddelen met veelbelovende resultaten in preklinische modellen geen enkel voordeel vertoonden bij gebruik in de kliniek. Volgens de “3R-regel”, die gericht is op het verminderen van het aantal dieren dat voor experimenten wordt gebruikt, worden in vitro modellen van de BBB ontwikkeld om hersenpathologieën te bestuderen en de hersenpenetratie van geneesmiddelente voorspellen 29. In vitro modellen van BBB zijn voornamelijk ontwikkeld met behulp van dierlijke cellen en zijn geavanceerder geworden om de relevantie van de verkregen resultaten te verbeteren16. Een van de belangrijke vooruitgang in het gebruik van menselijke cellen, die onmiskenbare nieuwe inzichten en meer specificiteit brengt, op cellulair en moleculair niveau, om menselijke ziektemechanismen te bestuderen16. De ontwikkeling van relevante modellen vereist echter dat rekening wordt gehouden met de verbetering van de BBB in vitro modelinstellingen en de kennis die ontstaat, dankzij diermodellen. Daarom moet het rekening houden met de complexiteit van de BBB-architectuur en het belang van de cel-celcommunicatie om de BBB onder fysiologische en pathologische omstandigheden tebestuderen 30.
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een methode om een volledig humaan BBB in vitro model op te zetten dat de drie belangrijkste celtypen van de BBB omvat, zonder beperking van de toegang tot hersenweefsel. Als een meervoudig celsysteem is de inductie en het onderhoud van BBB-eigenschappen, zonder het kunstmatige gebruik van aanscherpingsverbindingen, maar in plaats daarvan geïnduceerd door cel-celcommunicatie fysiologisch relevanter en in overeenstemming met de in vivo inductie van de BBB-eigenschappen31. Daarom is het respecteren van de chronologie van het protocol van het grootste belang voor het succes van het protocol. Bovendien vertegenwoordigen de incubatietijden tijdens het instellen van de drievoudige cultuur en zodra de drie celtypen zijn samengesteld de belangrijkste kritieke stappen van het protocol.
De BBB-eigenschappen in EC’s worden geïnduceerd door de co-cultuur met pericyten, zoals beschreven voor het co-kweekmodel24. Daarom is de cultuur van pericyten aan de achterkant van het insertfilter het meest kritieke punt en vereist het strikt volgen van het protocol met het risico dat het niet genoeg pericyten heeft voor de inductie van de BBB-eigenschappen. Allereerst moet tijdens de coatingprocedure en ook celzaaien aandacht worden besteed aan het niet in contact brengen van de afdekking van de petrischaal met de coating en ook het medium zodra de cellen zijn gezaaid om een goede coating van het filter te garanderen en geen cellen te verliezen (stappen 2.2.1 en 2.2.4). Bovendien is het, zodra de pericyten zijn gezaaid, van essentieel belang om de aangegeven tijd te wachten voor de bevestiging van de pericyten (stap 2.2.4) voordat het inzetfilter voor het coaten en zaaien van EC’s aan de andere kant wordt teruggedraaid (stappen 2.2.5 en 2.3). Eenmaal gezaaid, zijn zes dagen nodig om de BBB-eigenschappen te induceren via cel-celcommunicatie (stap 2.4).
Het model is gevalideerd in termen van beperkte permeabiliteit (geassocieerd met de instelling van de tight junctions) aangezien de EC’s van het triple culture model permeabiliteitswaarden weergeven voor BBB-integriteitsmarkers vergelijkbaar met het gevalideerde co-kweekmodel en ook gemeten in gevalideerde dier- of menselijke modellen 16,27,32. Bovendien vereist de validatie van een in vitro BBB-model, naast de beperkte permeabiliteit, de responsiviteit op andere celtypen van de NVU en de expressie van functionele receptoren en transporters16. Bovendien is het model reproduceerbaar en produceert het meerdere insertfilters en putten om talloze analyses (gen- en eiwitexpressie, fluorescerende kleuring, toxiciteitstests) op elk celtype afzonderlijk uit te voeren zonder dat een celsorteermethode nodig is.
Het model is ontwikkeld met behulp van een 0,4 μm poriegroottefilter om één celtype aan elke kant van het insertfilter te hebben. Het insertfiltersysteem maakte de studie van cel-celcommunicatie in fysiologische omstandigheden mogelijk door het over te brengen op goed bevattende astrocyten. De aanwezigheid van astrocyten in het systeem vertegenwoordigt een pluswaarde in vergelijking met het initiële co-kweek in vitro model24. Inderdaad, gezien het belang van astrocyten in de fysiologie van de BBB, maakt dit derde celtype verder begrip mogelijk van de cel-celcommunicatie binnen de BBB. Bovendien kan het drievoudige celkweeksysteem ook worden bestudeerd in pathologische omstandigheden zoals beroerte, waarbij de astrocyten een essentiële rol spelen 33,34,35. Bovendien kan het ontwerp van BCC’s / pericyten aan beide zijden van het insertfilter gemakkelijk op andere celtypen worden geplaatst om pathologische aandoeningen zoals hersenkanker na te bootsen23.
De poriegrootte van het insertfilter kan beperkingen met zich meebrengen bij sommige experimenten, zoals celtransmigratie over de BBB. De ontwikkeling van het model met een grotere poriegrootte vereist echter de aanpassing van het protocol om de vorming van een fysiologische monolaag van EC’s te garanderen en niet meerdere lagen, wat fysiologisch niet relevant is om de BBB36 na te bootsen.
De toepasbaarheid van het model is aangetoond met behulp van het NGs-transportexperiment dat de mogelijkheid biedt om transportexperimenten uit te voeren met behulp van een meercellig systeem. Niettemin moet men zich bewust zijn van de moeilijkheden bij het hebben van een controleverbinding of molecuul voor het transportexperiment, waarbij vergelijkbare eigenschappen worden gedeeld met NG’s, omdat elke nanostructuur een unieke reeks eigenschappen vertoont (molecuulgewicht, lading, vorm, fysische eigenschappen, eiwitcoronavorming).
Een beperking van het model is de afwezigheid van schuifspanning, waarvan werd aangetoond dat het de differentiatie van EC’s en de expressie van TJ-eiwitten beïnvloedt37. Het ontwikkelen van een vloeibaar systeem dat het capillair van de hersenen nabootst, is echter een uitdaging gezien de complexiteit van het toevoegen van een vloeibaar deel, waarvoor een specifiek apparaat nodig is, in een systeem met meerdere cellen. Bovendien is het specifieke apparaat meestal niet in de handel verkrijgbaar en staat het niet veel replicaties toe, waardoor fluidic-systemen minder geschikt zijn voor gebruik met hoge doorvoer.
Samenvattend reproduceert dit drievoudige kweeksysteem bestaande uit menselijke cellen in vitro de architectuur van de BBB. Het maakt het mogelijk om veel inserts te genereren die kunnen worden gebruikt voor uitgebreide screening van verbindingen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt toegekend door het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie onder subsidieovereenkomst nr. 764958, als onderdeel van het NANOSTEM-project, een Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (ITN) (Fellowship Eleonora Rizzi). Deze studie wordt toegekend door de “Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais” (Fellowship aan Clémence Deligne), de “Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l’Enfant et de l’adolescent” (SFCE), de Association “l’étoile de Martin” en de Association “Cassandra contre la leucémie”.
Cell Culture | |||
Astocyte Medium (AM) | ScienCell | 1801 | |
Astrocyte Growth Supplement | ScienCell | 1852 | Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set. |
Cell culture dish 100 mm | Corning | 430293 | 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting |
Cell culture dish 150 mm | Corning | 430599 | The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model. |
Collagen I | Corning | 354236 | Rat tail |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 31600-083 | Powder |
Endothelial Cell Growth Supplement | ScienCell | 1051 | Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set. |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fetal Calf Serum | Sigma | F7524 | |
Gelatin | Sigma | G2500 | 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF |
Gentamicin | BiochromA6 | A-2712 | |
Glucose | Sigma | G6152 | Powder |
Glutamine | Merck | 1002891000 | |
Human Brain Cortex Astrocytes | ScienCell | 1800-SC | |
Malassez cell counting chamber | vWR | HECH40453702 | The count was performed manually. |
Matrigel | Corning | 354230 | Extracellular matrix-based hydrogel |
Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 0503 | Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets. |
Poly-L-lysine | ScienCell | 0413 | |
Steritop | Millipore System | SCGPT0SRE | 0.22 µm pore size |
Transwell insert | Corning | 3401 | 0.4 µm pore polycarbonate filter |
Trypsin/EDTA neutralization solution | ScienCell | 0113 | |
Trypsin/EDTA solution | ScienCell | 0103 | |
Immunocytochemistry | |||
SEA BLOCK blocking buffer | ThermoScientific | 37527 | |
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody | Thermofisher | A11031 | Dilution 1:500 |
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody | Thermofisher | A11036 | Dilution 1:500 |
Anti-Claudin-5 primary antibody | InVitrogen | 34-1600 | Dilution 1:100 |
Anti-Desmin primary antibody | Abcam | ab6322 | Dilution 1:200 |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody | Dako | Z0334 | Dilution 1:500 |
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody | Abcam | ab51090 | Dilution 1:200 |
Anti-VE-cadherin primary antibody | Abcam | ab207732 | Dilution 1:200 |
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody | InVitrogen | 61-7300 | Dilution 1:200 |
Normal Goat Serum | Sigma | G6767 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36962 | |
Gene expression | |||
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit | Macherey-Nagel | 740,933,250 | |
96 multiplate well | Biorad | HSP9601 | |
iSCRIPT | Biorad | 1708841 | |
Sealer sheet | Biorad | MSB1001 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | Biorad | 172-5201 | |
Protein expression | |||
2x Laemli Sample Buffer | Biorad | 161-0737 | Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay. |
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody | Abcam | ab207732 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Claudin-5 primary antibody | Abcam | ab15106 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody | Millipore | 07-1401 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Mouse secondary antibody | Dako | P0447 | Dilution 1:5000 in TBS-Tween |
Anti-P-glycoprotein primary antibody | Genetex | GTX23364 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT |
Anti-Rabbit secondary antibody | Dako | P0448 | Dilution 1:8000 in TBS-Tween |
Anti-Transferrin Receptor primary antibody | Abcam | ab84036 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Zona occludens-1 primary antibody | Abcam | ab216880 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Criterion TGX Gel | Biorad | 5678083 | |
ECL Prime Solution | Amersham | RPN2236 | Revelation solution to keep in the dark |
Phospatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
Phospatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
Protease Inhibitor | Sigma | P8340 | |
Protein Standards | Biorad | 161-0373 | Molecular weight markers |
RIPA 10x | Millipore | 20-188 | |
TBS 10x | Biorad | 1706435 | |
TRIS-Glycine | Biorad | 1610771 | |
Tween | Biorad | 1706531 | |
BBB integrity assay | |||
Sodium Fluorescein | Ampresco | 0681 | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Elacridar | Sigma | SML0486 | GF120918 |
FITC-Dextran 20 kDa | Sigma | FD-20S | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Rhodamine 123 | Sigma | R8004 | λex= 501 nm; λem= 538 nm |
SynergyTM H1 | BioTek Instruments | Fluorescent multiplate reader | |
Nanogel Transport | |||
Syringe | Terumo | SS+01T1 | 1 mL syringe |
Filter | FisherScientific | 15161499 | 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter |
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels | The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. |