Cristalización en chip y difracción en serie a gran escala a temperatura ambiente

Debido a los efectos ionizantes de la radiación de rayos X, la cristalografía de proteínas, en gran medida, se ha limitado a condiciones criogénicas en las últimas tres décadas. Por lo tanto, el conocimiento actual de los movimientos de las proteínas durante su función surge en gran medida de las comparaciones entre estructuras estáticas observadas en diferentes estados bajo condiciones criogénicas. Sin embargo, las temperaturas criogénicas inevitablemente dificultan la progresión de una reacción bioquímica o interconversión entre diferentes estados conformacionales mientras las moléculas de proteínas están trabajando. Para observar directamente la dinámica estructural de las proteínas a resolución atómica por cristalografía, se necesitan métodos robustos y rutinarios para realizar experimentos de difracción a temperatura ambiente, lo que requiere innovaciones técnicas en la entrega de muestras, la recopilación de datos y el posterior análisis de datos. Con este fin, los avances recientes en cristalografía en serie han ofrecido nuevas vías para capturar imágenes moleculares de especies estructurales intermedias y de vida corta a temperatura ambiente ^1,2,3. En contraste con la estrategia de “un cristal, un conjunto de datos” ampliamente utilizada en la criocristalografía convencional, la cristalografía en serie adopta una estrategia de recopilación de datos similar a la de la microscopía crioelectrónica de una sola partícula. Específicamente, los datos experimentales en cristalografía en serie se recopilan en pequeñas fracciones de un gran número de muestras individuales, seguidas de un procesamiento intensivo de datos en el que las fracciones de datos se evalúan y combinan en un conjunto de datos completo para la determinación de la estructura 3D⁴. Esta estrategia de “un cristal, un disparo” alivia efectivamente el daño de la radiación de rayos X a los cristales de proteínas a temperatura ambiente a través de una estrategia de difracción antes de la destrucción⁵.

Dado que la cristalografía en serie requiere una gran cantidad de cristales de proteínas para completar un conjunto de datos, plantea grandes desafíos técnicos para muchos sistemas biológicos donde las muestras de proteínas son limitadas y / o se trata de un delicado manejo de cristales. Otra consideración importante es cómo preservar mejor la integridad cristalina en experimentos de difracción en serie. Los métodos de difracción in situ abordan estas preocupaciones al permitir que los cristales de proteínas se difracten directamente desde donde crecen sin romper el sello de la cámara de cristalización 6,7,8,9. Estos métodos sin manipulación son naturalmente compatibles con la difracción en serie a gran escala. Recientemente hemos informado sobre el diseño e implementación de un dispositivo de cristalización para difracción in situ basado en un concepto de cristal sobre cristal: cristales de proteínas cultivados directamente en cuarzo monocristalino¹¹. Este dispositivo “cristal sobre cristal” ofrece varias ventajas. En primer lugar, cuenta con una ventana transparente de rayos X y luz hecha de un sustrato de cuarzo monocristalino, que produce poca dispersión de fondo, lo que resulta en excelentes relaciones señal-ruido en imágenes de difracción de cristales de proteínas. En segundo lugar, el cuarzo monocristalino es una excelente barrera de vapor equivalente al vidrio, proporcionando así un entorno estable para la cristalización de proteínas. Por el contrario, otros dispositivos de cristalización que utilizan sustratos a base de polímeros son propensos a secarse debido a la permeabilidad al vapor a menos que el material polimérico tenga un espesor sustancial, lo que contribuye a una alta dispersión de fondo¹⁰. En tercer lugar, este dispositivo permite la entrega de un gran número de cristales de proteínas al haz de rayos X sin ninguna forma de manipulación o recolección de cristales, lo cual es crítico para preservar la integridad del cristal¹¹.

Para agilizar los experimentos de difracción de rayos X en serie utilizando los dispositivos de cristal sobre cristal, hemos desarrollado un prototipo de difractómetro para facilitar el cambio entre los modos de escaneo óptico y difracción de rayos X¹². Este difractómetro tiene una huella pequeña y se ha utilizado para la recopilación de datos en serie en dos líneas de luz de la Fuente Avanzada de Fotones (APS) en el Laboratorio Nacional de Argonne. Específicamente, utilizamos BioCARS 14-ID-B para la difracción Laue y LS-CAT 21-ID-D para la oscilación monocromática. Este hardware de difractómetro no es necesario si una línea de haz láser de electrones libres de sincrotrón o rayos X está equipada con dos capacidades clave: (1) posicionamiento motorizado de la muestra con un rango de desplazamiento de ±12 mm alrededor del haz de rayos X en todas las direcciones; y (2) una cámara digital en el eje para la visualización de cristales bajo iluminación ligera que es segura para los cristales de proteínas en estudio. El dispositivo de cuarzo monocristalino junto con un difractómetro portátil y el software de control para escaneo óptico, reconocimiento de cristales y recopilación automatizada de datos in situ constituyen colectivamente la plataforma inSituX para cristalografía en serie. Aunque este desarrollo está motivado principalmente por sus aplicaciones de cristalografía dinámica utilizando una fuente de rayos X policromática, hemos demostrado el potencial de esta tecnología para soportar métodos de oscilación monocromática^10,12. Con la automatización, esta plataforma ofrece un método de recopilación de datos en serie de alto rendimiento a temperatura ambiente con un consumo de proteínas asequible.

En esta contribución, describimos en detalle cómo configurar la cristalización en chip en un laboratorio húmedo y cómo realizar la recopilación de datos de rayos X en serie en una línea de luz sincrotrón utilizando la plataforma inSituX.

El método por lotes se utiliza para establecer la cristalización en chip bajo una condición similar a la del método de difusión de vapor obtenido para la misma muestra de proteína (Tabla 1). Como punto de partida, recomendamos usar precipitante a una concentración de 1.2-1.5x para el método de difusión de vapor. Si es necesario, la condición de cristalización por lotes se puede optimizar aún más mediante el cribado de rejilla fina. Las obleas de cuarzo no son necesarias para los ensayos de optimización; En su lugar, se pueden usar cubreobjetos de vidrio (ver más abajo). Se recomiendan dispositivos de cristalización parcialmente cargados para mantener los ensayos de optimización en una escala más pequeña. Varias muestras de proteínas se han cristalizado con éxito en tales dispositivos utilizando el método de lote¹⁰ (Tabla 1).

El dispositivo en sí consta de las siguientes partes: 1) un anillo exterior; 2) dos obleas de cuarzo; 3) una cuña similar a una arandela de plástico o acero inoxidable; 4) un anillo de retención; 5) aceite de inmersión del microscopio como sellador (Figura 1). El volumen total de la solución de cristalización cargada en un chip depende del propósito del experimento. La capacidad de la cámara de cristalización se puede ajustar eligiendo una cuña de diferentes espesores y/o diámetro interior. Configuramos rutinariamente dispositivos de cristalización de 10-20 μL de capacidad utilizando cuñas de 50-100 μm de espesor. Un dispositivo típico puede producir de decenas a miles de cristales de proteína adecuados para la recopilación de datos en serie (Figura 2).

Cuando tenga éxito, la cristalización en chip producirá decenas a cientos o incluso miles de cristales de proteínas en cada dispositivo de cuarzo listos para la difracción de rayos X. En una línea de luz de sincrotrón, dicho dispositivo se monta en una etapa de traslación de tres ejes del difractómetro utilizando un mecanismo cinemático. La ventana de cristalización de un dispositivo montado se escanea ópticamente y se visualiza en decenas o cientos de micrografías. Estas micrografías se unen en un montaje de alta resolución. Para cristales fotosensibles, el escaneo óptico se puede llevar a cabo bajo luz infrarroja (IR) para evitar la fotoactivación involuntaria. Se ha desarrollado un software de visión artificial para identificar y localizar cristales de proteínas distribuidos aleatoriamente en el dispositivo. Estos cristales se clasifican de acuerdo con su tamaño, forma y posición para informar o guiar la estrategia de recopilación de datos en cristalografía en serie. Por ejemplo, se pueden ubicar disparos únicos o múltiples en cada cristal objetivo. Los usuarios pueden planificar una sola pasada o múltiples rutas a través de cristales específicos. Hemos implementado software para calcular varias rutas de viaje. Por ejemplo, la ruta más corta se calcula utilizando algoritmos que abordan el problema del vendedor ambulante¹³. Para aplicaciones cristalográficas dinámicas bomba-sonda, se puede elegir el tiempo y la duración de las tomas de láser (bomba) y rayos X (sonda). Se programa una recopilación automatizada de datos en serie para translocar cada cristal objetivo en el haz de rayos X uno tras otro.

Los componentes clave del difractómetro insituX incluyen: 1) un soporte para dispositivo; 2) una etapa de traducción de tres ejes; 3) una fuente de luz para el escaneo óptico; 4) una parada del haz de rayos X; 5) bombear láseres si se estudian proteínas sensibles a la luz; 6) Microcomputadora Raspberry Pi equipada con una cámara sensible a IR; 7) Software de control para sincronizar motores, cámara, fuentes de luz, láser de bomba e interactuar con los controles de línea de luz.