ポリグルタミン媒介性神経毒性に対する生理活性化合物を発見するためのモデルシステムとしてのCaenorhabditis elegans

注: このプロトコルで使用されるソリューションのレシピについては、 表 1 を参照してください。 1. Caenorhabditis elegans アッセイのための材料の調製 C.エレガンス株の維持 C.エレガンス(AM141およびHA759)およびエシェリヒア・コリ(OP50およびNA22)株を得る(材料表を参照)。 線虫増殖培地(NGM)プレート上の線虫を、大腸菌OP50を播種し、AM141 21の場合は20°C、HA75923の場合は15°Cに維持する。 大腸菌OP50細菌培養物の調製 ルリア・ベルターニ(LB)ストリークプレートから 大腸菌 OP50の単一コロニーを選び、50mLの液体LB培養物に接種する。 OP50細菌を37°Cおよび200rpmのシェーカー中で、570nmで〜0.5の光学密度(OD570)になるまでインキュベートする。 OP50細菌培養物を4°Cで保存し、2週間以内に使用してください。 OP50細菌を用いたNGMプレートの作製 1 Lオートクレーブ可能なボトルに、20 gの寒天、2.5 gのペプトン、3.0 gのNaCl、および975 mLの脱イオン水を加えます。オートクレーブを121°Cで30分間放置する。 液体NGM寒天ボトルをベンチに置き、〜60°Cに冷却し、次いで、1 mLの1 M CaCl2、1 mLの1 mLの1 M MgSO4、1 mLの5 mg/mLのコレステロール、および25 mLの1 Mリン酸カリウム(pH 6.0)の滅菌原液を加える。 滅菌した90 mmのペトリ皿にNGMを20 mL注ぎ、プレートをベンチに残して冷却して固化させます。プレートを逆さまに保ち、室温でベンチで2日間乾燥させます。 OP50細菌培養物を各NGMプレートに200μL分注し、滅菌ガラスコーティングロッドで均等に広げます。蓋を閉め、プレートを37°Cで一晩インキュベートする。 OP50を播種したNGMプレートを室温でカバー付きのプラスチック箱に保管し、2週間以内に使用してください。 年齢同期 C.エレガンス集団の 調製 重質成虫線虫を滅菌1.5mL微量遠心管に集め、1000× g で1分間遠心分離する。3回洗浄し、線虫をM9バッファーに再懸濁する。 等量の漂白剤溶液を加え、3〜5分間穏やかに攪拌する。解剖顕微鏡下で15秒ごとに漂白を監視します。注:漂白剤溶液は、等量の10%NaOClおよび1M NaOHを混合することによって、使用前に新たに調製されなければならない(表1)20。 線虫のほとんどが壊れたら、M9バッファーで希釈して消化を停止します。素早く遠心分離機で上清を除去し、ペレットをM9緩衝液に再懸濁し、洗浄を3回繰り返した。 ペレットをS培地に再懸濁する。線虫の残留物を重力で2〜3分間沈降させ、卵を上清に残す。 上清を新しい滅菌微量遠心チューブに吸引します。卵を1000 × g で1分間遠心分離して集める。 上清の〜80%を捨て、卵を20mLのS培地を含む滅菌フラスコに移す。フラスコをシェーカーに入れ、卵を120rpmで食物なしで一晩インキュベートして、同期したL1線虫を得る。 2. PolyQ凝集アッセイ polyQ凝集アッセイのための線虫の調製 OP50(OD570 0.7-0.8)および5 mg/mLのアストラガランを含む500 μLのS培地(通常は1つの時点にわたって1つの処理につき1ウェル)を含む48ウェルプレートの各ウェルに、AM141の300〜500の同期L1幼虫を移す。 プレートをパラフィルムで密封し、20°Cおよび120rpmで24時間、48時間、72時間、および96時間インキュベートする。 線虫を滅菌1.5mL微量遠心管に収穫し、M9緩衝液で洗浄し、遠心分離(1000 > g を1分間)して×3回洗浄し、残りのOP50を除去した。AM141線虫をM9バッファーに再懸濁し、画像取得の準備を整えます。 蛍光画像の取得とデータ解析メモ:データは、このハイコンテンツイメージングシステムで自動的に分析されます。自動撮像装置が利用できない場合、画像取得用のアガロースパッドを準備する従来の方法を使用して、一般的な蛍光顕微鏡7、15、17を使用して同様の性能を達成することができる(ステップ3.2および3.3を参照されたい)。 10-15 線虫を 384 ウェルプレートの各ウェルに移します (最終容量 80 μL/ウェル)。各処理に10個の複製ウェルを設定します。 各ウェルに10 μLの200 mMアジ化ナトリウムを加えて線虫を麻痺させ、底に沈降させます(5〜10分)。 プレートを高濃度イメージングシステムに置き、蛍光画像を取得します(デバイスとソフトウェアの情報については 、材料表 を参照してください)。 画像取得ソフトウェアを開き、以下のパラメータを設定します。 [プレート取得の設定]ウィンドウを開き、新しい実験セットと名前を作成します。 [倍率] を 2x、[カメラ ビニング] を 1、[プレート タイプ] を [384 ウェル プレート] として選択します。 訪問する井戸とサイト(単一サイト)を設定します。 フルオレセインイソチオシアネート(FITC)フィルター を選択し、画像ベースのフォーカスオプションを有効にします。 露出を 300 ミリ秒に設定します。メモ:上記の設定は、イメージングパラメータを最適化するためにテストおよび調整できます。 画像取得設定を保存し、[プレートを取得]ボタンをクリックして実行します。 画像解析ソフトを用いて画像データを解析します。 [プレート データのレビュー] ウィンドウを開き、画像解析用の テストプレート を選択します。 テストウェルをダブルクリックして、その画像を表示します。 解析方法として 「カウント核 」を選択し、「設定を 構成」 ボタンをクリックして、以下の設定のウィンドウを表示します。 FITC チャンネルからソース画像を定義し、 標準アルゴリズムを選択します。 画像解析パラメータを次のように設定します:おおよその最小幅= 10μm(= 2ピクセル)。おおよその最大幅 = 50 μm (= 12 ピクセル);ローカル背景の上の強度 = 1,000-2,000 グレーレベル。 現在の設定をテストして、分析方法を最適化します。 設定を保存し、すべての井戸で解析を実行します。注: 1 つの 384 ウェルプレートの分析が終了するまでに約 20 分かかります。 各ウェルの Q40::YFP 集計の合計数として Total Nuclei をエクスポートします。 各ウェルの線虫の数を数えます。 各グループの線虫あたりのQ40::YFP集計の平均数を計算し、各時点のデータに非線形カーブフィットを適用します。 以下のeq(1)を用いて阻害指数を計算する:阻害指数= (1)ここで、N個の対照およびN個のサンプルは、それぞれ対照群および処置群におけるQ40::YFP凝集体の平均数である。 3. PolyQ媒介性神経毒性アッセイ 試験サンプルによる C.エレガンス の治療 polyQ神経毒性アッセイ用の線虫を調製するには、HA759の300〜500同期L1幼虫を、OP50(OD570が0.7〜0.8のOD570)および5mg /mLのアストラガランを含む500μLのS培地(典型的には各処置に対して3つの複製ウェル)を含む48ウェルプレートの各ウェルに移す。 プレートをパラフィルムで密封し、15°Cおよび120rpmで3日間23日間インキュベートする。 遠心分離により線虫を回収し、M9バッファーで3〜5回洗浄する。線虫をM9バッファーに再懸濁して、ニューロン生存および回避アッセイに使用する。 アガロースパッドの調製 100mLのM9緩衝液(2%、w / v)に2gのアガロースを加え、アガロース溶液をマイクロ波で加熱して沸騰させる。 厚さ2mmのガラス板2枚の間に置かれた厚さ1mmの顕微鏡スライドガラスの中央に、0.5mLの溶融アガロースを分配する。別のスライドで垂直に覆います。アガロースが冷えて固まったら、上部のスライドをそっと取り外します。 ASHニューロン生存アッセイ アガロースパッド上に20mMのアジ化ナトリウムを滴下する。15-20 HA759線虫を滴に移して固定化する。 カバースリップを線虫の上にそっと置きます。スライドをデジタルカメラを取り付けた蛍光顕微鏡の下に保管してください。40倍対物レンズとFITCフィルターを選択して、線虫の頭部領域のGFP陽性ASHニューロンを検出します。 各群の線虫を無作為に50個以上選択し、頭部領域にGFP標識両側性ASHニューロンを有する線虫の数をカウントする7。以下のeq(2)を用いてASHニューロンの生存率を計算する。神経細胞生存率(%)= (2)ここで、N生存 率およびN総数は 、それぞれGFP陽性ASHニューロンを有する線虫の数および各群において試験された線虫の総数である。 浸透圧回避アッセイ 食品を含まないNGMプレート(9 cm)を、中央の8 Mグリセロール(〜30 μL)ラインで通常の(N)ゾーンとトラップ(T)ゾーンに分割します。グリセロールラインから約1cm離れたところに200mMのアジ化ナトリウム(〜20μL)ラインを広げて、グリセロールバリアを通過してゾーンTに交差する線虫を麻痺させる。 〜200匹の線虫を、各群の3つの複製プレートのゾーンNにそれぞれ移す。線虫を引き付けるために、ゾーンT(プレート端から1cm)に1%ブタンジオン(〜2μL)の滴を加える。直ちにシャーレの蓋を覆い、23°Cで90分間インキュベートした。 顕微鏡下でNゾーンおよびTゾーン上の線虫の数をスコアリングする。回避指数は、eq (3)20 を使用して計算します。回避指数 = (3)ここで、NおよびTは、それぞれNおよびTゾーンにおける線虫の数である。データは、3回の反復±標準偏差(SD)の平均として提示され、>3の独立した実験を表す。 ペア化されていない両側 t検定を実行して、レンゲ群と対照群のデータを比較します。 4. レーダーチャートの作成 グラフ作成ソフトウェアを開き、さまざまなアッセイのデータを新しいシートにインポートします。放射軸のタイトルとしてA(X)列、対照群からのデータとしてA(Y)列、治療群からのデータとしてB(Y)列を入力します。 必要なデータを選択し、[ プロット]|クリックします。特殊化: ツール バーメニューのレーダーボタンでレーダーチャートを生成します。 放射状軸をダブルクリックし、必要に応じて各軸の スケール、ティック、および ティックラベル を調整します。 メニューの [ファイル ]をクリックし、[ グラフのエクスポート] を選択して画像を *.tiffとして保存します。注: 資料表の ソフトウェア Web サイトでは、レーダー チャートの作成に関する詳細なヘルプ ドキュメントとビデオ チュートリアルを提供しています。