PCRプレートディープウェルマイクロプレートデバイスを用いた細菌バイオフィルムバイオマスの生成

この研究の目的は、ディープウェルバイオフィルムデバイスを使用して、より大きな体積、ハイスループット(96ウェル)、静的バイオフィルムデバイス測定を行う方法を提供することでした。ここでは、ディープウェルデバイスとして知られるディープウェルマイクロプレートに挿入された自己組織化セミスカートPCRプレートを、一般的に使用される標準的なバイオフィルムペッグ蓋デバイスと比較して、静的バイオフィルムを形成する能力を調べた。CV染色バイオマスおよびバイオフィルム根絶アッセイ(MBEC)を用いて、両方の装置によるバイオフィルム形成を評価した。 各装置上の異なる種によるバイオフィルム形成を比較するために、我々は、バイオフィルムCV染色プロトコル17を用いて、大腸菌BW25113および緑膿菌PAO1によって形成されたバイオフィルムバイオマスを評価した。CV染色は一般にA550nm値として報告されていますが、各デバイスの成長量と利用可能な表面積の違いにより、CV染色A550nm値を溶液中のモルCV濃度に変換しました。モルCV濃度は、各装置の体積差を説明し、各装置から回収されたバイオマスを表すCV濃度の比較を可能にした。結果は、両方の種が標準的なバイオフィルムデバイス(図3A-B)と比較して、ディープウェルバイオフィルムデバイス(2.1倍大腸菌;4.1倍緑膿菌)上で有意に多くのバイオマスを産生することを示した(図3A-B)。この結果は、標準装置ペグ表面積(108.9mm2)と比較して、ディープウェルPCRペグ(320.4mm2)の表面積が大きいことを考えると予想されました。この知見はまた、標準的なデバイスウェル(200μL)と比較して、ディープウェルバイオフィルムデバイスで使用される増加した体積(750μL)の増加と一致している。したがって、ディープウェルデバイスは、標準的なバイオフィルムデバイスを備えたより小さなペグと比較して、PCRチューブペグ上のバイオフィルムバイオマス蓄積を増加させた。 両バイオフィルムデバイスは、大腸菌および緑膿菌によって形成された生物学的に複製されたバイオフィルムを比較したときに再現可能なバイオフィルムを形成した(図3A−B)。ディープウェル装置で増殖したいずれの菌株についても、CV染色されたM A550nm値の技術的複製においてより大きな変動性が観察されたにもかかわらず、ペアワイズ二元分散分析(ANOVA)またはスチューデントのT検定(両方ともp >0.05)。この知見は、ディープウェルおよび標準デバイスによるバイオフィルム形成が再現可能なバイオフィルムを形成することを示している。しかし、CV染色の結果から、各装置のペグ表面積差を考慮したところ、大腸菌と緑膿菌によるバイオフィルムバイオマス形成はバイオマス蓄積に統計的に有意な差を示したことも示しました(表1)。大腸菌のペグ表面積(mm2)あたりの平均CV染色バイオマス(M)の計算により、ポリプロピレン製ディープウェル装置では、標準的なバイオフィルム装置と比較してバイオフィルム形成が1.5倍低いことが示されました(表1)。しかし、緑膿菌では反対の結果が得られ、標準的なバイオフィルム装置と比較して、ポリプロピレン製ディープウェル装置で1.4倍高いCV M/mm2が実証されました(表1)。各デバイスによるバイオフィルムバイオマス蓄積の種特異的な違いが観察されたにもかかわらず、ディープウェルデバイスは依然として、各種によるバイオフィルムバイオマス形成全体(2〜4倍の増加)を実証した(図3)。 ディープウェルバイオフィルムデバイスの抗菌感受性試験用途を決定するために、我々は、バイオフィルム根絶の可能性について、一般的に使用される2つの消毒剤、BZKおよび漂白剤を比較した。両方の化学物質は、臨床的および産業的用途において細菌バイオフィルムを防止(BZK)および/または根絶(漂白)するために一般的に使用されている21,22,23。各化合物を、標準およびディープウェルバイオフィルムデバイス上の大腸菌および緑膿菌によって形成されたバイオフィルムに2倍の濃度で添加した22,23(図1、2B)。陰性対照ウェルと区別がつかないOD600nm値をもたらしたBZKまたは漂白剤の最低濃度をMBEC値と定義した。標準的なバイオフィルム装置上に形成されたバイオフィルムを漂白剤で処理すると、大腸菌および緑膿菌について0.625%の同じ漂白MBEC値が得られた(表1、図4A−B)。ディープウェル装置上に形成された大腸菌および緑膿菌バイオフィルムについて決定された漂白剤MBEC値は、両種によって2〜4倍低いMBEC値を示した(大腸菌;0.156%;緑膿菌 0.313%)を標準装置と比較した場合(表1)。種間の漂白剤MBEC値の2倍の差がディープウェル装置で認められ、緑膿菌は大腸菌と比較してバイオフィルムを根絶するために2倍高い濃度の漂白剤を必要とした(図4A-B、表1)。ディープウェル装置における緑膿菌と大腸菌との間の2倍の漂白剤MBEC差は、大腸菌と比較して緑膿菌によるCV染色バイオマス形成の1.5倍の増加と逆相関しているようである(図3A-B)。 ディープウェルデバイスペグ上で緑膿菌によって形成されるバイオマスの量が多いことも、ディープウェル上の大腸菌と比較して、緑膿菌バイオフィルムを根絶するためにより高い漂白剤濃度が必要であった理由を説明するかもしれない(図3A-B、表1)。したがって、ディープウェルデバイスバイオフィルム根絶アッセイは、両方の種が漂白剤の影響を受けやすいが、標準的なデバイスと比較して低い(2〜4倍)漂白剤濃度であったことを示している。これは、ディープウェルデバイスPCRプレートペグの3倍大きいペグ表面積および体積と反比例する。このことは、漂白剤曝露の場合、バイオマス表面積が大きいほど、バイオフィルム根絶に必要な漂白剤濃度を低下させる可能性があることを示唆している。 BZKバイオフィルム根絶試験は、漂白剤の結果と比較した場合、各種によって回収された増殖(OD600nm値)およびMBEC値においてより大きな変動性を示した(図4C−D)。この変動性は、BZKが十分に確立されたバイオフィルムを根絶するよりもバイオフィルム形成の予防に効果的であることを示す以前の研究に基づいて予想外ではない24,25,26。標準的なバイオフィルム装置を用いて、BZKで処理した緑膿菌バイオフィルムのみが、ディープウェル装置においてこの株について得られたMBEC値(20480μg/mL)よりも8倍低い一貫したMBEC値(2560μg/mL)を示した(表1、図4C)。これらの結果は、標準的な装置ペグと比較した場合、深くよく固定された表面およびプラスチック組成物上に形成される緑膿菌バイオマスの量の違いを反映し得る。ディープウェルと標準デバイスの両方で大腸菌によって形成されたバイオフィルムのBZK根絶は同等に貧弱であり、ディープウェルデバイスでは2560-40960μg/mL、標準デバイスでは320-10240μg/mLの広範囲のBZK MBEC値が得られました(図4D)。大腸菌の場合、この変動性は、1〜2個の複製ウェルが回収培地において低いが統計的に有意な成長を示し、いずれの装置でも誤差が増加し、BZK MBEC決定精度が低下した時折の事例によって説明された(図4D、表1)。この変動性は、以前に研究で指摘されたように、大腸菌バイオフィルムを根絶する際にBZKを使用することの非有効性を強調している24,25,26。対照的に、緑膿菌バイオフィルムは、両方の装置で定義された濃度でBZKによって確実に根絶することができたが、8倍のBZK濃度差を有する(図4C)。要約すると、緑膿菌によって形成されたバイオフィルムのBZK除菌MBEC値は、各装置で別個のMBEC値を示すが、しかしながら、両装置は、大腸菌の正確なBZK除菌表現型を区別するのに等しく劣っている。 したがって、本明細書に記載のディープウェルバイオフィルムデバイス法は、標準的なバイオフィルムデバイスと比較した場合、再現性のあるバイオフィルムを形成するのに同様に有効である。 図1.実験の概略概要。 凍結保存ストックからの単一コロニーの0日目の単離;単一コロニーによる成長培地の1日目接種;バイオフィルムプレートの2日目接種;3日目CV染色または抗菌チャレンジ;4日目バイオフィルム回収媒体への超音波処理;5日目に回収プレートのOD600nmを読み取ってMBEC値を求めた。セルヴィエ・メディカル・アート(smart.servier.com)が提供する図のいくつかの画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2.プロトコルのさまざまなステップについて示されたプレートレイアウトの例。A) 2つの細菌株(大腸菌 および 緑膿菌)からの1日目の細菌培養物を使用して、それぞれ3つの生物学的複製を有する最初の24時間バイオフィルム増殖のための最終プレートセットアップ。陰性対照ウェル(灰色)は、滅菌対照(細菌無添加)として使用される。 B) バイオフィルムの抗菌性チャレンジのためのプレートセットアップ。色が濃くなると、抗菌濃度が増加することを示します。陰性対照は細菌を添加していない井戸(灰色)であり、陽性対照は抗菌暴露のないバイオフィルム(オレンジ色)である。パネルAから採取したバイオフィルムペグ蓋は、抗菌暴露のためにこの深いウェルプレートに移されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3.CV染色した大腸菌BW25113のモル濃度(M)である。(A)および緑膿菌PAO1(B)バイオフィルムバイオマスは、標準(円)およびディープウェル(三角形)装置から回収される。CV染色は、550nm(A550nm)におけるCVの吸光度を読み取ることによって測定し、深いウェルA550nmの測定値は、デバイス間の体積差を説明するために3.809(800μL/210μL)の係数で調整した。CVモル濃度(M)は、ビール・ランバートの法則(CV濃度=A550nm/εl)によって決定した。ここで、96ウェル平底マイクロタイタープレートにおける210μLの経路長(l)は0.56cmであり、251500cm-1M-139のA550nmにおける水中でのCVの吸光係数(ε)を決定した。結果は、バイオフィルムとして増殖した各株の3つの生物学的反復からの9つの技術的反復を表し、各生物学的複製物の中央値は、各プロットにおいて水平バーとして示されている。装置間のバイオマスの統計的に有意な差を、両側対応t検定を用いて生物学的複製中央値間で決定した(大腸菌p=0.008-0.018(*);P. 緑膿菌 p= 0.002-0.009 (**)) をアスタリスクの付いたバーで示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。  図4.抗菌MBEC濃度の測定。緑膿菌PAO1(A,C)および大腸菌BW25113(B,D)に対する漂白剤(A,B)およびBZK(C,D)に対する抗菌MBEC濃度の測定は、標準(白いバー)およびディープウェル(灰色のバー)バイオフィルムペッグ装置で増殖させた場合。結果は、回収培地への超音波処理および一晩インキュベーション後に回収されたバイオフィルムのOD600nmの読み取りによって決定された。ディープウェルOD600nmは、デバイス間の体積差を考慮して3.75倍(750 μL / 210 μL)で調整されました。結果は、3つの生物学的反復の代表であり、エラーバーは、各抗菌濃度における反復間の標準偏差を示す39。各棒グラフの上のアスタリスク(*)は、両側スチューデントのT検定計算を使用して、p値が0.05<ブランク対照からのOD600nm値の統計的に有意な差を示しています。各棒グラフの上の円記号(o)は、ブランク対照から統計的に有意なOD600nm値を有していた反復が1回または2回のみであった測定値を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 BZK MBEC (μg/mL) 漂白剤 MBEC (% v/v) ひずみ試験済み ディープウェル装置 標準デバイス ディープウェル装置 標準デバイス 大腸菌 BW25113 · 2560-40960 320-10240 0.156 0.625 緑膿菌 パオ1 20480 2560 0.313 0.625 ディープウェル装置 標準デバイス p値** 折りたたみ交換(ディープウェル/スタンダード) ひずみ試験済み 平均CV M*/mm2 ± SD 平均CV M*/mm2 ± SD 大腸菌 BW25113 · 1.99 x 10-8 ± 3.25 x10-9 3.03 X 10-8 ± 3.31 X 10-9 0.0176 -1.52 緑膿菌 パオ1 8.01 X 10〜8 ± 9.42 X 10〜9 5.72 x 10-8 ± 9.42 x 10-9 0.034 1.4 表 1. 大腸菌 BW25113および 緑膿 菌PAO1の要約は、様々な装置上のBZKおよび漂白剤のCV染色バイオマスM/mm2 値およびバイオフィルム除菌MBEC値を意味する。*生物学的複製CV M値の中央値を用いて算出した平均CV M/mm2値は、CV M値を複製します(図3)。**p値は両側スチューデントのT検定を使用して決定されました。