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Immunologia e infezioni

Génération d’une plus grande biomasse de biofilm bactérien à l’aide de dispositifs de microplaques de puits profonds à plaques PCR

Published: April 22, 2022
doi:
10.3791/63069
, , , ,
1Department of Medical Microbiology and Infectious Diseases,University of Manitoba, 2National Microbiology Laboratory,Public Health Agency of Canada

Summary

Ce protocole présente une méthodologie pour effectuer des mesures de la croissance du biofilm et de la biomasse à l’aide de dispositifs de plaque de PCR de puits profonds auto-assemblés pour le criblage statique de biofilm à couvercle fixe à 96 puits à haut débit.

Abstract

Les biofilms bactériens sont difficiles à éradiquer des surfaces à l’aide d’interventions antimicrobiennes conventionnelles. Les méthodes de microplaques à haut débit de 96 puits sont fréquemment utilisées pour cultiver des biofilms bactériens afin de tester rapidement la sensibilité aux antimicrobiens afin de calculer les valeurs minimales de concentration d’éradication du biofilm (MBEC). Les dispositifs de biofilm standard sont constitués de couvercles en polystyrène fixés sur des microplaques de 96 puits et sont idéaux pour mesurer la biomasse du biofilm et les valeurs MBEC, mais ces dispositifs sont limités par la surface de cheville disponible pour l’accumulation de biomasse et le coût. Ici, nous décrivons un protocole pour utiliser un dispositif auto-assemblé en polypropylène 96 puits profond à couvercle fixe pour cultiver des biofilms Escherichia coli BW25113 et Pseudomonas aeruginosa PAO1. Une comparaison des biofilms de 24 heures formés sur des dispositifs de puits standard et profonds par chaque espèce à l’aide de la coloration de la biomasse cristalline violette et des tests de détermination MBEC est décrite. La plus grande surface des dispositifs de puits profonds devrait multiplier par 2 à 4 la formation globale de biofilm par les deux espèces. P. aeruginosa a formé une biomasse significativement plus importante/mm2 sur les piquets de puits profonds par rapport au dispositif standard. E. coli avait plus de biomasse/mm2 sur les dispositifs de polystyrène standard par rapport au dispositif de puits profonds. Les essais d’éradication du biofilm avec des désinfectants tels que l’hypochlorite de sodium (eau de Javel) ou le chlorure de benzalkonium (BZK) ont montré que les deux composés pouvaient éliminer les biofilms d’E. coli et de P. aeruginosa des deux dispositifs, mais à des valeurs de MBEC différentes. L’éradication du biofilm BZK a entraîné des valeurs variables de MBEC d’E. coli entre les dispositifs, mais l’eau de Javel a démontré des valeurs de MBEC reproductibles pour les espèces et les dispositifs. Cette étude fournit une méthode de puits profonds à haut débit pour la culture de plus grandes quantités de biofilms sur des dispositifs en polypropylène pour les études en aval nécessitant des quantités plus élevées de biofilm statique.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli sont des protéobactéries à Gram négatif qui sont couramment étudiées pour leur capacité à former des communautés cellulaires sessiles attachées à la surface connues sous le nom de biofilms1. Les deux espèces, lorsqu’elles se développent sous forme de biofilms, peuvent sécréter une matrice de substances polymères extracellulaires (EPS) composée principalement de différents polysaccharides et protéines, qui peuvent également inclure de l’ADN extracellulaire et / ou des lipides, offrant une protection cellulaire supplémentaire et une survie améliorée dans des environnements difficiles et limités en nutriments2,3. La physiologie et la formation du biofilm par les deux espèces sont d’une importance clinique, car elles représentent les cinq principaux agents pathogènes résistants aux antimicrobiens les plus couramment isolés provenant d’infections sanguines, urinaires et pulmonaires de patients hospitalisés au Canada4,5. On estime également que les biofilms représentent près de 80 % de toutes les infections chroniques et récurrentes causées par ces espèces bactériennes6. En raison des substances EPS sécrétées et de l’activité métabolique plus lente7,8, les biofilms établis deviennent plus difficiles à éradiquer lorsqu’ils se forment sur des surfaces telles que les dispositifs médicaux implantés, les tissus cicatriciels et dans les poumons des patients atteints de mucoviscidose9,10, ce qui ajoute à leur résistance aux antimicrobiens.

Les propriétés de croissance récalcitrantes des biofilms bactériens les rendent souvent plus résistants à l’inhibition et/ou à l’éradication des antimicrobiens2,9. Ainsi, l’établissement de méthodes in vitro pour étudier l’éradication antimicrobienne du biofilm bactérien est primordial pour sélectionner des composés efficaces pour éradiquer les infections lorsqu’elles se forment sur des plastiques médicaux (par exemple, des cathéters à demeure) et des implants médicaux. La plupart des méthodes rapides de culture d’éradication antimicrobienne in vitro de biofilm examinent la croissance du biofilm comme une culture de biofilm « statique » plutôt que comme des cultures « continues », où la croissance bactérienne statique est surveillée aux stades précoces et avancés de la formation du biofilm sur une courte période (24-96 h) dans le même milieu de croissance. Les méthodes de biofilm continu sont lourdes pour une analyse rapide car elles nécessitent une évaluation de la croissance du biofilm sur de plus longues périodes cultivées dans des chambres qui permettent le flux continu et le remplacement des milieux de croissance par moins de répétitions11. En raison du temps et des efforts nécessaires pour maintenir et établir des biofilms continus, les biofilms statiques in vitro sont les plus populaires, car ils sont facilement adaptés aux tests de sensibilité aux antimicrobiens à haut débit dans des plaques de microtitrage en plastique de 96 puits plutôt que dans des systèmes de chambre d’écoulement élaborés qui limitent le nombre de cultures testées simultanément 12,13 . Les essais de microplaques de biofilm statiques « dans le puits » les plus simples utilisent des plaques de microtitrage standard en polystyrène ou en vinyle (capacité de 300 μL) pour mesurer la formation de biofilm sur les côtés et le fond de chaque puits et souvent sous forme d’anneaux à l’interface air-surface liquide. La formation de biofilm bactérien dans le puits est mesurée en colorant la biomasse déposée adhérant aux puits après l’élimination du liquide du milieu de croissance et le lavage des biofilms12,13. Ces essais sont économiquement populaires, mais présentent souvent des problèmes de reproductibilité en raison de leur conception inhérente, car les biofilms déposés sont sujets à des dommages ou à des pertes lors du rinçage pour la récupération cellulaire et les procédures de coloration de la biomasse11,14.

Pour réduire les pertes de biofilm, les dispositifs de biofilm commerciaux standard ont amélioré la conception des microplaques de biofilm dans le puits en ajoutant un couvercle en polystyrène inséré à 96 puits à la conception standard de plaque de 96 dans le puits, appelée « dispositif de biofilm standard » dans le présent document. L’ajout d’un couvercle fixé élargit la surface disponible dans chaque puits de microplaque, ce qui permet une meilleure adhérence de surface et la formation de biomasse de biofilm15,16. Les dispositifs de couvercle à ancrage de biofilm standard permettent une plus grande récupération, un retrait et un rinçage du biofilm pour des tests ultérieurs de sensibilité au biofilm antimicrobien et d’éradication lorsque des couvercles attachés sont insérés dans de nouvelles plaques de microtitrage contenant des problèmes de médicament ou de condition de croissance. À l’instar des techniques de microplaques de biofilm dans le puits, les matériaux récupérés à partir des dispositifs de couvercle indexés retirés et lavés permettent des tests de survie cellulaire et la coloration de la biomasse du biofilm, impliquant généralement des formulations de colorant violet cristallin (CV) 17,18,19. Les dispositifs de biofilm standard sont également optimaux pour le dépistage des susceptibilités antimicrobiennes du biofilm. Ces tests surveillent l’inhibition de la croissance du biofilm de deux manières: 1) Lorsque des antimicrobiens sont ajoutés aux cellules au début de la croissance, ils peuvent déterminer la valeur minimale de concentration d’inhibition du biofilm (MBIC). 2) Lorsque des biofilms établis se forment sur les chevilles après 24 heures, puis sont exposés à des antimicrobiens, il peut déterminer la valeur minimale d’éradication du biofilm (MBEC) 17,20. Semblables aux dispositifs à microplaques de biofilm dans le puits, les dispositifs à biofilm standard présentent certaines limites notables, telles que leur coût élevé par dispositif, ils ne sont pas autoclavables et sont moins durables pour les solvants chimiques en raison du matériau de plaque de polystyrène utilisé. Les dispositifs de biofilm standard ont également un faible rapport surface/cheville, ce qui limite les volumes de travail maximaux dans chaque puits à 200 μL. Ces facteurs peuvent rendre les dispositifs de biofilm standard plus difficiles à utiliser pour les études qui exigent de plus grandes quantités de biofilm dans un format à haut débit.

Nous décrivons ici une méthode statique de 96 puits à couvercle rattaché au biofilm développée dans notre laboratoire à l’aide de plaques de PCR à semi-jupe en polypropylène de 0,5 mL 96 puits disponibles dans le commerce et montées sur des plaques de microtitrage de 96 puits ayant des puits plus profonds que la plaque standard (Table des matériaux). Ces dispositifs assemblés ont un volume de travail maximal de 750 μL lorsqu’ils sont utilisés pour la culture de biofilm (ci-après dénommé « dispositif de biofilm de puits profond »). Les avantages de l’utilisation de ces dispositifs de biofilm de puits profonds sont leur coût inférieur par rapport aux dispositifs de biofilm standard, ils peuvent être stérilisés par autoclavage et ils augmentent la surface de formation de biofilm sur les plus grands « tubes / chevilles » de plaques DE PCR externes. Avec cette méthode, nous montrons les applications de ces dispositifs pour la culture et la caractérisation de la biomasse de biofilm formée par Escherichia coli BW25113 et P. aeruginosa PAO1. Les méthodes de détermination des valeurs de MBEC à l’aide d’essais d’éradication du biofilm sont décrites à l’aide du composé d’ammonium quaternaire désinfectant chlorure de benzalkonium (BZK) et hypochlorite de sodium (eau de Javel) antimicrobiens. L’antiseptique/désinfectant BZK a été choisi car ce composé est fréquemment utilisé pour inhiber les biofilms des surfaces contaminées, mais il serait moins efficace pour éradiquer les biofilms bien établis21. L’eau de Javel est un produit chimique très efficace pour l’éradication des biofilms établis et constitue un pilier de la désinfection chimique 22. Les deux désinfectants fournissent une comparaison utile des valeurs MBEC pour chaque dispositif de biofilm21. Un protocole pour cette évaluation de dispositif de biofilm utilisant des tests de coloration CV et d’éradication du biofilm pour la détermination du MBEC est résumé dans cet article. Un organigramme de protocole a été inclus pour une vue d’ensemble simplifiée du flux de travail pour ces méthodes (Figure 1).

Protocol

1. Préparation de la culture aseptique pour la croissance du biofilm (jours 0-1) Le jour 0, strier la ou les souches bactériennes souhaitées pour les tester à partir d’un stock cryoconservé (dans du glycérol ou du diméthylsulfoxyde (DMSO)) directement sur une plaque d’agar nutritif avec sélection antimicrobienne selon les besoins de la souche. Incuber des plaques de gélose à la température optimale (37 °C) et au temps (18-22 h) pour la croissance de la déformation. Le lendemain (Jour 1), inoculer une colonie de la plaque de gélose dans 5 mL de milieu de croissance dans des conditions de croissance optimales. Ces cultures seront utilisées comme inocules de départ du jour 2 pour les dispositifs de biofilm (voir l’étape 2.2; Figure 1).NOTE: Pour cette étude, E. coli K-12 BW21153 et P. aeruginosa PAO1 ont été cultivés en milieu Luria-Bertani (LB) à 37 °C pendant 18 h avec agitation à 160 tours par minute (tr/min). Préparer au moins 3 souches cultivées indépendamment pour générer des répliques biologiques pour la mesure du biofilm en raison de la variabilité statistique de la formation de biomasse de biofilm sur les dispositifs de couvercle indexés. 2. Préparation et inoculation des assiettes (Jour 2) Remplir les puits extérieurs d’une plaque de polypropylène autoclavée de 96 puits, 1,1 mL/puits, avec de l’eau stérile de 750 μL/puits (figure 2A). Remplir les puits témoins négatifs (puits de milieu non inocculés; colonne B) avec des milieux de croissance de 750 μL et les puits restants avec des milieux de croissance de 675 μL.REMARQUE: L’étape 2.1 ci-dessus et les étapes ci-dessous répertorient les volumes appropriés pour le dispositif de biofilm de puits profond. Si vous utilisez le dispositif de biofilm standard, les volumes doivent être modifiés comme suit: 75 μL de culture d’inoculum à 20 μL; 675 μL de milieux de croissance à 180 μL; 750 μL d’eau stérile /milieu de croissance à 200 μL; 800 μL de solutions de coloration CV / acide acétique / rinçage à 210 μL. De plus, pour l’étape 3.6 ci-dessous, l’absorbance à 500 nm (A550 nm) peut être lue directement dans la microplaque de polystyrène après mélange lors de l’utilisation de la microplaque standard du dispositif de biofilm. En utilisant des cultures de nuit day 1, standardisez les cultures à une densité optique de 600 nm (OD600nm) = 1,0 ou à une norme McFarland de 0,5-1 unités. Créer une dilution en série de 10 fois de chaque culture standardisée dans des tubes à essai ou une plaque de microtitrage de puits de 96 puits de profondeur jusqu’à ce qu’une dilution de 10-3 soit atteinte. Inoculer les milieux contenant des puits comme le montre la figure 2B avec 75 μL de la culture diluée 1 x 10-3 , pour une dilution bactérienne finale dans le puits de 10-4. Insérez soigneusement une plaque PCR autoclavée (couvercle attaché) dans la plaque de puits profond inoculée. Incuber des plaques dans des conditions de déformation optimales (37 °C) avec agitation (maximum 160 tr/min) dans un incubateur avec 50-60% d’humidité pendant 24 h. 3. Détermination de la biomasse du biofilm à partir d’appareils utilisant la coloration CV (Jour 3) Retirer de manière aseptique le couvercle fixé au biofilm de chaque appareil et rincer en l’insérant dans une plaque de puits profond autoclavée préparée avec 800 μL de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) / puits pendant 30 s pour éliminer les cellules planctoniques. Pour la coloration CV de la biomasse, transférer le couvercle de la plaque PCR indexée dans une nouvelle plaque préparée avec 800 μL/puits 0,1% (p/v) CV en dH2O et tacher pendant 5 minutes. Enlevez l’excès de tache en rinçant le couvercle attaché dans une plaque de puits profonde préparée avec 800 μL / PBS bien stérile. Laissez les plaques sécher pendant 10 minutes dans une armoire de biosécurité avec des chevilles orientées vers le haut. Transférer le couvercle de la plaque PCR séchée sur une plaque contenant 800 μL/puits 30 % (v/v) d’acide acétique et laisser le couvercle se décolorer pendant 5 minutes. Retirez le couvercle de la cheville PCR déficiée et mélangez soigneusement la solution par pipetage. Transférer 200 μL des plaques de puits profondes vers une microplaque standard de 96 puits et mesurer l’absorbance de la solution de décoloration à une longueur d’onde de 550 nm (A550nm) dans un lecteur de microplaques ultraviolette (UV) / visible (Vis). À l’aide des valeurs A550nm mesurées, soustrayez la valeur moyenne A550nm à blanc (contrôle négatif) de la valeur de chaque échantillon de biofilm. Faire la moyenne de chaque valeur d’échantillon de biofilm A550nm soustrait à blanc représentant les répliques biologiques de l’échantillon. 4. Remettre en question les biofilms contenant des antimicrobiens pour calculer leur valeur MBEC antimicrobienne sur 24 heures (Jour 3) Préparez une solution mère antimicrobienne dans de l’eau qui est deux fois (2x) la concentration de la concentration antimicrobienne la plus élevée souhaitée à tester. Créez une série de dilution en deux parties de la solution mère antimicrobienne dans 2x milieux de croissance concentrés afin qu’il y ait 8 concentrations antimicrobiennes. Comme le montre la figure 2B, remplir les puits extérieurs d’une plaque de puits profond autoclavée avec de l’eau stérile de 750 μL/puits. Remplir les colonnes B (témoin négatif; pas de bactéries) et C (témoin positif; pas d’exposition aux antimicrobiens) de la plaque avec un milieu de croissance de 750 μL/puits. Remplir les puits restants avec 750 μL/puits de la série de dilution antimicrobienne, comme le montre la figure 2B. Retirez et rincez le couvercle fixé comme décrit à l’étape 3.1 et transférez-le dans la plaque de provocation antimicrobienne. Incuber les plaques avec agitation (max 160 tr / min) dans des conditions de déformation appropriées et pour la période d’exposition souhaitée. 5. Récupération de la biomasse du biofilm à partir de couvercles arrimés (Jour 4) Retirez les couvercles attachés exposés aux antimicrobiens et rincez comme décrit à l’étape 3.1. Transférer le couvercle fixé sur une plaque de puits profonde avec un milieu de récupération de 750 μL/puits dans les puits intérieurs et 750 μL/puits stérile dH2O dans les puits extérieurs. Pour préparer un milieu de récupération de 70 mL, combiner 35 mL de 2x LB concentré, 0,7 mL de 100% tween-20, 3,5 mL de 20x solution neutralisante universelle et 30,8 mL de dH2O stérile dans un flacon stérile. Pour préparer 20x solution neutralisante universelle concentrée, ajouter 1,0 g de L-histidine, 1,0 g de L-cystéine et 2,0 g de glutathion réduit à un volume final de 20 mL de dH2O. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm et conserver à 4 °C. Placez l’appareil de l’étape 5.1 dans un bac secondaire installé à l’intérieur d’un bain-marie sonique. Soniquez les appareils pendant 30 minutes pour déloger le biofilm des chevilles dans le milieu de récupération. Après la sonication, retirez le couvercle attaché et placez un couvercle de plaque plate stérile sur la plaque de récupération profonde du puits. Le couvercle attaché peut être jeté. Incuber des plaques avec des milieux de récupération à partir de l’étape 5.3 dans les conditions optimales de croissance de la souche pendant la nuit (16-18 h). 6. Détermination des valeurs MBEC de l’appareil (Jour 5) Le lendemain, transférer 200 μL de chaque puits de la plaque de puits profond incubée de l’étape 5.4 vers une nouvelle plaque de microtitrage de 96 puits. Lisez l’OD600nm de chaque puits à l’aide d’un lecteur de microplaques de gamme UV/Vis. Soustraire les valeurs de contrôle négatif (blanc non ininoculé) OD600nm de chaque biofilm contenant un échantillon. Calculer la valeur MBEC pour chaque échantillon en utilisant les valeurs OD600nm , où la valeur MBEC est la concentration antimicrobienne la plus faible qui a abouti à la valeur OD600nm la plus faible (impossible à distinguer du contrôle non ininoculé) pour un échantillon spécifique d’espèces/souches traitées aux antimicrobiens.

Representative Results

L’objectif de cette étude était de fournir une méthode permettant d’effectuer des mesures de biofilm statiques à plus grand volume, à haut débit (96 puits) à l’aide de dispositifs de biofilm de puits profonds. Ici, nous avons comparé une plaque PCR semi-jupe auto-assemblée insérée dans une microplaque de puits profond, connue sous le nom de dispositif de puits profond, à un dispositif de couvercle à biofilm standard couramment utilisé pour examiner leurs capacités à former des biofilms statiques. Des essais d’éradication de la biomasse et du biofilm teintés par CV (MBEC) ont été utilisés pour évaluer la formation de biofilm par les deux dispositifs. Pour comparer la formation de biofilm par différentes espèces sur chaque dispositif, nous avons évalué les biomasses de biofilm formées par E. coli BW25113 et P. aeruginosa PAO1 en utilisant le protocole de coloration CV du biofilm17. Bien que la coloration CV soit généralement rapportée comme des valeurs A550nm, en raison des différences dans les volumes de croissance de chaque appareil et leurs surfaces disponibles, nous avons converti les valeurs de la coloration CV A550nm en concentrations CV molaires en solution. Les concentrations de CV molaire ont pris en compte les différences de volume de chaque dispositif et ont permis une comparaison des concentrations de CV représentant les biomasses récupérées de chaque dispositif. Les résultats ont montré que les deux espèces produisaient significativement plus de biomasse sur les dispositifs de biofilm de puits profonds (2,1 fois E. coli; 4,1 fois P. aeruginosa) par rapport au dispositif de biofilm standard (Figure 3A-B). Ce résultat était attendu compte tenu de la plus grande surface du piquet PCR du puits profond (320,4 mm2) par rapport à la surface du piquet standard du dispositif (108,9 mm2). Cette constatation concorde également avec l’augmentation des volumes accrus (750 μL) utilisés dans le dispositif de biofilm de puits profond par rapport aux puits de dispositif standard (200 μL). Par conséquent, les dispositifs de puits profonds ont augmenté l’accumulation de biomasse de biofilm sur les chevilles de tube pcR par rapport aux chevilles plus petites avec des dispositifs de biofilm standard. Les deux dispositifs de biofilm ont formé des biofilms reproductibles lorsque nous avons comparé des biofilms reproduits biologiquement formés par E. coli et P. aeruginosa (figure 3A-B). Malgré l’observation d’une plus grande variabilité dans les valeurs techniques de reproduction technique du M A550nm teintées par CV pour l’une ou l’autre souche cultivée sur le dispositif de puits profond, il n’y avait pas de différences statistiquement significatives lorsque nous avons comparé les valeurs médianes CV M pour les répliques biologiques de chaque espèce sur le puits profond ou les dispositifs standard en utilisant l’analyse bidirectionnelle de variance (ANOVA) par paires ou les tests T de Student (les deux p > 0,05). Cette découverte montre que la formation de biofilm par puits profonds et dispositifs standard forme des biofilms reproductibles. Cependant, les résultats de la coloration CV ont également montré que lorsque nous avons pris en compte les différences de surface des chevilles sur chaque dispositif, la formation de biomasse de biofilm par E. coli et P. aeruginosa a montré des différences statistiquement significatives dans l’accumulation de biomasse (tableau 1). Le calcul de la biomasse moyenne teintée CV (M) par surface de cheville en mm2 (CV M/mm2) pour E. coli a montré que la formation de biofilm était 1,5 fois plus faible sur les dispositifs de puits profonds en polypropylène par rapport au dispositif de biofilm standard (tableau 1). Cependant, le résultat inverse a été obtenu pour P. aeruginosa, qui a démontré un CV M/mm2 1,4 fois plus élevé sur les dispositifs de puits profonds en polypropylène par rapport aux dispositifs de biofilm standard (tableau 1). Malgré les différences observées dans l’accumulation de biomasse de biofilm par espèce avec chaque dispositif, le dispositif de puits profonds a tout de même démontré une formation globale de biomasse de biofilm globale (augmentation de 2 à 4 fois) par chaque espèce (figure 3). Pour déterminer les applications de test de sensibilité aux antimicrobiens du dispositif de biofilm de puits profond, nous avons comparé deux désinfectants couramment utilisés, le BZK et l’eau de Javel, pour leur potentiel d’éradication du biofilm. Les deux produits chimiques sont couramment utilisés pour prévenir (BZK) et/ou éradiquer (eau de Javel) les biofilms bactériens dans des applications cliniques et industrielles21,22,23. Chaque composé a été ajouté à des concentrations croissantes de 2 fois aux biofilms formés par E. coli et P. aeruginosa sur les dispositifs de biofilm standard et profond22,23 (figures 1, 2B). La concentration la plus faible de BZK ou d’eau de Javel qui a donné lieu à des valeurs d’OD600 nm qui ne pouvaient pas être distinguées des puits témoins négatifs a été définie comme la valeur MBEC. Le traitement des biofilms formés sur des dispositifs de biofilm standard avec de l’eau de Javel a donné les mêmes valeurs de MBEC d’eau de Javel de 0,625 % pour E. coli et P. aeruginosa (tableau 1, figure 4A-B). Les valeurs de MBEC d’eau de Javel déterminées pour le biofilm d’E. coli et de P. aeruginosa formé sur des dispositifs de puits profonds ont montré des valeurs de MBEC 2 à 4 fois inférieures par les deux espèces (E. coli; 0,156%; P. aeruginosa 0,313 %) par rapport aux dispositifs standard (tableau 1). Une différence de 2 fois dans les valeurs de MBEC d’eau de Javel entre les espèces a été notée pour le dispositif de puits profonds, où P. aeruginosa nécessitait une concentration 2 fois plus élevée d’eau de Javel pour éradiquer les biofilms par rapport à E. coli (figure 4A-B, tableau 1). La différence MBEC d’eau de Javel 2 fois entre P. aeruginosa et E. coli dans le dispositif de puits profond semble être inversement corrélée à une augmentation de 1,5 fois de la formation de biomasse colorée par CV par P. aeruginosa par rapport à E. coli (Figure 3A-B). La plus grande quantité de biomasse formée par P. aeruginosa sur les piquets de dispositifs de puits profonds peut également expliquer pourquoi une concentration plus élevée d’eau de Javel était nécessaire pour éradiquer les biofilms de P. aeruginosa par rapport à E. coli sur les puits profonds (figure 3A-B, tableau 1). Par conséquent, les essais d’éradication du biofilm des puits profonds montrent que les deux espèces étaient sensibles à l’eau de Javel, mais à des concentrations d’eau de Javel plus faibles (2 à 4 fois) par rapport aux dispositifs standard. Cela est inversement corrélé avec la surface et les volumes de cheville 3 fois plus grands des chevilles de plaque PCR du dispositif de puits profond. Cela suggère que pour l’exposition à l’eau de Javel, une plus grande surface de biomasse peut réduire les concentrations d’eau de Javel nécessaires à l’éradication du biofilm. Les essais d’éradication du biofilm BZK ont montré une plus grande variabilité de la croissance récupérée (valeurs OD600nm) et des valeurs MBEC par chaque espèce par rapport aux résultats de l’eau de Javel (figure 4C-D). Cette variabilité n’est pas inattendue d’après des études antérieures montrant que le BZK était plus efficace pour prévenir la formation de biofilms que pour éradiquer des biofilms bien établis24,25,26. À l’aide du dispositif de biofilm standard, seuls les biofilms de P. aeruginosa traités avec du BZK ont montré une valeur MBEC constante (2560 μg/mL) qui était 8 fois inférieure à la valeur MBEC (20480 μg/mL) obtenue pour cette souche dans le dispositif de puits profond (tableau 1, figure 4C). Ces résultats peuvent refléter des différences dans les quantités de biomasse de P. aeruginosa formées sur des surfaces profondes bien ancrées et des compositions plastiques par rapport aux chevilles de dispositif standard. L’éradication par BZK des biofilms formés par E. coli sur le puits profond et les dispositifs standard était tout aussi médiocre, ce qui a entraîné une large gamme de valeurs de BZK MBEC de 2560 à 40960 μg/mL pour le dispositif de puits profond et de 320 à 10240 μg/mL sur le dispositif standard (figure 4D). Pour E. coli, cette variabilité s’expliquait par le cas occasionnel où 1 à 2 puits répliqués présentaient une croissance faible mais statistiquement significative des milieux de récupération, ce qui augmentait l’erreur et réduisait la précision de la détermination du MBEC BZK avec l’un ou l’autre dispositif (figure 4D, tableau 1). Cette variabilité met en évidence l’inefficacité de l’utilisation de BZK dans l’éradication des biofilms d’E. coli, comme indiqué précédemment dans les études24,25,26. En revanche, les biofilms de P. aeruginosa pourraient être éradiqués de manière fiable par BZK à une concentration définie avec les deux dispositifs, mais avec une différence de concentration de BZK de 8 fois (Figure 4C). En résumé, les valeurs MBEC d’éradication BZK des biofilms formés par P. aeruginosa montrent des valeurs MBEC distinctes avec chaque dispositif, cependant, les deux dispositifs sont également pauvres pour distinguer les phénotypes précis d’éradication BZK d’E. coli. Par conséquent, la méthode du dispositif de biofilm de puits profond décrite ici est tout aussi efficace pour former des biofilms reproductibles par rapport à un dispositif de biofilm standard. Graphique 1. Vue d’ensemble schématique de l’expérience. Jour 0 isolement des colonies individuelles à partir de stocks cryoconservés; Jour 1 inoculation des milieux de croissance avec des colonies uniques; Jour 2 inoculation de la plaque de biofilm; Jour 3 Coloration CV ou défi antimicrobien; Sonification du biofilm du jour 4 dans un milieu de récupération; et jour 5 lecture OD600nm de la plaque de récupération pour déterminer les valeurs MBEC. Quelques images en figure fournies par Servier Medical Art (smart.servier.com). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Graphique 2. Exemples de dispositions de plaques présentées pour différentes étapes du protocole. A) La configuration finale de la plaque pour la croissance initiale du biofilm de 24 heures à l’aide de cultures bactériennes du jour 1 de deux souches bactériennes (E. coli et P. aeruginosa), chacune avec trois répliques biologiques. Les puits de contrôle négatifs (gris) sont utilisés comme témoins de stérilité (aucune bactérie ajoutée). B) Configuration de plaques pour le défi antimicrobien des biofilms. L’assombrissement des couleurs indique une augmentation de la concentration d’antimicrobiens. Les témoins négatifs sont des puits sans bactéries ajoutées (gris) et les témoins positifs sont des biofilms sans exposition aux antimicrobiens (orange). Les couvercles de cheville de biofilm prélevés dans le panneau A sont transférés dans cette plaque de puits profonde pour l’exposition aux antimicrobiens. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Graphique 3. Concentration molaire (M) d’E. coli BW25113 teinté CV. (A) et P. aeruginosa PAO1 (B) biomasse de biofilm récupérée à partir de dispositifs standard (cercles) et de puits profonds (triangles). La coloration CV a été mesurée en lisant l’absorbance de CV à 550 nm (A550nm), et les lectures A550nm du puits profond ont été ajustées par un facteur de 3,809 (800 μL / 210 μL) pour tenir compte des différences de volume entre les dispositifs. La concentration molaire CV (M) a été déterminée par la loi de Beer-Lambert (concentration CV = A550nm/εl); où la longueur de chemin (l) de 210 μL dans la plaque de microtitrage à fond plat de 96 puits a été déterminée à 0,56 cm et le coefficient d’extinction (ε) de CV dans l’eau à A550nm de 251500 cm-1M-139. Les résultats représentent 9 répétitions techniques de trois réplicats biologiques de chaque souche cultivée sous forme de biofilm et la valeur médiane de chaque réplicat biologique est indiquée sous forme de barre horizontale dans chaque placette. Des différences statistiquement significatives de biomasse entre les dispositifs ont été déterminées entre les valeurs médianes répliquées biologiques à l’aide d’un test en T apparié à deux queues (E. coli p = 0,008-0,018 (*); P. aeruginosa p= 0,002-0,009 (**)) représentés sous forme de barres avec astérisques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.  Graphique 4. Détermination de la concentration de MBEC antimicrobien. Détermination de la concentration antimicrobienne de MBEC pour l’eau de Javel (A,B) et le BZK (C,D) pour P. aeruginosa PAO1 (A, C) et E. coli BW25113 (B,D) lorsqu’ils sont cultivés sur des dispositifs de biofilm standard (barres blanches) et profonds (barres grises). Les résultats ont été déterminés par lecture de l’OD600nm du biofilm récupéré après sonication dans un milieu de récupération et incubation pendant la nuit. L’OD600nm du puits profond a été ajusté d’un facteur de 3,75 (750 μL / 210 μL) pour tenir compte des différences de volume entre les appareils. Les résultats sont représentatifs de trois réplicats biologiques et les barres d’erreur montrent l’écart-type entre les réplicats à chaque concentration antimicrobienne39. Les astérisques (*) au-dessus de chaque diagramme à barres indiquent des différences statistiquement significatives dans les valeurs OD600nm des contrôles vides avec des valeurs p < 0,05 en utilisant les calculs du test T de Student à deux queues. Les symboles circulaires (o) au-dessus de chaque diagramme à barres indiquent des mesures où seulement 1 ou 2 répétitions avaient des valeurs OD600nm statistiquement significatives à partir de contrôles vides. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. BZK MBEC (μg/mL) Eau de Javel MBEC (% v/v) Souche testée Dispositif de puits profond Appareil standard Dispositif de puits profond Appareil standard E. coli BW25113 2560-40960 320-10240 0.156 0.625 P. aeruginosa PAO1 20480 2560 0.313 0.625 Dispositif de puits profond Appareil standard valeur p** Changement de pliage (puits profond / standard) Souche testée CV moyen M*/mm2 ± SD CV moyen M*/ mm2 ± SD E. coli BW25113 1,99 x 10-8 ± 3,25 x10-9 3,03 x 10-8 ± 3,31 x 10-9 0.0176 -1.52 P. aeruginosa PAO1 8,01 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 5,72 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 0.034 1.4 Tableau 1. Un résumé des valeurs moyennes M/mm2 de la biomasse colorée CV et de P. aeruginosa PAO1 et de L’éradication du biofilm MBEC pour le BZK et l’eau de Javel sur divers dispositifs.*Valeurs moyennes CV M/mm2 calculées à l’aide des valeurs CV M répliquées biologiques médianes (Figure 3).**Valeurs de p déterminées à l’aide du test T de l’élève à deux queues.

Discussion

Cette étude décrit des méthodes d’utilisation d’un dispositif de croissance de biofilm statique à haut débit de 96 puits de plus grand volume impliquant une microplaque de puits profond en polypropylène équipée d’un couvercle de plaque PCR semi-jupe pour la formation de biofilm (dispositif de biofilm de puits profond; Tableau des matériaux). Nous avons comparé les biofilms générés avec ce dispositif à un dispositif de biofilm standard en polystyrène disponible dans le commerce (Table des matériaux). La méthode du dispositif de puits profonds utilise les mêmes étapes et solutions méthodologiques que le dispositif standard17 à des volumes ajustés modifiés pour les dispositifs de puits profonds, ce qui rend ce dispositif idéal pour la formation de biofilm à grande échelle et l’analyse expérimentale. La croissance d’E. coli BW25113 et de P. aeruginosa PAO1, deux espèces à Gram négatif connues pour former des biofilms, a été examinée pour sa formation de biomasse et ses valeurs de MBEC désinfectant (BZK/eau de Javel) utilisées sur les deux dispositifs. La comparaison de la biomasse colorée CV formée sur les chevilles de chaque dispositif a montré que E. coli et P. aeruginosa formaient des biofilms avec une biomasse plus élevée sur le dispositif de biofilm de puits profond par rapport au dispositif standard (Figure 3A-B). L’augmentation de la biomasse du biofilm reflétait la plus grande surface des piquets de puits profonds par rapport à la surface de cheville standard de l’appareil. Lorsque nous avons tenu compte des différences dans les surfaces des chevilles (mm2) avec les deux dispositifs, des différences dans la formation de biomasse ont été notées, où E. coli a formé une biomasse CV significativement plus importante par mm2 sur les chevilles de dispositif standard en polystyrène qu’avec les chevilles de tube PCR du dispositif de puits profond (tableau 1). P. aeruginosa a formé une plus grande biomasse colorée CV/cheville mm2 par rapport aux dispositifs standard (tableau 1). Ces résultats peuvent mettre en évidence des différences spécifiques à l’espèce dans la formation de biomasse de biofilm sur les différents dispositifs.

Il convient de noter que l’éradication à l’eau de Javel des biofilms d’E. coli et de P. aeruginosa sur les dispositifs de puits profonds s’est produite à des concentrations 2 à 4 fois plus faibles que les dispositifs standard (figure 4A-B, tableau 1). Les différences dans les valeurs de MBEC d’eau de Javel identifiées à partir de chaque dispositif sont probablement influencées par les différences dans les formes de chevilles de l’appareil (les « chevilles » de puits profonds sont des tubes coniques et les chevilles standard sont cylindriques), les différences de composition plastique (polypropylène par rapport au polystyrène) et les différences de volume (750 μL contre 200 μL). Par exemple, P. aeruginosa avait une biomasse CV M/mm2 plus importante sur les chevilles des dispositifs de puits profonds par rapport aux dispositifs standard, mais E. coli avait moins de biomasse sur les piquets de puits profonds (figure 3). Cela suggère que les concentrations de désinfectant nécessaires à l’éradication du biofilm peuvent être affectées par la biomasse formée par chaque espèce ainsi que par la surface disponible. De plus, les différences dans la forme des chevilles de l’appareil peuvent influencer diverses conditions de croissance pour des espèces particulières. Dans notre étude, P. aeruginosa peut former une plus grande biomasse sur les piquets de puits profonds en raison de leur plus grande surface et de leur aération, car cette espèce est un aérobie obligatoire contrairement à E. coli, qui est un anaérobie facultatif. À ce jour, nous n’avons identifié aucune étude publiée qui a directement comparé la formation de biofilm e. coli et de P. aeruginosa sur des matériaux en polypropylène27,28,29 et en polystyrène30,31. Cependant, des rapports de formation robuste de biofilm d’E. coli et de P. aeruginosa ont été notés dans des études indépendantes examinant des matériaux en polypropylène ou en polystyrène. En ce qui concerne les pseudomonades, de nombreux Pseudomonas spp. peuvent utiliser des plastiques tels que le polypropylène comme sources potentielles de carbone32. Par conséquent, la disponibilité de ce dispositif de biofilm de puits profond en polypropylène est une avancée utile dans les études de biofilm statique. Le polypropylène est chimiquement plus durable que le polystyrène et est un matériau cliniquement pertinent, car il est fréquemment utilisé dans les implants médicaux, les sutures et les mailles pour les chirurgies herniques ou pelviennes33,34.

Bien que la biomasse du biofilm ait été formée par les deux dispositifs, le dispositif de puits profonds présentait une variabilité légèrement plus élevée de la biomasse en fonction de la méthode de coloration CV et des valeurs MBEC d’éradication du biofilm OD600nm pour l’eau de Javel et le BZK. Cela peut s’expliquer par 3 facteurs principaux: 1) Les dispositifs de puits profonds ont une plus grande surface de cheville que les dispositifs standard qui étaient inclinés par rapport aux chevilles de dispositif standard. 2) Les deux espèces testées peuvent avoir des capacités différentes à adhérer aux matériaux en polypropylène et en polystyrène de chaque dispositif. 3) Les volumes de milieux de croissance utilisés dans chaque appareil (puits profond de 750 μL, norme de 200 μL) et l’espacement entre la cheville insérée et les parois latérales du puits diffèrent. Ces problèmes ne sont pas un problème si un seul type de dispositif est utilisé pour toutes les expériences de biofilm, cependant, si les deux dispositifs sont sélectionnés, les comparaisons que nous avons effectuées ici devraient être effectuées pour identifier les différences36,37. En raison des différences dans les matières plastiques utilisées dans chaque dispositif, les valeurs de biomasse de biofilm teintée CV et de MBEC ne doivent pas être directement comparées entre différents dispositifs. Toutefois, si les méthodes et les expériences sont menées sur le même dispositif (puits profond ou standard), les résultats obtenus pour les espèces et les antimicrobiens testés sont comparables.

Ce protocole montre que les dispositifs de plaques pcR de puits profonds auto-assemblés sont des dispositifs de biofilm de plus grand volume pour mesurer la formation et l’éradication de biofilm qui sont également rentables. Du point de vue des coûts, les dispositifs de biofilm standard avec une gamme de 96 couvercles bien fixés se vendent entre 29 et 36 dollars américains (USD) par appareil (table des matériaux). Les dispositifs de biofilm standard en polystyrène ne sont pas autoclavables et sont moins tolérants aux solvants / acides en raison de ses propriétés chimiques plastiques. Les plaques de puits profonds en polypropylène auto-assemblées décrites dans le présent document, équipées d’une plaque PCR (Table des matériaux) semi-jupe séparée de 96 puits, coûtent un total de 14 USD par dispositif assemblé, soit la moitié du coût standard du dispositif de biofilm. Il convient de noter que les prix peuvent varier en fonction de la région, du distributeur et de la disponibilité, et de nos coûts après que les remises institutionnelles ont été fixées à 9 USD / appareil de puits profond. Ces dispositifs auto-assemblés à plaques pcR en polypropylène à puits profond ont l’avantage supplémentaire d’être autoclavables pour la stérilisation et offrent 2 à 4 fois plus de biomasse de biofilm que les dispositifs standard.

En conclusion, ce protocole et les résultats représentatifs des comparaisons de croissance du biofilm des dispositifs de puits profonds et de biofilm standard montrent que les deux dispositifs sont capables de cultiver des biofilms bactériens, mais que les dispositifs de puits profonds forment 2 à 4 fois plus de biofilm. Le dispositif de biofilm de puits profonds offre une alternative viable et abordable pour les expériences de formation de biofilm à haut débit à plus grand volume, telles que les études de dépistage de la susceptibilité aux médicaments. Cette technique peut générer des biofilms utiles pour les extractions « -omiques » en aval (protéomiques, métabolomiques, transcriptomiques) ou les essais expérimentaux (enzymatiques, fluorescents) qui peuvent nécessiter de plus grandes quantités de matériaux de biofilm pour les analyses. Le dispositif de biofilm de puits profond est recommandé pour les laboratoires qui souhaitent étudier les biofilms dans un essai à haut débit de 96 puits en utilisant des matériaux plastiques à faible coût, à plus grand volume et chimiquement durables qui sont cliniquement pertinents.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le financement de ces travaux a été fourni par des subventions de fonctionnement à DCB de la Subvention de découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (RGPIN- 2016-05891) et au MRM et au GRG du programme de subvention de l’Initiative de recherche et de développement en génomique (IRGM) du gouvernement du Canada (GRDI7 2254557).

Materials

10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) Fisher Scientific 13-678-11F disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS Fisher Scientific 13-678-11C disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack Fisher Scientific 14-222-766 sterile pipettor tips for media aliquoting
Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C Fisher Scientific P-DW-11-C microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips Fisher Scientific TF-350-L-R-S sterile pipettor tips for media aliquoting
Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 Avantor/ VWR 89094-676 sterile basins/ reservoirs for microplate preparation
BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g Fisher Scientific DF0145-17-0 materials for LB agar preparation
Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader Biotek NEO2MB microplate UV/Vis region plate reader
Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V Avantor/ VWR CPX-952-316R sonicating water bath
crystal violet (CV), ACS grade, 100 g Fisher Scientific C581-100 biofilm biomass stain
Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH Avantor/ VWR CABDH1115-1LP media components for cryopreservation
Easypet 3, pipet controller Avantor/ VWR CA11027-980 serological pipettor for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL Avantor/ VWR CA89125-338 multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL Avantor/ VWR CA89125-340 multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade Fisher Scientific A38-212 CV destain
Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX Fisher Scientific 14957H/ 9820-18 materials for cell culturing
Glycerol, 4 L glass bottle ACS Fisher Scientific BP229-4 media components for cryopreservation
L-Cysteine, 98%, 250 g Avantor/ VWR 97061-204 universal neutralizing solution
L-glutathione reduced, 98%, 25 g Fisher Scientific AAJ6216614 universal neutralizing solution
L-Hisitidine, 98%, 100 g Avantor/ VWR CA97062-598 universal neutralizing solution
MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS Innovotech 19112 material for 96 well MBEC device biofilm cultivation
McFarland Standard, 0.5 EA Fisher Scientific R20410 cell culture standardization
McFarland Standard, 1.0 EA Fisher Scientific R20411 cell culture standardization
NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS Fisher Scientific 167008 microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements
PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK Sarstedt 72.1981.202 pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 Fisher Scientific FB0875712 materials for LB agar preparation
Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g Fisher Scientific P288-500 PBS component/ buffer
Sodium chloride, ACS grade, 3 kg Fisher Scientific S2713 media components for LB broth and PBS
sodium phosphate monobasic, 1 kg Fisher Scientific S369-1 PBS component/ buffer
Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 Avantor/ VWR 28145-505 non-autoclavable solution sterilization
Tin foil, heavy duty, 50 feet Grocery store — materials for deepwell device sterilization
Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA Fisher Scientific B11922 media components for LB broth
Tween-20, 100 mL Fisher Scientific BP337-100 recovery media solution
Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS Avantor/ VWR 37001-520 materials for biofilm dilution preparation
Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g Fisher Scientific BP1422-500 media components for LB broth
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Bacterial BiofilmBiofilm BiomassPCR-plate Deep Well MicroplatePeg Lid Biofilm DeviceCrystal Violet StainingAntimicrobial Susceptibility TestingMinimum Biofilm Eradication Concentration (MBEC)

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Doucet, A. N., Slipski, C. J., Golding, G. R., Mulvey, M. R., Bay, D. C. Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices. J. Vis. Exp. (182), e63069, doi:10.3791/63069 (2022).
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