Den nuværende protokol beskriver, hvordan man bruger trådløs optogenetik kombineret med højhastigheds videografi i en enkelt pellet reach-to-grasp opgave til at karakterisere de neurale kredsløb, der er involveret i udførelsen af dygtig motorisk adfærd i frit bevægelige mus.
Finmotorik er afgørende i hverdagen og kan kompromitteres i flere nervesystemforstyrrelser. Erhvervelsen og udførelsen af disse opgaver kræver sensorisk-motorisk integration og involverer præcis styring af bilaterale hjernekredsløb. Implementering af unimanuelle adfærdsmæssige paradigmer i dyremodeller vil forbedre forståelsen af hjernestrukturernes bidrag, som striatum, til kompleks motorisk adfærd, da det tillader manipulation og registrering af neural aktivitet af specifikke kerner i kontrolforhold og sygdom under udførelsen af opgaven.
Siden oprettelsen har optogenetik været et dominerende redskab til at forhøre hjernen ved at muliggøre selektiv og målrettet aktivering eller hæmning af neuronale populationer. Kombinationen af optogenetik med adfærdsmæssige assays kaster lys over de underliggende mekanismer for specifikke hjernefunktioner. Trådløse hovedmonterede systemer med miniaturiserede lysdioder (LED’er) muliggør fjernbetjent optogenetisk kontrol i et helt frit bevægeligt dyr. Dette undgår begrænsningerne i et kablet system, der er mindre restriktivt for dyrs adfærd uden at gå på kompromis med lysemissionseffektiviteten. Den nuværende protokol kombinerer en trådløs optogenetik tilgang med højhastigheds videografi i en unimanuel fingerfærdighedsopgave for at dissekere bidraget fra specifikke neuronale populationer til finmotorisk adfærd.
Motorisk dygtig adfærd er til stede under de fleste bevægelser udført af os, og det vides at være påvirket i flere hjernesygdomme 1,2,3,4,5,6. Implementering af opgaver, der gør det muligt at studere udviklingen, læringen og udførelsen af dygtige bevægelser, er afgørende for at forstå motorfunktionens neurobiologiske grundlag, især i modeller af hjerneskade, neurodegenerative og neuroudviklingsforstyrrelser 2,7,8,9,10,11,12,13 . At række ud efter og hente genstande sker rutinemæssigt i hverdagens handlinger, og det er en af de første motoriske færdigheder, der er erhvervet under tidlig udvikling og derefter raffineret gennem årene 5,6. Det omfatter en kompleks adfærd, der kræver sensorisk-motoriske processer såsom opfattelsen af objektets funktioner, bevægelsesplanlægning, handlingsvalg, bevægelsesudførelse, kropskoordinering og hastighedsmodulering 7,14,15,16. Således kræver unimanuelle opgaver med høj fingerfærdighed deltagelse af mange hjernestrukturer på begge halvkugler 16,17,18,19,20,21,22. Hos mus er den enkelte pellet reach-to-grasp-opgave karakteriseret i flere faser, der kan styres og analyseres separat 7,13,23. Denne funktion gør det muligt at studere bidraget fra specifikke neuronale subpopulationer på forskellige stadier af erhvervelse og adfærd ydeevne og giver en platform for detaljerede undersøgelser af motorsystemer 13,23,24. Bevægelsen sker om et par sekunder; højhastighedsvideografisk bør således anvendes til kinematisk analyse i forskellige faser af den faglærte motorbane 7,25. Flere parametre kan udtrækkes fra videoerne, herunder kropsholdning, bane, hastighed og type fejl25. Kinematisk analyse kan bruges til at detektere subtile ændringer under trådløs optogenetisk manipulation 7,23.
Brug af miniaturiserede lysdioder (LED’er) til at levere lys via et trådløst hovedmonteret system gør det muligt at have fjernoptogenetisk kontrol, mens dyret udfører opgaven. Den trådløse optogenetiske controller accepterer enkeltpuls- eller kontinuerlige udløserkommandoer fra en stimulator og sender infrarøde (IR) signaler til en modtager, der er tilsluttet den miniaturiserede LED23,26. Den nuværende protokol kombinerer denne trådløse optogenetik-tilgang med højhastighedsvideoografi af en fingerfærdighedsopgave for at dissekere specifikke neuronale populationers rolle under udførelsen af finmotorisk adfærd23. Da det er en unimanuel opgave, giver det mulighed for at vurdere deltagelsen af strukturer i begge halvkugler. Traditionelt styrer hjernen kroppens bevægelse på en meget asymmetrisk måde; Opgaver med høj fingerfærdighed kræver imidlertid omhyggelig koordinering og kontrol fra mange hjernestrukturer, herunder ipsilaterale kerner og differentielt bidrag fra neuronale subpopulationer inden for kerner 10,20,21,22,23. Denne protokol viser, at subkortikale strukturer fra begge halvkugler styrer forbenets bane23. Dette paradigme kan være egnet til at studere andre hjerneområder og modeller af hjernesygdom.
Brugen af optogenetisk manipulation af neuronale populationer i veldefinerede adfærdsmæssige paradigmer fremmer vores viden om de mekanismer, der ligger til grund for motorisk kontrol 7,23. Trådløse metoder er særligt velegnede til opgaver, der kræver forsøg på flere dyr eller fri bevægelighed34,35. Ikke desto mindre, da teknikker og enheder raffineres, bør det være go-to-muligheden for enhver …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af UNAM-PAPIIT-projektet IA203520. Vi takker IFC’s dyreanlæg for deres hjælp med vedligeholdelse af musekolonier og beregningsenheden til IT-support, især til Francisco Perez-Eugenio.
Anaesthesia machine | RWD | R583S | Isoflurane vaporizer |
Anesket | PiSA | Ketamine | |
Breadboard | Thorlabs | MB3090/M | Solid aluminum optical breadboard |
Camera lense | Canon | 50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount) | |
Camera system | BrainVision | MiCAM02 | Camera controller and synchronizer |
Cotton swabs | |||
CS solution | PiSA | Sodium chloride solution 9% | |
Customized training chamber | In house | ||
Drill bit #105 | Dremel | 2 615 010 5AE | Engraving cutter |
Dustless precission chocolate pellets | Bio-Serv | F05301 | |
Ethyl Alcohol | J.T. Baker | 9000-02 | Ethanol |
Eyespears | Ultracell | 40400-8 | Eyespears of absorbent PVA material |
Fluriso | VetOne | V1 502017-250 | Isoflurane |
Glass capillaries | Drumond Scientific | 3-000-203-G/X | Pipettes for NanoJect II |
Hidrogen peroxide | Farmacom | Antiseptic | |
High-speed camera | BrainVision | MiCAM02-CMOS | Monochrome high-speed cameras |
Infrared emmiter | Teleopto | ||
Insulin syringe | |||
LED cannula | Teleopto | TelC-c-l-d | LED cannula 250um 487nm light |
Micropipette 10 uL | Eppendorf | Z740436 | |
Micro-pipette puller | Sutter | P-87 | Horizontal puller |
Microscope LSM780 | Zeiss | Confocal microscope | |
Microtome | |||
Mock receiver | Teleopto | ||
NanoJect II | Drumond Scientific | 3-000-204 | Micro injector |
Oxygen tank | Infra | na | |
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA | Addgene | 20297 | Viral vector for ChR-2 expression |
Parafilm | |||
Paraformaldehyde | Sigma | P-6148 | |
Phosphate saline buffer | Sigma | P-4417 | Phosphate saline buffer tablets |
Pipette tips 10 uL | ThermoFisher | AM12635 | 0.5-10 uL volume |
Pisabental | PiSA | Sodium pentobarbital | |
Plexiglass | commercial | Acrylic sheet | |
Povidone iodine | Farmacom | Antiseptic | |
Procin | PiSA | Xylacine | |
Puralube | Perrigo pharma | 1228112 | Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum |
Rotary tool | Kmoon | Mini grinder | Standard |
Scalpel | |||
Scalpel blade | |||
Stereotaxic apparatus | Stoelting | 51730D | Digital apparatus |
Super-Bond C&B | Sun Medical | Dental cement | |
Surgical dispossable cap | |||
Teleopto remote controller | Teleopto | ||
Tg Drd1-Cre mouse line | Gensat | 036916-UCD | Transgene insertion FK150Gsat |
Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
TPI Vibratome 1000 plus | Peico | Microtome | |
Vectashield mounting media with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | Mounting media |
Wireless receiver | Teleopto | TELER-1-P |