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Immunologia e infezioni

Generazione di biomassa di biofilm batterico maggiore utilizzando dispositivi a micropiastra profonda a piastra PCR

Published: April 22, 2022
doi:
10.3791/63069
, , , ,
1Department of Medical Microbiology and Infectious Diseases,University of Manitoba, 2National Microbiology Laboratory,Public Health Agency of Canada

Summary

Questo protocollo presenta la metodologia per eseguire misurazioni della crescita del biofilm e della biomassa utilizzando dispositivi PCR-plate a pozzo profondo autoassemblati per lo screening statico del biofilm a coperchio ancorato a 96 pozzetti ad alta produttività.

Abstract

I biofilm batterici sono difficili da sradicare dalle superfici utilizzando interventi antimicrobici convenzionali. I metodi di micropiastre ad alta produttività a 96 pozzetti sono spesso utilizzati per coltivare biofilm batterici per test rapidi di suscettibilità antimicrobica per calcolare i valori minimi di concentrazione di eradicazione del biofilm (MBEC). I dispositivi standard per biofilm sono costituiti da coperchi ancorati in polistirene montati su micropiastre a 96 pozzetti e sono ideali per misurare la biomassa del biofilm e i valori MBEC, ma questi dispositivi sono limitati dalla superficie del piolo disponibile per l’accumulo e il costo della biomassa. Qui, delineiamo un protocollo per utilizzare il dispositivo con coperchio ancorato in polipropilene a 96 pozzetti profondi a 96 pozzetti per far crescere i biofilm Escherichia coli BW25113 e Pseudomonas aeruginosa PAO1. Viene descritto un confronto di biofilm di 24 ore formati su dispositivi di pozzi standard e profondi da ciascuna specie utilizzando la colorazione della biomassa viola cristallina e i saggi di determinazione MBEC. La maggiore superficie dei dispositivi a pozzo profondo ha aumentato la formazione complessiva di biofilm da entrambe le specie di 2-4 volte. P. aeruginosa ha formato una biomassa significativamente maggiore/mm2 su pioli profondi rispetto al dispositivo standard. E. coli aveva una maggiore biomassa/mm2 sui dispositivi standard in polistirene rispetto al dispositivo a pozzo profondo. I saggi di eradicazione del biofilm con disinfettanti come l’ipoclorito di sodio (candeggina) o il benzalconio cloruro (BZK) hanno dimostrato che entrambi i composti potrebbero eliminare i biofilm di E. coli e P. aeruginosa da entrambi i dispositivi, ma a valori MBEC diversi. L’eradicazione del biofilm BZK ha portato a valori variabili di E. coli MBEC tra i dispositivi, tuttavia, la candeggina ha dimostrato valori MBEC riproducibili sia per specie che per dispositivi. Questo studio fornisce un metodo di pozzo profondo ad alta produttività per la coltivazione di grandi quantità di biofilm su dispositivi in polipropilene per studi a valle che richiedono quantità più elevate di biofilm statico.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa ed Escherichia coli sono proteobatteri Gram-negativi che sono comunemente studiati per la loro capacità di formare comunità cellulari sessili attaccate alla superficie note come biofilm1. Entrambe le specie, quando crescono come biofilm, possono secernere una matrice di sostanze polimeriche extracellulari (EPS) composta principalmente da diversi polisaccaridi e proteine, che possono anche includere DNA e/o lipidi extracellulari, fornendo una maggiore protezione cellulare e una maggiore sopravvivenza in ambienti difficili e con nutrienti limitati2,3. La fisiologia e la formazione del biofilm da parte di entrambe le specie è di rilevanza clinica, in quanto rappresentano i primi cinque patogeni resistenti agli antimicrobici più comunemente isolati dal sangue dei pazienti ospedalieri, dalle infezioni del tratto urinario e polmonare in Canada4,5. È anche importante notare che si stima che i biofilm costituiscano quasi l’80% di tutte le infezioni croniche e ricorrenti causate da queste specie batteriche6. A causa delle sostanze EPS secrete e dell’attività metabolica più lenta7,8, i biofilm consolidati diventano più difficili da sradicare quando si formano su superfici quali dispositivi medici impiantati, tessuti cicatriziali e nei polmoni dei pazienti affetti da fibrosi cistica9,10, aumentando la loro resistenza antimicrobica.

Le proprietà di crescita recalcitranti dei biofilm batterici spesso li rendono più resistenti all’inibizione e/o all’eradicazione antimicrobica2,9. Pertanto, stabilire metodi in vitro per studiare l’eradicazione antimicrobica del biofilm batterico è fondamentale per selezionare composti efficaci per sradicare le infezioni quando si formano su plastiche mediche (ad esempio, cateteri in abitazione) e impianti medici. La maggior parte dei metodi rapidi di coltivazione di eradicazione antimicrobica del biofilm in vitro esaminano la crescita del biofilm come una coltura di biofilm “statica” piuttosto che colture “continue”, in cui la crescita batterica statica viene monitorata nelle fasi iniziali e tardive della formazione del biofilm in un breve lasso di tempo (24-96 ore) nello stesso mezzo di crescita. I metodi di biofilm continuo sono ingombranti per un’analisi rapida in quanto richiedono una crescita del biofilm valutata su intervalli di tempo più lunghi coltivati in camere che consentono il flusso continuo e la sostituzione dei mezzi di crescita con meno repliche11. A causa del tempo e degli sforzi necessari per mantenere e stabilire biofilm continui, i biofilm statici in vitro sono i più popolari, in quanto sono facilmente adattabili per saggi di suscettibilità antimicrobica ad alta produttività in piastre di microtitolazione in plastica a 96 pozzetti piuttosto che elaborati sistemi di camere di flusso che limitano il numero di colture testate contemporaneamente 12,13 . I più semplici saggi statici “in-well” di micropiastre di biofilm utilizzano piastre di microtitolazione standard in polistirene o vinile (capacità 300 μL) per misurare la formazione di biofilm sui lati e sul fondo di ciascun pozzo e spesso come anelli all’interfaccia aria-superficie liquida. La formazione di biofilm batterico in pozzo viene misurata colorando la biomassa depositata aderente ai pozzetti dopo che il liquido del mezzo di crescita è stato rimosso e i biofilm sono stati lavati12,13. Questi saggi sono economicamente popolari, ma spesso hanno problemi di riproducibilità a causa del loro design intrinseco, poiché i biofilm depositati sono soggetti a danni o perdite durante il risciacquo per il recupero cellulare e le procedure di colorazione della biomassa11,14.

Per ridurre le perdite di biofilm, i dispositivi di biofilm commerciali standard hanno migliorato i progetti di micropiastre a biofilm in-well aggiungendo un coperchio in polistirene ancorato a 96 pozzetti inseribile al design standard della piastra in-well 96, indicato come il “dispositivo biofilm standard” nel presente documento. L’aggiunta di un coperchio ancorato espande la superficie disponibile in ciascun pozzetto di micropiastre, consentendo una maggiore aderenza superficiale e la formazione di biomassa da biofilm15,16. I dispositivi standard con coperchio ancorato al biofilm consentono un maggiore recupero, rimozione e risciacquo del biofilm per la successiva suscettibilità al biofilm antimicrobico e i test di eradicazione quando i coperchi ancorati vengono inseriti in nuove piastre di microtitolazione contenenti problemi di droga o condizioni di crescita. Simile alle tecniche di micropiastre in biofilm in-well, i materiali recuperati dai dispositivi di coperchio ancorati rimossi e lavati consentono test di sopravvivenza cellulare e colorazione della biomassa del biofilm, in genere coinvolgendo formulazioni di coloranti viola cristallino (CV) 17,18,19. I dispositivi a biofilm standard sono anche ottimali per lo screening delle suscettibilità antimicrobiche del biofilm. Questi saggi monitorano l’inibizione della crescita del biofilm in due modi: 1) Quando gli antimicrobici vengono aggiunti alle cellule all’inizio della crescita, possono determinare il valore minimo della concentrazione di inibizione del biofilm (MBIC). 2) Quando i biofilm stabiliti si formano sui pioli dopo 24 ore e quindi esposti agli antimicrobici, possono determinare il valore minimo della concentrazione di eradicazione del biofilm (MBEC) 17,20. Simili ai dispositivi a micropiastra a biofilm in-well, i dispositivi a biofilm standard presentano alcune notevoli limitazioni, come il loro alto costo per dispositivo, non sono autoclavabili e meno resistenti ai solventi chimici a causa del materiale in polistirene utilizzato. I dispositivi a biofilm standard hanno anche un basso rapporto superficie/ancoraggio, che limita i volumi massimi di lavoro in ciascun pozzo a 200 μL. Questi fattori possono rendere i dispositivi biofilm standard più difficili da utilizzare per studi che richiedono maggiori quantità di biofilm in un formato ad alta produttività.

Qui, descriviamo un metodo di biofilm statico ancorato a 96 pozzetti sviluppato nel nostro laboratorio utilizzando piastre PCR semi-battiscopa da 0,5 mL a 96 pozzetti in polipropilene disponibili in commercio montate su piastre di microtitolazione a 96 pozzetti con pozzetti più profondi della piastra standard (Table of Materials). Questi dispositivi assemblati hanno un volume massimo di lavoro di 750 μL se utilizzati per la coltivazione di biofilm (di seguito noto come “dispositivo di biofilm profondo”). I vantaggi dell’utilizzo di questi dispositivi a biofilm per pozzi profondi sono il loro costo inferiore rispetto ai dispositivi a biofilm standard, possono essere sterilizzati in autoclave e aumentano la superficie per la formazione di biofilm sulla piastra PCR esterna più grande “tubo / pioli”. Con questo metodo mostriamo le applicazioni di questi dispositivi per la coltivazione e la caratterizzazione della biomassa di biofilm formata da Escherichia coli BW25113 e P. aeruginosa PAO1. I metodi per determinare i valori MBEC utilizzando saggi di eradicazione del biofilm sono descritti utilizzando gli antimicrobici disinfettanti del composto di ammonio quaternario benzalconio cloruro (BZK) e ipoclorito di sodio (candeggina). L’antisettico/disinfettante BZK è stato selezionato in quanto questo composto viene spesso utilizzato per inibire i biofilm da superfici contaminate, ma secondo quanto riferito è meno efficace nell’eradicare biofilm ben consolidati21. La candeggina è una sostanza chimica altamente efficace per l’eradicazione di biofilm consolidati ed è un pilastro nella disinfezione chimica 22. Entrambi i disinfettanti forniscono un utile confronto dei valori MBEC per ciascun dispositivo biofilm21. Un protocollo per questa valutazione del dispositivo di biofilm utilizzando la colorazione CV e i saggi di eradicazione del biofilm per la determinazione MBEC è riassunto in questo articolo. È stato incluso un diagramma di flusso del protocollo per una panoramica semplificata del flusso di lavoro per questi metodi (Figura 1).

Protocol

1. Preparazione della coltura asettica per la crescita del biofilm (Giorni 0-1) Il giorno 0, strisciare il ceppo batterico desiderato (s) per il test da un ceppo crio-conservato (in glicerolo o dimetilsolfossido (DMSO)) direttamente su una piastra di agar nutriente con selezione antimicrobica come il ceppo richiede. Incubare le piastre di agar alla temperatura ottimale (37 °C) e al tempo (18-22 h) per la crescita del ceppo. Il giorno seguente (Giorno 1), inoculare una colonia dalla piastra di agar in 5 ml di terreno di crescita in condizioni di crescita ottimali. Queste colture saranno utilizzate come inoculate di partenza del Giorno 2 per i dispositivi a biofilm (vedere il passaggio 2.2; Figura 1).NOTA: Per questo studio, E. coli K-12 BW21153 e P. aeruginosa PAO1 sono stati coltivati in terreno Luria-Bertani (LB) a 37 °C per 18 ore con agitazione a 160 giri al minuto (rpm). Preparare almeno 3 ceppi coltivati in modo indipendente per generare repliche biologiche per la misurazione del biofilm a causa della variabilità statistica della formazione di biomassa di biofilm sui dispositivi con coperchio ancorato. 2. Preparazione e inoculazione delle piastre (Giorno 2) Riempire i pozzetti esterni di una piastra autoclavata in polipropilene da 96 pozzetti, 1,1 mL/pozzetto con acqua sterile da 750 μL/pozzo (Figura 2A). Riempire i pozzetti di controllo negativi (pozzetti di media non incoliati; colonna B) con mezzi di crescita da 750 μL e i restanti pozzetti con mezzi di crescita da 675 μL.NOTA: il passaggio 2.1 sopra e i passaggi seguenti elencano i volumi appropriati per il dispositivo di biofilm del pozzo profondo. Se si utilizza il dispositivo standard a biofilm, i volumi devono essere modificati come segue: da 75 μL di coltura di inoculo a 20 μL; da 675 μL di substrati di crescita a 180 μL; da 750 μL di acqua sterile/mezzo di crescita a 200 μL; 800 μL di colorazione CV/acido acetico/soluzioni di risciacquo a 210 μL. Inoltre, per il punto 3.6 di seguito, l’assorbanza a 500nm (A550 nm) può essere letta direttamente nella micropiastra di polistirene dopo la miscelazione quando si utilizza la micropiastra standard del dispositivo biofilm. Utilizzando le colture notturne del giorno 1, standardizzare le colture a una densità ottica a 600 nm (OD600nm) = 1,0 o a uno standard McFarland di 0,5-1 unità. Creare una diluizione seriale di 10 volte di ogni coltura standardizzata in provette o una piastra di microtitolazione profonda 96 pozzetti fino a raggiungere una diluizione 10-3 . Inoculare il mezzo contenente pozzetti come mostrato in Figura 2B con 75 μL della coltura diluita 1 x 10-3 , per una diluizione batterica finale in pozzo di 10-4. Inserire con attenzione una piastra PCR autoclavata (coperchio ancorato) nella piastra del pozzo profondo inoculata. Incubare le piastre in condizioni di deformazione ottimali (37 °C) con agitazione (massimo 160 giri/min) in un incubatore con il 50-60% di umidità per 24 ore. 3. Determinazione della biomassa del biofilm da dispositivi che utilizzano la colorazione CV (Giorno 3) Rimuovere asetticamente il coperchio ancorato al biofilm da ciascun dispositivo e risciacquare inserendo in un pozzo profondo autoclavato una piastra preparata con 800 μL di soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS) / pozzetto per 30 s per rimuovere le cellule planctoniche. Per la colorazione CV da biomassa, trasferire il coperchio della piastra PCR ancorato in una nuova piastra preparata con CV da 800 μL / pozzetto 0,1% (p / v) in dH2O e macchiare per 5 minuti. Rimuovere la macchia in eccesso risciacquando il coperchio ancorato in una piastra profonda preparata con PBS sterile da 800 μL/pozzetto. Lasciare asciugare le piastre per 10 minuti in un armadietto di biosicurezza con pioli rivolti verso l’alto. Trasferire il coperchio della piastra PCR essiccata in una piastra contenente 800 μL/pozzetto di acido acetico al 30% (v/v) e lasciare che il coperchio si scolorisca per 5 minuti. Rimuovere il coperchio del piolo PCR destained e mescolare accuratamente la soluzione mediante pipettaggio. Trasferire 200 μL dalle piastre del pozzo profondo a una micropiastra standard da 96 pozzetti e misurare l’assorbanza della soluzione di decolorazione a una lunghezza d’onda di 550 nm (A550 nm) in un lettore di micropiastre ultravioletto (UV) / visibile (Vis). Utilizzando i valori A550nm misurati, sottrarre il valore medio di A550nm in bianco (controllo negativo) da ciascun valore del campione di biofilm. Media di ogni valore del campione di biofilm A550nm sottratto in bianco che rappresenta le repliche biologiche del campione. 4. Sfidare i biofilm con antimicrobici per calcolare il loro valore MBEC antimicrobico di 24 ore (Giorno 3) Preparare una soluzione madre antimicrobica in acqua che sia due volte (2x) la concentrazione della più alta concentrazione antimicrobica desiderata da testare. Creare una serie di diluizione doppia della soluzione madre antimicrobica in 2x mezzi di crescita concentrati in modo che ci siano 8 concentrazioni antimicrobiche. Come mostrato nella Figura 2B, riempire i pozzetti esterni di una piastra di pozzo profondo autoclavata con acqua sterile da 750 μL/pozzo. Riempire le colonne B (controllo negativo; nessun batterio) e C (controllo positivo; nessuna esposizione antimicrobica) della piastra con 750 μL/terreno di crescita. Riempire i pozzetti rimanenti con 750 μL/pozzetto della serie di diluizione antimicrobica come mostrato nella Figura 2B. Rimuovere e risciacquare il coperchio ancorato come descritto al punto 3.1 e trasferirli nella piastra di sfida antimicrobica. Incubare piastre con scuotimento (max 160 rpm) in condizioni di deformazione appropriate e per il periodo di esposizione desiderato. 5. Recupero della biomassa del biofilm da coperchi ancorati (Giorno 4) Rimuovere i coperchi ancorati esposti agli antimicrobici e risciacquare come descritto al punto 3.1. Trasferire il coperchio ancorato su una piastra di pozzo profondo con 750 μL/mezzo di recupero del pozzo nei pozzetti interni e 750 μL/pozzetto sterile dH2O nei pozzetti esterni. Per preparare 70 mL di mezzi di recupero, combinare 35 mL di 2x LB concentrato, 0,7 mL di interpolazione al 100% 20, 3,5 mL di soluzione neutralizzante universale 20x e 30,8 mL di dH2O sterile in un flacone sterile. Per preparare 20x soluzione neutralizzante universale concentrata, aggiungere 1,0 g di L-istidina, 1,0 g di L-cisteina e 2,0 g di glutatione ridotto a un volume finale di 20 mL di dH2O. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 μm e conservare a 4 °C. Inserire il dispositivo dal passaggio 5.1 in un contenitore secondario montato all’interno di un bagno d’acqua sonicante. Sonicare i dispositivi per 30 minuti per rimuovere il biofilm dai pioli nel supporto di recupero. Dopo la sonicazione, rimuovere il coperchio ancorato e posizionare un coperchio sterile a piastra piatta sulla piastra di recupero del pozzo profondo. Il coperchio ancorato può essere scartato. Incubare piastre con mezzi di recupero dal passaggio 5.3 alle condizioni ottimali di crescita della deformazione durante la notte (16-18 h). 6. Determinazione dei valori MBEC del dispositivo (Giorno 5) Il giorno seguente, trasferire 200 μL da ciascun pozzetto della piastra del pozzo profondo incubato dal passo 5.4 a una nuova piastra di microtitolazione a 96 pozzetti. Leggere l’OD600nm di ciascun pozzo utilizzando un lettore di micropiastre della gamma UV/Vis. Sottrarre i valori di controllo negativo (bianco non inoculato) OD600nm da ciascun biofilm contenente il pozzo del campione. Calcolare il valore MBEC per ciascun campione utilizzando i valori di OD600nm , dove il valore MBEC è la concentrazione antimicrobica più bassa che ha portato al valore OD600nm più basso (indistinguibile dal controllo non ininoculato) per uno specifico campione di specie/ceppo trattato con antimicrobico.

Representative Results

Lo scopo di questo studio era quello di fornire un metodo per condurre misurazioni di dispositivi di biofilm statici a volume maggiore, ad alto rendimento (96 pozzetti) utilizzando dispositivi a biofilm a pozzo profondo. Qui, abbiamo confrontato una piastra PCR semi-minigonna auto-assemblata inserita in una micropiastra profonda, nota come dispositivo per pozzi profondi, con un dispositivo di coperchio ancorato a biofilm standard comunemente usato per esaminare le loro capacità di formare biofilm statici. I saggi di biomassa e di eradicazione del biofilm (MBEC) colorati con CV sono stati utilizzati per valutare la formazione di biofilm da entrambi i dispositivi. Per confrontare la formazione di biofilm da parte di specie diverse su ciascun dispositivo, abbiamo valutato le biomasse di biofilm formate da E. coli BW25113 e P. aeruginosa PAO1 utilizzando il protocollo di colorazione CV del biofilm17. Sebbene la colorazione CV sia generalmente riportata come valori A550nm, a causa delle differenze nei volumi di crescita di ciascun dispositivo e delle loro superfici disponibili abbiamo convertito i valori A550nm della colorazione CV in concentrazioni molari CV in soluzione. Le concentrazioni di CV molari hanno tenuto conto delle differenze di volume di ciascun dispositivo e hanno permesso un confronto delle concentrazioni di CV che rappresentano le biomasse recuperate da ciascun dispositivo. I risultati hanno mostrato che entrambe le specie hanno prodotto significativamente più biomassa su dispositivi a biofilm per pozzi profondi (2,1 volte E. coli; 4,1 volte P. aeruginosa) rispetto al dispositivo di biofilm standard (Figura 3A-B). Questo risultato era atteso data la maggiore superficie del piolo PCR del pozzo profondo (320,4 mm2) rispetto alla superficie standard del dispositivo (108,9 mm2). Questo risultato è anche coerente con l’aumento dei volumi (750 μL) utilizzati nel dispositivo a biofilm del pozzo profondo rispetto ai pozzetti del dispositivo standard (200 μL). Quindi, i dispositivi a pozzo profondo hanno aumentato l’accumulo di biomassa del biofilm sui pioli del tubo PCR rispetto ai pioli più piccoli con dispositivi di biofilm standard. Entrambi i dispositivi di biofilm hanno formato biofilm riproducibili quando abbiamo confrontato biofilm biologicamente replicati formati da E. coli e P. aeruginosa (Figura 3A-B). Nonostante l’osservazione di una maggiore variabilità nei valori M A550nm colorati cv-replicati tecnici per entrambi i ceppi cresciuti sul dispositivo del pozzo profondo, non ci sono state differenze statisticamente significative quando abbiamo confrontato i valori medi CV M per le repliche biologiche di ciascuna specie sul pozzo profondo o dispositivi standard utilizzando l’analisi bidirezionale a coppie della varianza (ANOVA) o i test T dello studente (entrambi p > 0,05). Questa scoperta mostra che la formazione di biofilm da parte di pozzi profondi e dispositivi standard formano biofilm riproducibili. Tuttavia, i risultati della colorazione CV hanno anche mostrato che quando abbiamo tenuto conto delle differenze di superficie dell’ancoraggio su ciascun dispositivo, la formazione di biomassa del biofilm da parte di E. coli e P. aeruginosa ha mostrato differenze statisticamente significative nell’accumulo di biomassa (Tabella 1). Il calcolo della biomassa media (M) macchiata cv per superficie del piolo in mm2 (CV M/mm2) per E. coli ha mostrato che la formazione di biofilm era 1,5 volte inferiore sui dispositivi a pozzo profondo in polipropilene rispetto al dispositivo a biofilm standard (Tabella 1). Tuttavia, il risultato opposto è stato ottenuto per P. aeruginosa, che ha dimostrato un CV M/mm2 1,4 volte superiore sui dispositivi a pozzo profondo in polipropilene rispetto ai dispositivi a biofilm standard (Tabella 1). Nonostante le differenze specie-specifiche osservate nell’accumulo di biomassa del biofilm con ciascun dispositivo, il dispositivo del pozzo profondo ha comunque dimostrato una maggiore formazione complessiva di biomassa da biofilm (aumento di 2-4 volte) da parte di ciascuna specie (Figura 3). Per determinare le applicazioni dei test di suscettibilità antimicrobica del dispositivo di biofilm del pozzo profondo, abbiamo confrontato due disinfettanti comunemente usati, BZK e candeggina, per il loro potenziale di eradicazione del biofilm. Entrambe le sostanze chimiche sono comunemente utilizzate per prevenire (BZK) e/o sradicare (candeggina) biofilm batterici in applicazioni cliniche e industriali21,22,23. Ogni composto è stato aggiunto in concentrazioni crescenti di 2 volte ai biofilm formati da E. coli e P. aeruginosa sui dispositivi di biofilm standard e profondi22,23 (Figure 1, 2B). La concentrazione più bassa di BZK o candeggina che ha portato a valori di OD600nm indistinguibili dai pozzetti di controllo negativi è stata definita come il valore MBEC. Il trattamento dei biofilm formati su dispositivi biofilm standard con candeggina ha portato agli stessi valori MBEC di candeggina dello 0,625% per E. coli e P. aeruginosa (Tabella 1, Figura 4A-B). I valori di MBEC di candeggina determinati per il biofilm di E. coli e P. aeruginosa formato su dispositivi a pozzo profondo hanno mostrato valori di MBEC 2-4 volte inferiori da entrambe le specie (E. coli; 0,156%; P. aeruginosa 0,313%) rispetto ai dispositivi standard (Tabella 1). Una differenza di 2 volte nei valori di MBEC di candeggina tra le specie è stata notata per il dispositivo a pozzo profondo, dove P. aeruginosa ha richiesto una concentrazione 2 volte maggiore di candeggina per sradicare i biofilm rispetto a E. coli (Figura 4A-B, Tabella 1). La differenza MBEC di candeggina 2 volte tra P. aeruginosa ed E. coli nel dispositivo del pozzo profondo sembra essere inversamente correlata con una maggiore formazione di biomassa macchiata cv di 1,5 volte da parte di P. aeruginosa rispetto a E. coli (Figura 3A-B). La maggiore quantità di biomassa formata da P. aeruginosa sui pioli del dispositivo del pozzo profondo può anche spiegare perché è stata necessaria una maggiore concentrazione di candeggina per sradicare i biofilm di P. aeruginosa rispetto a E. coli su pozzi profondi (Figura 3A-B, Tabella 1). Quindi, i saggi di eradicazione del biofilm del dispositivo a pozzo profondo mostrano che entrambe le specie erano suscettibili alla candeggina ma a concentrazioni di candeggina inferiori (2-4 volte) rispetto ai dispositivi standard. Ciò è inversamente correlato con la superficie e i volumi 3 volte maggiori dei pioli della piastra PCR del dispositivo a pozzo profondo. Ciò suggerisce che per l’esposizione alla candeggina, una maggiore superficie della biomassa può abbassare le concentrazioni di candeggina necessarie per l’eradicazione del biofilm. I test di eradicazione del biofilm BZK hanno mostrato una maggiore variabilità nella crescita recuperata (valori OD600nm) e MBEC da ciascuna specie rispetto ai risultati della candeggina (Figura 4C-D). Questa variabilità non è inaspettata sulla base di studi precedenti che dimostrano che BZK era più efficace nel prevenire la formazione di biofilm rispetto all’eradicazione di biofilm ben consolidati24,25,26. Utilizzando il dispositivo biofilm standard, solo i biofilm di P. aeruginosa trattati con BZK hanno mostrato un valore MBEC coerente (2560 μg/mL) che era 8 volte inferiore al valore MBEC (20480 μg/mL) ottenuto per questo ceppo nel dispositivo del pozzo profondo (Tabella 1, Figura 4C). Questi risultati possono riflettere differenze nelle quantità di biomassa di P. aeruginosa formata su superfici profonde ben ancorate e composizioni plastiche rispetto ai pioli del dispositivo standard. L’eradicazione BZK dei biofilm formati da E. coli sia sul pozzo profondo che sui dispositivi standard era ugualmente scarsa, con un’ampia gamma di valori BZK MBEC da 2560-40960 μg / mL per il dispositivo a pozzo profondo e 320-10240 μg / mL sul dispositivo standard (Figura 4D). Per E. coli, questa variabilità è stata spiegata dal caso occasionale in cui 1-2 pozzi replicati hanno mostrato una crescita bassa ma statisticamente significativa nei mezzi di recupero, che ha aumentato l’errore e ridotto l’accuratezza della determinazione BZK MBEC con entrambi i dispositivi (Figura 4D, Tabella 1). Questa variabilità evidenzia l’inefficacia dell’uso di BZK nell’eradicazione dei biofilm di E. coli, come precedentemente notato negli studi24,25,26. Al contrario, i biofilm di P. aeruginosa potrebbero essere eradicati in modo affidabile da BZK a una concentrazione definita con entrambi i dispositivi, ma con una differenza di concentrazione BZK di 8 volte (Figura 4C). In sintesi, i valori MBEC di eradicazione BZK dei biofilm formati da P. aeruginosa mostrano valori MBEC distinti con ciascun dispositivo, tuttavia, entrambi i dispositivi sono ugualmente poveri nel distinguere i fenotipi di eradicazione BZK precisi di E. coli. Pertanto, il metodo del dispositivo di biofilm profondo descritto nel presente documento è altrettanto efficace per la formazione di biofilm riproducibili rispetto a un dispositivo di biofilm standard. Figura 1. Panoramica schematica dell’esperimento. Giorno 0 isolamento di singole colonie da stock crioconservati; Giorno 1 inoculazione di substrati di crescita con singole colonie; Giorno 2 inoculazione della piastra del biofilm; Giorno 3 Colorazione CV o sfida antimicrobica; Giorno 4 sonicazione del biofilm in mezzi di recupero; e giorno 5 di lettura OD600nm della piastra di recupero per determinare i valori MBEC. Alcune immagini in figura fornite da Servier Medical Art (smart.servier.com). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2. Esempi di layout di piastre mostrati per vari passaggi del protocollo. A) La configurazione finale della piastra per la crescita iniziale del biofilm di 24 ore utilizzando colture batteriche Day 1 da due ceppi batterici (E. coli e P. aeruginosa), ciascuno con tre repliche biologiche. I pozzetti di controllo negativi (grigi) sono usati come controlli di sterilità (nessun batterio aggiunto). B) Configurazione della piastra per la sfida antimicrobica dei biofilm. I colori scuri indicano un aumento della concentrazione di antimicrobici. Il controllo negativo sono pozzi senza batteri aggiunti (grigio) e i controlli positivi sono biofilm senza esposizione antimicrobica (arancione). I coperchi dei pioli di biofilm prelevati dal pannello A vengono trasferiti a questa piastra profonda per l’esposizione antimicrobica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3. La concentrazione molare (M) di E. coli BW25113 colorato con CV. (A) e P. aeruginosa PAO1 (B) biomassa da biofilm recuperata da dispositivi standard (cerchi) e pozzi profondi (triangoli). La colorazione CV è stata misurata leggendo l’assorbanza del CV a 550 nm (A550nm) e le letture del pozzo profondo A550nm sono state regolate di un fattore di 3,809 (800 μL / 210 μL) per tenere conto delle differenze di volume tra i dispositivi. La concentrazione molare CV (M) è stata determinata dalla legge di Beer-Lambert (concentrazione CV = A550nm/εl); dove la lunghezza di percorso (l) di 210 μL nella piastra di microtitolazione a fondo piatto del pozzo 96 è stata determinata a 0,56 cm e il coefficiente di estinzione (ε) di CV in acqua ad A550nm di 251500 cm-1M-139. I risultati rappresentano 9 repliche tecniche da tre repliche biologiche di ciascun ceppo coltivato come biofilm e il valore mediano di ogni replica biologica è mostrato come una barra orizzontale in ogni grafico. Differenze statisticamente significative nella biomassa tra i dispositivi sono state determinate tra i valori mediani di replica biologica utilizzando un t-test accoppiato a due code (E. coli p = 0,008-0,018 (*); P. aeruginosa p= 0,002-0,009 (**)) indicati come barre con asterischi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.  Figura 4. Determinazione della concentrazione di MBEC antimicrobico. Determinazione della concentrazione di MBEC antimicrobico per candeggina (A,B) e BZK (C,D) per P. aeruginosa PAO1 (A, C) ed E. coli BW25113 (B,D) coltivata su dispositivi standard (barre bianche) e profondi (barre grigie) con biofilm ancorati. I risultati sono stati determinati dalla lettura dell’OD600nm del biofilm recuperato dopo la sonicazione in mezzi di recupero e l’incubazione notturna. Il pozzo profondo OD600nm è stato regolato di un fattore di 3,75 (750 μL / 210 μL) per tenere conto delle differenze di volume tra i dispositivi. I risultati sono rappresentativi di tre repliche biologiche e le barre di errore mostrano la deviazione standard tra le repliche a ciascuna concentrazione antimicrobica39. Gli asterischi (*) sopra ogni grafico a barre indicano differenze statisticamente significative nei valori di OD600nm rispetto ai controlli vuoti con valori p < 0,05 utilizzando i calcoli T-test di Student a due code. I simboli circolari (o) sopra ogni grafico a barre indicano misurazioni in cui solo 1 o 2 repliche avevano valori OD600nm statisticamente significativi da controlli vuoti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. BZK MBEC (μg/mL) Candeggina MBEC (% v/v) Provato a deformazione Dispositivo pozzo profondo Dispositivo standard Dispositivo pozzo profondo Dispositivo standard Coli BW25113 · 2560-40960 320-10240 0.156 0.625 P. aeruginosa PAO1 · 20480 2560 0.313 0.625 Dispositivo pozzo profondo Dispositivo standard p-value** Cambio piega (Pozzo profondo / Standard) Provato a deformazione CV medio M*/ mm2 ± SD CV M*/ mm2 ± SD medio Coli BW25113 · 1,99 x 10-8 ± 3,25 x10-9 3,03 x 10-8 ± 3,31 x 10-9 0.0176 -1.52 P. aeruginosa PAO1 · 8,01 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 5,72 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 0.034 1.4 Tabella 1. Un riassunto di E. coli BW25113 e P. aeruginosa PAO1 significano valori M / mm2 di biomassa macchiata di CV e valori MBEC di eradicazione del biofilm per BZK e candeggina su vari dispositivi.*Valori medi CV M/mm2 calcolati utilizzando valori CV M di replica biologica mediana (Figura 3).**valori p determinati utilizzando il test T dello studente a due code.

Discussion

Questo studio descrive i metodi per l’utilizzo di un dispositivo di crescita statica del biofilm ad alta produttività a 96 pozzetti di volume maggiore che coinvolge una micropiastra profonda in polipropilene dotata di un coperchio a piastra PCR semi-gonna per la formazione di biofilm (dispositivo di biofilm profondo; Tabella dei materiali). Abbiamo confrontato i biofilm generati con questo dispositivo con un dispositivo a biofilm standard in polistirene disponibile in commercio (Table of Materials). Il metodo del dispositivo del pozzo profondo utilizza gli stessi passaggi metodologici e le stesse soluzioni del dispositivo standard17 a volumi regolati modificati per i dispositivi del pozzo profondo, rendendo questo dispositivo ideale per la formazione di biofilm su larga scala e l’analisi sperimentale. La crescita di E. coli BW25113 e P. aeruginosa PAO1, due specie Gram-negative note per formare biofilm, sono state esaminate per la loro formazione di biomassa e i valori MBEC disinfettanti (BZK / candeggina) utilizzati su entrambi i dispositivi. Il confronto della biomassa colorata di CV formata su pioli da ciascun dispositivo ha mostrato che sia E. coli che P. aeruginosa formavano biofilm con biomassa più elevata sul dispositivo a biofilm del pozzo profondo rispetto al dispositivo standard (Figura 3A-B). L’aumento della biomassa del biofilm rifletteva la maggiore superficie dei pioli profondi del pozzo rispetto alla superficie standard del dispositivo. Quando abbiamo tenuto conto delle differenze nelle aree superficiali dei pioli (mm2) con entrambi i dispositivi, sono state notate differenze nella formazione di biomassa, dove E. coli ha formato una biomassa CV significativamente maggiore per mm2 sui pioli del dispositivo standard in polistirolo rispetto ai pioli del tubo PCR del dispositivo del pozzo profondo (Tabella 1). P. aeruginosa ha formato una maggiore biomassa/ piolo mm2 macchiata di CV rispetto ai dispositivi standard (Tabella 1). Questi risultati possono evidenziare differenze specie-specifiche nella formazione di biomassa da biofilm sui diversi dispositivi.

Va notato che l’eradicazione della candeggina dei biofilm di E. coli e P. aeruginosa su dispositivi a pozzo profondo si è verificata a concentrazioni 2-4 volte inferiori rispetto al dispositivo standard (Figura 4A-B, Tabella 1). Le differenze nei valori MBEC di candeggina identificati da ciascun dispositivo sono probabilmente influenzate dalle differenze nelle forme dei pioli del dispositivo (i “pioli” dei pozzetti profondi sono tubi conici e i pioli standard sono cilindrici), dalle differenze di composizione della plastica (polipropilene contro polistirene) e dalle differenze di volume (750 μL contro 200 μL). Ad esempio, P. aeruginosa aveva una maggiore biomassa CV M / mm2 sui pioli del dispositivo del pozzo profondo rispetto ai dispositivi standard, ma E. coli aveva meno biomassa sui pioli dei pozzi profondi (Figura 3). Ciò suggerisce che le concentrazioni di disinfettante necessarie per l’eradicazione del biofilm possono essere influenzate dalla biomassa formata da ciascuna specie e dalla superficie disponibile. Inoltre, le differenze nella forma del peg del dispositivo possono influenzare varie condizioni di crescita per particolari specie. Nel nostro studio, P. aeruginosa può formare una maggiore biomassa su pioli profondi a causa della loro maggiore superficie e aerazione, poiché questa specie è un aerobe obbligato in contrasto con E. coli, che è un anaerobe facoltativo. Ad oggi, non abbiamo identificato studi pubblicati che abbiano confrontato direttamente la formazione di biofilm di E. coli e P. aeruginosa insieme su entrambi i materiali in polipropilene27,28,29 e polistirene30,31. Tuttavia, segnalazioni di robusta formazione di biofilm di E. coli e P. aeruginosa sono state osservate in studi indipendenti che esaminano materiali in polipropilene o polistirene. Per quanto riguarda le Pseudomonadi, molti Pseudomonas spp. possono utilizzare materie plastiche come il polipropilene come potenziali fonti di carbonio32. Quindi, la disponibilità di questo dispositivo di biofilm profondo in polipropilene è un utile progresso negli studi di biofilm statico. Il polipropilene è chimicamente più resistente del polistirene ed è un materiale clinicamente rilevante, in quanto viene spesso utilizzato in impianti medici, suture e reti per interventi chirurgici di ernia o pelvica33,34.

Sebbene la biomassa del biofilm sia stata formata da entrambi i dispositivi, il dispositivo del pozzo profondo aveva una variabilità leggermente superiore nella biomassa in base al metodo di colorazione CV e ai valori MBEC di eradicazione del biofilm OD600nm per candeggina e BZK. Ciò può essere spiegato da 3 fattori principali: 1) I dispositivi a pozzo profondo hanno una maggiore superficie del piolo rispetto ai dispositivi standard che erano angolati rispetto ai pioli del dispositivo standard. 2) Entrambe le specie testate possono avere diverse capacità di aderire ai materiali in polipropilene e polistirene di ciascun dispositivo. 3) I volumi di terreno di crescita utilizzati in ciascun dispositivo (pozzo profondo 750 μL, standard 200 μL) e la spaziatura tra il piolo inserito e le pareti laterali del pozzo differiscono. Questi problemi non sono un problema se viene utilizzato un solo tipo di dispositivo per tutti gli esperimenti di biofilm, tuttavia, se entrambi i dispositivi sono selezionati, i confronti che abbiamo condotto nel presente documento dovrebbero essere eseguiti per identificare le differenze36,37. A causa delle differenze nel materiale plastico utilizzato in ciascun dispositivo, la biomassa del biofilm macchiata CV e i valori MBEC non devono essere confrontati direttamente tra dispositivi diversi. Tuttavia, se i metodi e gli esperimenti sono condotti sullo stesso dispositivo (pozzo profondo o standard), i risultati ottenuti per le specie e gli antimicrobici testati sono comparabili.

Questo protocollo mostra che i dispositivi PCR-plate a pozzo profondo auto-assemblati sono dispositivi a biofilm di volume maggiore per misurare la formazione e l’eradicazione del biofilm che è anche conveniente. Dal punto di vista dei costi, i dispositivi biofilm standard con 96 coperchi ben ancorati vanno al dettaglio a $ 29-36 dollari USA (USD) per dispositivo (Table of Materials). I dispositivi a biofilm standard in polistirene non sono autoclavabili e sono meno tolleranti ai solventi/acidi a causa delle sue proprietà chimiche plastiche. Le piastre per pozzetti profondi in polipropilene auto-assemblate qui descritte, dotate di una piastra PCR (Table of Materials) semi-minigonna separata da 96 pozzetti costano un totale di $ 14 USD per dispositivo assemblato, che è la metà del costo standard del dispositivo biofilm. Va notato che i prezzi possono variare a seconda della regione, del distributore e della disponibilità, e i nostri costi dopo gli sconti istituzionali hanno funzionato a $ 9 USD / dispositivo pozzo profondo. Questi dispositivi autoassemblati con piastra PCR in polipropilene a pozzo profondo hanno l’ulteriore vantaggio di essere autoclavabili per la sterilizzazione e offrono 2-4 volte più biomassa di biofilm rispetto ai dispositivi standard.

In conclusione, questo protocollo e i risultati rappresentativi dei confronti di crescita del biofilm del pozzo profondo e dei dispositivi di biofilm standard mostrano che entrambi i dispositivi sono in grado di coltivare biofilm batterici, ma i dispositivi di pozzo profondo formano 2-4 volte più biofilm. Il dispositivo a biofilm profondo offre un’alternativa praticabile e conveniente per esperimenti di formazione di biofilm ad alto rendimento di volumi più grandi come studi di screening della suscettibilità ai farmaci. Questa tecnica può generare biofilm utili per estrazioni ‘-omiche’ a valle (proteomica, metabolomica, trascrittomica) o saggi sperimentali (enzimatici, fluorescenti) che possono richiedere maggiori quantità di materiali biofilm per le analisi. Il dispositivo a biofilm per pozzi profondi è consigliato per i laboratori che desiderano studiare i biofilm in un test ad alta produttività a 96 pozzi utilizzando materiali plastici chimicamente durevoli a basso costo, volume maggiore e clinicamente rilevanti.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito da sovvenzioni operative a DCB dal Natural Science and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN- 2016-05891) e a MRM e GRG dal programma Government of Canadian Genomics Research and Development Initiative Grant (GRDI) (GRDI7 2254557).

Materials

10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) Fisher Scientific 13-678-11F disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS Fisher Scientific 13-678-11C disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack Fisher Scientific 14-222-766 sterile pipettor tips for media aliquoting
Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C Fisher Scientific P-DW-11-C microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips Fisher Scientific TF-350-L-R-S sterile pipettor tips for media aliquoting
Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 Avantor/ VWR 89094-676 sterile basins/ reservoirs for microplate preparation
BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g Fisher Scientific DF0145-17-0 materials for LB agar preparation
Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader Biotek NEO2MB microplate UV/Vis region plate reader
Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V Avantor/ VWR CPX-952-316R sonicating water bath
crystal violet (CV), ACS grade, 100 g Fisher Scientific C581-100 biofilm biomass stain
Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH Avantor/ VWR CABDH1115-1LP media components for cryopreservation
Easypet 3, pipet controller Avantor/ VWR CA11027-980 serological pipettor for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL Avantor/ VWR CA89125-338 multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL Avantor/ VWR CA89125-340 multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade Fisher Scientific A38-212 CV destain
Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX Fisher Scientific 14957H/ 9820-18 materials for cell culturing
Glycerol, 4 L glass bottle ACS Fisher Scientific BP229-4 media components for cryopreservation
L-Cysteine, 98%, 250 g Avantor/ VWR 97061-204 universal neutralizing solution
L-glutathione reduced, 98%, 25 g Fisher Scientific AAJ6216614 universal neutralizing solution
L-Hisitidine, 98%, 100 g Avantor/ VWR CA97062-598 universal neutralizing solution
MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS Innovotech 19112 material for 96 well MBEC device biofilm cultivation
McFarland Standard, 0.5 EA Fisher Scientific R20410 cell culture standardization
McFarland Standard, 1.0 EA Fisher Scientific R20411 cell culture standardization
NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS Fisher Scientific 167008 microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements
PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK Sarstedt 72.1981.202 pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 Fisher Scientific FB0875712 materials for LB agar preparation
Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g Fisher Scientific P288-500 PBS component/ buffer
Sodium chloride, ACS grade, 3 kg Fisher Scientific S2713 media components for LB broth and PBS
sodium phosphate monobasic, 1 kg Fisher Scientific S369-1 PBS component/ buffer
Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 Avantor/ VWR 28145-505 non-autoclavable solution sterilization
Tin foil, heavy duty, 50 feet Grocery store — materials for deepwell device sterilization
Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA Fisher Scientific B11922 media components for LB broth
Tween-20, 100 mL Fisher Scientific BP337-100 recovery media solution
Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS Avantor/ VWR 37001-520 materials for biofilm dilution preparation
Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g Fisher Scientific BP1422-500 media components for LB broth
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Bacterial BiofilmBiofilm BiomassPCR-plate Deep Well MicroplatePeg Lid Biofilm DeviceCrystal Violet StainingAntimicrobial Susceptibility TestingMinimum Biofilm Eradication Concentration (MBEC)

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Doucet, A. N., Slipski, C. J., Golding, G. R., Mulvey, M. R., Bay, D. C. Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices. J. Vis. Exp. (182), e63069, doi:10.3791/63069 (2022).
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