Kontrolle der Zelladhäsion mit Hydrogel-Patterning-Techniken für Anwendungen in der Zugkraftmikroskopie
Summary
Nah-UV-Lithographie und Zugkraftmikroskopie werden kombiniert, um zelluläre Kräfte auf mikrostrukturierte Hydrogele zu messen. Die gezielte lichtinduzierte Freisetzung einzelner Zellen ermöglicht eine hohe Anzahl von Messungen an derselben Probe.
Abstract
Die Zugkraftmikroskopie (TFM) ist die Hauptmethode in der Mechanobiologie zur Messung von Zellkräften. Üblicherweise wird dies für Zellen verwendet, die an flachen weichen Substraten haften, die sich unter der Zelltraktion (2D-TFM) verformen. TFM setzt auf lineare elastische Materialien wie Polydimethylsiloxan (PDMS) oder Polyacrylamid (PA). Für 2D-TFM auf PA resultiert die Schwierigkeit, einen hohen Durchsatz zu erreichen, hauptsächlich aus der großen Variabilität der Zellformen und -traktionen, die eine Standardisierung erfordert. Wir stellen ein Protokoll zur schnellen und effizienten Herstellung von mikrostrukturierten PA-Hydrogelen für 2D-TFM-Studien vor. Die Mikromuster werden zunächst durch maskenlose Photolithographie mit nahezu UV-Licht erzeugt, bei der extrazelluläre Matrixproteine nur an die mikrostrukturierten Regionen binden, während der Rest der Oberfläche für Zellen nicht adhäsiv bleibt. Die Mikrostrukturierung von extrazellulären Matrixproteinen ist auf das Vorhandensein von aktiven Aldehydgruppen zurückzuführen, was zu adhäsiven Regionen unterschiedlicher Form führt, die entweder einzelne Zellen oder Zellgruppen aufnehmen. Für TFM-Messungen verwenden wir PA-Hydrogele unterschiedlicher Elastizität, indem wir die Mengen an Acrylamid und Bis-Acrylamid variieren und die Verschiebung eingebetteter Fluoreszenzperlen verfolgen, um Zelltraktionsfelder mit der regularisierten Fourier-Transformations-Traktionszytometrie (FTTC) zu rekonstruieren.
Um eine weitere präzise Erfassung der Zellkräfte zu erreichen, beschreiben wir die Verwendung einer kontrollierten Dosis von gemustertem Licht, um Zelltraktionen in definierten Regionen für einzelne Zellen oder Zellgruppen freizusetzen. Wir nennen diese Methode lokale UV-Beleuchtung Zugkraftmikroskopie (LUVI-TFM). Bei der enzymatischen Behandlung werden alle Zellen gleichzeitig von der Probe getrennt, während mit LUVI-TFM Zugkräfte von Zellen in verschiedenen Bereichen der Probe nacheinander aufgezeichnet werden können. Wir demonstrieren die Anwendbarkeit dieses Protokolls (i) zur Untersuchung der Zelltraktionskräfte als Funktion der kontrollierten Haftung am Substrat und (ii) zur Erzielung einer größeren Anzahl experimenteller Beobachtungen aus derselben Probe.
Introduction
Bei der Interaktion mit ihrer extrazellulären Umgebung üben adhärente Zellen Kräfte aus, die hauptsächlich durch Integrin-basierte fokale Adhäsionen vermittelt werden, die die extrazelluläre Matrix (ECM) mit dem Aktinzytoskelett verbinden. Fokale Adhäsionen sind Multiproteinanordnungen, die sich um die Bindung von Integrinen an ECM-Proteine wie Fibronektin und Kollagen drehen. Integrin-Clustering und Wachstum von fokalen Adhäsionen ist nicht nur für den Aufbau einer mechanisch stabilen Verbindung von entscheidender Bedeutung, sondern auch für die Rekrutierung anderer fokaler Adhäsionsproteine, einschließlich solcher, die den RhoA-Signalweg für die Regulation der zellulären Kontraktilität aktivieren1. Die RhoA-abhängige Kontraktilität des Aktin-Zytoskeletts ermöglicht es zellen, sich auf dem zugrunde liegenden ECM auszubreiten und zu migrieren und auch seine Steifigkeit zu spüren2. Die Verteilung der Zugkräfte hängt stark von der Ausbreitungsfläche und -form der Zellen ab, die beide auf Matrixeigenschaften beruhen und daher die Zytoskelettorganisation beeinflussen und schließlich eine geschlossene Rückkopplungsschleife zwischen Matrixmechanik und Zytoskelettorganisation bilden3,4.
Oberflächen-Mikrostrukturierungstechniken ermöglichen eine definierte Kontrolle der Zellform, indem mikrometergroße Regionen mit ECM-Klebstoffproteinen erzeugt werden. je nach Größe dieser Regionen einzelne Zellen oder Gruppen von Zellen, die am Mikromuster haften5. ECM-Proteine können durch verschiedene Ansätze wie Mikrokontaktdruck, Fotomusterung oder Lasermusterung auf Glassubstraten strukturiert werden6. Die Verwendung von UV-Licht (λ = 185 oder 375 nm) in Kombination mit Oberflächen-Antifouling-Strategien bietet die Flexibilität für die Gestaltung verschiedener Formen und Größen und die Immobilisierung mehrerer Proteintypen mit einer hohen Präzision in der Nähe von Oberflächenkanten7,8. Die regionen, die mit proteinabweisenden Chemikalien wie Polyethylenglykol (PEG) beschichtet sind, sind entweder mit einer Chrom-Photomaske oder einem auf einem digitalen Spiegelgerät (DMD) basierenden masklosen Lithographiesystem geschützt. Die Muster in den Masken ermöglichen die Exposition gegenüber UV-Licht von Regionen, die dann mit ECM-Proteinen strukturiert werden. Die Strukturierung von Hydrogeloberflächen mit ECM-Proteinen erfordert einen Transferschritt, um Proteine von der Glasoberfläche zu entfernen und mit den Mustern zu vernetzen. Alternativ kann die Musterung auf weichen Materialien erreicht werden, indem zuerst die Fotomaske mit einem abweisenden Protein beschichtet und anschließend die unmaskierten Bereiche mit tiefer UV-Beleuchtung verbrannt werden. Da tiefes UV Ozon erzeugt und die Oberfläche für die Proteinbindung reaktiv macht, werden die unmaskierten Bereiche mit ECM-Proteinen beschichtet und schließlich wird das Gel direkt auf den unmaskierten Regionen polymerisiert9,10.
Die gemusterten Hydrogele können verwendet werden, um TFM durchzuführen, eine Technik, die Zellkräfte an der Zell-Material-Grenzfläche misst11. In 2D-TFM verwendet man die flache Oberfläche eines dicken Polymerfilms, in den Markerperlen eingebettet wurden, um Verformungen zu verfolgen12,13,14,15. Um Verschiebungsvektoren zu extrahieren, ist es wichtig, zwei Bilder zu kombinieren, eines des verformten Zustands und ein Referenzbild ohne Verformungen. Die beiden Bilder werden dann mit Bildverarbeitung aufeinander abgebildet. Bei hoher Markerdichte geschieht dies in der Regel mit der Particle Image Velocimetry (PIV), einer etablierten Methode zur Rekonstruktion der hydrodynamischen Strömung. Bei niedriger Markerdichte und in 3D-TFM geschieht dies in der Regel mit der Particle Tracking Velocimetry (PTV), die spezifische Merkmale des experimentellen Datensatzes beinhaltet. Ein Beispiel für eine rechnerisch billigere Alternative ist der optische Fluss, wie der Kanade-Lucas-Tomasi (KLT)-Algorithmus16. Im Falle von Hydrogelsubstraten werden fluoreszierende Kügelchen normalerweise während der Materialpolymerisation mit hoher Dichte eingebettet, und Bilder werden vor und nach der Zellfreisetzung bei enzymatischer Ablösung aufgezeichnet. Die enzymatische Ablösung adhärenter Zellen, z.B. durch Trypsinisierung, führt zur gleichzeitigen Freisetzung zellulärer Traktionen aus allen Zellen auf den Hydrogelen, was es schwierig macht, eine detaillierte Analyse aus einer großen Anzahl von Zellen zu erhalten.
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Herstellung von mikrostrukturierten Hydrogelen zur Kontrolle der Zellform und -lokalisierung und eine Methode zur effizienten Messung der Zugkräfte nacheinander unter Verwendung von UV, um einzelne Zellen vom Substrat zu lösen. Für Zugkraftmessungen stellen wir eine Technik zur Herstellung von zweischichtigen PA-Hydrogelen vor, bei denen fluoreszierende Kügelchen nur in die oberste Schicht eingebettet sind, was ihre Dichte erhöht und ihre vertikale Ausbreitung reduziert. Die Kombination von UV-vermittelter Freisetzung zellulärer Zugkräfte mit Mikrostrukturierung ermöglicht es, eine räumliche Kontrolle über die Zellablösung (z. B. einzelner Zellen) zu erhalten, ohne die Adhäsion anderer Zellen in der interessierenden Region zu beeinträchtigen), vorausgesetzt, es besteht ein ausreichender Abstand zwischen den strukturierten Zellen. Die zelluläre Traktion wird dann mit der effizientesten und zuverlässigsten Methode für 2D-TFM rekonstruiert, nämlich der Fourier-Transformations-Traktionszytometrie (FTTC) mit Regularisierung17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir die Herstellung von mikrostrukturierten PA-Hydrogelen, die fluoreszierende Kügelchen enthalten, die als fiduziale Marker für TFM-Studien verwendet werden. Unser Ansatz basiert auf drei Schritten: 1) Herstellung von zweischichtigen PA-Hydrogelen; 2) Mikrostrukturierung von ECM-Proteinen und deren Übertragung auf die Hydrogeloberfläche; 3) Verwendung von gemustertem Nah-UV-Licht für TFM. Der Versuchsaufbau zur Analyse der Zelltraktionen zum Substrat erfordert die Verwendung linearer elastischer Materialien mit bekannten Steifigkeitswerten, um die Kräfte zu berechnen, die mit der Verschiebung der fluoreszierenden Kügelchen zusammenhängen26. PA-Hydrogele sind einfach zuzubereiten, die Steifigkeit kann leicht abgestimmt werden und sie werden häufig für die Steifigkeitserfassung und TFM18,28 verwendet. Um jedoch reproduzierbare Polymerisationszeiten und eine homogene Polymerisation des gesamten Hydrogels zu erhalten, sollte auf die Lagerbedingungen und die Zeit für die Reagenzien geachtet werden, z. B. sollte APS in einem Exsikkator aufbewahrt werden, um seinen Aktivitätsverlust zu vermeiden; TEMED sollte vor direktem Licht geschützt werden. Die Verwendung von oxidiertem HEA ermöglicht die kovalente Bindung von Matrixproteinen an der Hydrogeloberfläche, was vorteilhaft sein könnte, um die Bildung einer vollständigen und stabilen Proteinschicht zu erreichen. Die oxidierte HEA-Lösung sollte bei jeder Herstellung von PA-Hydrogelen frisch zubereitet werden. Das zweischichtige PA-Hydrogel bietet drei Hauptvorteile: 1) Es bietet eine alternative Möglichkeit, reproduzierbar eine homogene Verteilung von Fiducialperlen in der Nähe der Hydrogeloberfläche zu erhalten, ohne das Gel extrem dünn machen zu müssen (dh <20 μm). Die Kontrolle über die Hydrogeldicke ist entscheidend für genaue Messungen mit TFM. Wenn das elastische Substrat zu dünn ist, können stark haftende Zellen wie Fibroblasten das darunter liegende starre Glassubstrat wahrnehmen und mechanisch darauf reagieren29,30. Dicke Hydrogele machen die Bildaufnahme für die Kraftrekonstruktion anspruchsvoller. Darüber hinaus haben viele Mikroskope nicht genügend Platz, um sie unterzubringen, wenn man die zusätzliche Dicke des Glassubstrats bedenkt, das zur Befestigung des Hydrogels verwendet wird, es sei denn, es werden ultradünne Mikroskopieobjektträger verwendet. 2) Im zweischichtigen PA-Hydrogel wird die homogene Verteilung von Fiducialperlen nahe der Oberfläche des PA-Hydrogels ohne Verwendung einer Zentrifuge erreicht, sondern durch eine einfache Inkubation präziser Mengen von Hydrogellösungen und fluoreszierenden Kügelchen. Eine hohe Perlendichte ist bei der Durchführung der PIV-Analyse von erheblichem Vorteil, da sie die Auflösung der Zugkräfte und das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht, ohne dass eine konfokale Mikroskopie erforderlich ist. 3) Die Eingrenzung von Kügelchen in einer dünnen Schicht in der Nähe der Zell-Material-Grenzfläche ermöglicht die Abbildung von Zugkräften sowohl mit Epifluoreszenzmikroskopen als auch mit konfokalen Mikroskopen. Bei der Vorbereitung des Hydrogels sollte der Benutzer sicherstellen, dass es fest am Bodenglas haftet, bevor er mit den nachfolgenden Schritten des Protokolls fortfährt. Wir empfehlen, die für die Polymerisation der Hydrogelschichten angegebene Inkubationszeit einzuhalten, da es schwierig sein kann, das Glas auf der Oberfläche zu entfernen, ohne die Hydrogeloberfläche zu beschädigen.
Die bekanntesten Techniken zur Messung elastischer Eigenschaften sind AFM, Nanoindentation, Zugversuche und Rheometrie. Die Nanoindentation induziert jedoch sehr hohe Belastungen der Materialien, die die Bestimmung der elastischen Eigenschaften beeinflussen können. Zugversuche und Rheometrie hingegen sind makroskopische Messtechniken, während Zellen auf mikroskopischer Ebene interagieren31,32. AFM ermöglicht Messungen auf der Mikroskala mit reduzierten Dehnungen unter physiologischen Bedingungen. Die Zuverlässigkeit von AFM-Messungen kann beeinträchtigt werden, wenn experimentelle Details fehlen (z. B. Eindringkraft und Geschwindigkeit) oder unzureichende Daten aufgezeichnet werden27. Huth et al. beschreiben einen Algorithmus zur Extraktion von Young-Moduli aus AFM-Daten, der wert darauf legt, die Messdetails konstant zu halten27. Dieser Algorithmus bietet eine präzise und zuverlässige Bestimmung der Young-Moduli und wurde für unsere Experimente verwendet. Zusätzlich haben wir viele Kurven an Proben gemessen, die an verschiedenen Tagen hergestellt wurden, und sehr ähnliche Ergebnisse erzielt (Variation der Mittelwerte von ca. 1-2 kPa). Dies zeigt, dass die Steifigkeit unserer Gele zuverlässig vorhergesagt werden kann.
In diesem Protokoll verwenden wir ein Photostrukturierungsmodul, um mikrostrukturierte Bereiche auf Glas zu erzeugen, die dann auf die Hydrogeloberflächen übertragen werden. Die in diesem Protokoll gezeigte Mikrostruktur basiert auf DMD-basierter maskenloser Nah-UV-Lithographie (λ = 375 nm)7. Ein DMD besteht aus einer großen Anzahl von Mikrospiegeln auf einem Chip. Ein einzelnes Pixel entspricht einem einzelnen Mikrospiegel. Die pixelige Musterbilddatei von einem Computer wird durch DMD projiziert und mit einem Objektiv auf die Oberfläche fokussiert. Zur Mikrostrukturierung von Proteinen wird das fokussierte Laserlicht verwendet, um mit Hilfe eines Photoinitiators abweisende Polymerbürsten zu spalten. Anschließend werden die exponierten Regionen mit ECM-Proteinen gefüllt. Diese maskenlose Ablationsmethode bietet große Flexibilität bei der Gestaltung neuer Muster, da sie nicht auf die Verwendung einer Fotomaske angewiesen ist. Das Entwerfen und Anwenden eines Musters ist sehr einfach, da es mit einer Freeware wie Inkscape nur wenige Minuten dauert. Die Anzahl der Muster und Proben, die in kurzer Zeit hergestellt werden, ist jedoch ein großer Nachteil, da diese Methode nur verwendet werden kann, um jedes Mal ein einzelnes Substrat zu mustern. Das Photostrukturierungsmodul verwendet eine UV-nahe Festkörperlaserquelle, die mehrere Milliwatt emittiert. Der ungeschirmte Laserstrahl ist gefährlich für Augen und Haut. Reflektiertes und gestreutes Licht und Strahlung können ebenfalls gefährlich sein. Die Handhabung muss von einer Sicherheitsanweisung der Laserbeauftragten begleitet werden. Der kritischste Schritt im Protokoll bei der Verwendung eines Photostrukturierungsmoduls besteht darin, sicherzustellen, dass der Laser während des Mikromusterns und der Ablation richtig auf die Oberfläche fokussiert wird. Eine konstante Beleuchtungsdosis (Intensität multipliziert mit der Zeit) von UV-Licht während der Strukturierung hängt davon ab, wie der Laser auf die Oberfläche fokussiert ist. Eine schwache Intensität auf der Oberfläche aufgrund einer schlechten Fokussierung kann dazu führen, dass der ECM-Transfer auf die Hydrogeloberfläche fehlschlägt, was dazu führt, dass keine Zellen an das Hydrogel gebunden werden.
In TFM-Experimenten werden Zellen nach der ersten Bildgebung von adhärenten Zellen und den fiduzialen Markern durch Trypsin-Behandlung aus dem PA-Hydrogel freigesetzt, um ihren entspannten Zustand aufzuzeichnen. Ein Nachteil bei der Durchführung dieses Schritts ist die Handhabung der Probe auf dem Mikroskopietisch. Ohne Perfusionskammer stellen das Öffnen des Deckels der Schale, das Absaugen des Mediums, das Spülen und Pipettieren der Trypsinlösung eine Herausforderung für Anfänger und erfahrene Benutzer dar. Tatsächlich sind diese Verfahren eine Hauptquelle für die Drift in xyz-Achsen , was zu einem Verlust von Position und Fokus führt. Unser lokales UV-Beleuchtungsprotokoll macht TFM zu einer zugänglicheren Technik für Anfänger. Es sollte beachtet werden, dass wir ein kommerziell erhältliches mikroskopiebasiertes maskenloses Photostrukturierungsmodul verwendet haben, aber im Prinzip könnte jedes UV-A-Beleuchtungssystem verwendet werden, schließlich in Kombination mit einer Maske, um Bereiche der Substrate zu schützen, in denen die Zellzugkräfte nicht aufgezeichnet werden sollten. Die Exposition von Zellen mit einer signifikanten Dosis von sichtbarem Licht mit niedriger Wellenlänge (z. B. das violette Licht, das die DAPI-Emission anregt) führt zu zunehmendem oxidativem Stress, der zu Phototoxizität und Zelltod führen kann. Daher kann diese Technik auch in einem Epifluoreszenzmikroskop ohne UV-Lasermodul angewendet werden. Da die Intensität jedoch viel schwächer ist, wird es in diesem Fall viel einfacher sein, TFM mit der enzymatischen Behandlung durchzuführen.
Mit LUVI-TFM ist es möglich, die gleiche Probe für mehrere Messungen zu verwenden, da einzelne Zellen oder kleine Gruppen von Zellen lokal abgelöst sind. Es sollte jedoch auf die Auswahl der zu lösenden Zellen geachtet werden, um die Aufzeichnung von Kräften benachbarter Zellen zu vermeiden. Daher sollten für Einzelzellmessungen in Abwesenheit von Mikromustern überfüllte Regionen vermieden werden; Bei Messungen an einzelnen mikrostrukturierten Zellen sollten die Muster so ausgelegt sein, dass der Abstand zwischen einzelnen Strukturen mindestens doppelt so groß ist wie der Durchmesser des gemusterten Bereichs. Wir empfehlen auch, Zellen aus benachbarten Mustern nicht nacheinander zu verwenden, sondern sie aus entfernten Regionen auf dem Substrat zu entnehmen. Unsere Messung wird gut auf einem Epifluoreszenzmikroskop durchgeführt, das mit einer Fokuskontrollfunktion und einem 40 x Luft NA = 0,9 Objektiv ausgestattet ist, wobei der Arbeitsabstand der Linse ausreichend lang ist und die schnelle Bewegung von einem Brunnen zum anderen sehr gut abstimmbar ist. Die gezielte Ablösung von Zellen für TFM-Anwendungen ist wirksam zur Messung der Zellkraft einer einzelnen Zelle oder eines ganzen kleinen Zellclusters (z.B. bis zu 300 μm Durchmesser). Mit unserem Setup beobachteten wir Zellrundungen und -ablösungen für die UV-Behandlung einzelner Zellen (Abbildung 3A), während eine Ablösung bei kleinen Zellclustern selten auftrat. Dies könnte zu einer Unterschätzung der Zellzugkräfte führen. Für größere Zellcluster wird eine enzymatische Ablösung empfohlen, da die Benutzer ein 20-faches Luftobjektiv verwenden sollten, um den gesamten Cluster abzubilden, und eine Fokuskontrollfunktion benötigt wird. Da die Tiefenschärfe des 20-fachen Luftobjektivs viel länger ist, wird die Handhabung nicht so kritisch sein wie beim Objektiv mit höherer Vergrößerung. Der Anwender sollte sicherstellen, dass der Fokus für die Ablation von Zellen richtig eingestellt ist, da die Beleuchtungsdosis vom Laserfokus auf der Oberfläche abhängig ist. Während wir uns der möglichen Einschränkungen bei der Verwendung von LUVI-TFM in Zellkollektiven aufgrund möglicher mechanischer Wechselwirkungen mit benachbarten unbehandelten Zellen bewusst sind, könnte sich dieser Aspekt tatsächlich als nützlich für Studien zur Mechanik der gezielten Zellextrusion erweisen, z.B. von epithelialen Monoschichten.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir mit unserem TFM-Ansatz in Kombination mit der lichtinduzierten Freisetzung von mikrostrukturierten Zellen ein robustes und hochdurchsatzfähiges Protokoll zur Messung der Zelladhäsionskräfte bereitstellen. Die Vielseitigkeit dieser Methode könnte durch Mikroskopie und Bildgebung weiter genutzt werden, um die Auflösung und Empfindlichkeit zu verbessern.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Frau Rebecca Alvarado für die Unterstützung bei der Protokoll-Videoproduktion und Herrn Stephen Casale für die konstruktive Kritik am Manuskript. Wir danken den Kolleginnen und Kollegen aus der Abteilung Zelluläre Biophysik, Max-Planck-Institut für medizinische Forschung für die hilfreichen Gespräche. Die finanzielle Unterstützung der Max-Planck-Gesellschaft für E.A.C.-A. und die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1129, Projektnummer 240245660, P15 bis E.A.C.-A. und P4 bis U.S.S.; DFG EXC 2082/1-390761711 an U.S.S.) wird auch sehr anerkannt. J.B. dankt der Carl-Zeiss-Stiftung für die finanzielle Unterstützung. E.A.C.-A., C.S. und U.S.S. würdigen die Förderung durch die Max Planck School Matter to Life mit Unterstützung des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF). C.S. wird vom Europäischen Forschungsrat unterstützt (Consolidator Grant PHOTOMECH, Nr.101001797).
Materials
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | #440159 | Sigma Aldrich | |
| Acetic acid | #33209 | Honeywell | |
| Acrylamide 40 % | #1610140 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
| AFM cantilever | #CP-CONT-BSG-A-G | NanoAndMore | 5 μm spherical tip |
| AFM system | #NanoWizard3 | JPK | Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter |
| Ammonium persulfate | #A3678 | Sigma | |
| Bis-acrylamide 2 % | #1610142 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
| Camera sCMOS | #C11440-42U30 | Hamamatsu | |
| Camera sCMOS | #ANDORZYLA4.2 | Oxford Instrument | |
| CellRox | #C10422 | Thermo Fisher | |
| Custom incubator chamber | EMBLEM | ||
| Dental glue | #1300 100 | Picodent | |
| DMEM | #41965 | Thermo Fisher | |
| Epifluorescence microscope | #Eclipse Ti2E | Nikon | |
| Epifluorescence microscope | #Axiovert200 | Zeiss | |
| Ethanol | #9065.3 | Carl Roth | |
| FBS South America | #S181T | Thermo Fisher | |
| Fibrinogen | #F13191 | Invitrogen | Alexa488 conjugate |
| Fibronectin | #F1141 | Sigma | |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8805 | Invitrogen | Carboxylated (365/415) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8848 | Invitrogen | Carboxylated (505/515) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8810 | Invitrogen | Carboxylated (580/605) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8807 | Invitrogen | Carboxylated (660/680) |
| Glass coverslip 15 mm round | #41001115 | Assistent | |
| Glass coverslip 24 mm round | #41001124 | Assistent | |
| Microscope Objective | #MRH08230 | Nikon | 20x air NA 0.45 |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | #CRL-2991 | ATCC | |
| mPEG-SVA | #MPEG-SVA-5000 | Laysan Bio | |
| N-Hydroxyethyl acrylamide | #697931 | Aldrich | |
| Plasma cleaner | #100-E | TePla | |
| PLPP gel | #PLPPgel | Alveole | |
| Poly-L-lysine | #P4823 | Sigma Aldrich | |
| Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol) | #PLL(20-g[3.5]-PEG(2) | SuSoS | |
| Sodium(meta) periodate | #S1878 | Sigma Aldrich | |
| TEMED | #17919 | Thermo Scientific | |
| UV Pattening module | #PRIMO | Alveole | |
| UVO cleaner | #342-220 | Jelight |
Riferimenti
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