ヒト人工多能性幹細胞における複数のミトコンドリアパラメータとその神経およびグリア誘導体のフローサイトメトリー解析

ミトコンドリアは、ほとんどすべての真核細胞に存在する必須の細胞小器官です。ミトコンドリアは、酸化的リン酸化を介してアデノシン三リン酸(ATP)を生成することによってエネルギー供給に関与し、生合成と代謝の代謝仲介者として機能します。ミトコンドリアは、ROSの生成、細胞死、細胞内^Ca2+調節など、他の多くの重要な細胞プロセスに深く関与しています。ミトコンドリア機能障害は、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、ハンチントン病(HD)、フリードライヒ運動失調症(FRDA)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)など、さまざまな神経変性疾患と関連しています¹。ミトコンドリア機能障害の増加とmtDNA異常も、人間の老化に寄与すると考えられています^2,3。

神経変性疾患では様々なタイプのミトコンドリア機能障害が起こり、ミトコンドリア容積の変化、MMP脱分極、ROSの産生、mtDNAコピー数の変化が一般的です^4,5,6,7。したがって、これらおよび他のミトコンドリア機能を測定する能力は、疾患メカニズムを研究し、潜在的な治療薬をテストするときに非常に重要です。さらに、ヒトの神経変性疾患を忠実に再現する動物モデルがないことを考慮すると、脳細胞でヒトの疾患を再現する適切なin vitroモデルシステムを確立することは、これらの疾患のより深い理解と新しい治療法の開発に向けた重要なステップ^{です2,3,8,9}。

ヒトiPS細胞は、神経細胞および非神経細胞(すなわちグリア細胞)を含む様々な脳細胞を生成するために使用でき、神経変性疾患に関連するミトコンドリア損傷は両方の細胞型で見出されている³、¹⁰、¹¹、^12、13。iPS細胞を神経系統およびグリア系譜に分化させるための適切な方法が利用可能です^14,15,16。これらの細胞は、in vitro疾患モデリングと薬物スクリーニングのための独自のヒト/患者プラットフォームを提供します。さらに、これらは患者に由来するため、iPS細胞由来の神経細胞とグリア細胞は、ヒトで起こっていることをより正確に反映する疾患モデルを提供します。

現在まで、iPS細胞、特に生きたニューロンやグリア細胞における複数のミトコンドリア機能パラメータを測定するための便利で信頼性の高い方法はほとんどありません。フローサイトメトリーの使用は、単一細胞におけるミトコンドリア機能を含む生物学的パラメータを測定するための強力なツールを科学者に提供します。このプロトコルは、iPS細胞からの神経幹細胞(NSC)、ニューロン、グリア星状細胞など、さまざまな種類の脳細胞の生成の詳細と、iPS細胞やiPS細胞由来の神経細胞やグリア細胞など、さまざまな種類のミトコンドリアパラメータを測定するための新しいフローサイトメトリーベースのアプローチを提供します。このプロトコルは、フローサイトメトリーを使用してミトコンドリア容積、MMP、ミトコンドリアROSレベル、MRC複合体、およびTFAMを測定するための共染色戦略も提供します。ミトコンドリアの体積または質量の測定を組み込むことにより、これらのプロトコルはまた、ミトコンドリア単位当たりの総レベルおよび特定のレベルの両方の測定を可能にする。