Кристаллизация на кристалле и крупномасштабная последовательная дифракция при комнатной температуре

Из-за ионизирующего воздействия рентгеновского излучения кристаллография белка в значительной степени была ограничена криогенными условиями в последние три десятилетия. Таким образом, современные знания о движениях белка во время его функционирования в значительной степени возникают из сравнений статических структур, наблюдаемых в различных состояниях в криогенных условиях. Однако криогенные температуры неизбежно препятствуют прогрессированию биохимической реакции или взаимоконверсии между различными конформационными состояниями во время работы белковых молекул. Для непосредственного наблюдения структурной динамики белка при атомном разрешении с помощью кристаллографии необходимы надежные и рутинные методы проведения дифракционных экспериментов при комнатной температуре, что требует технических инноваций в доставке образцов, сборе данных и анализе задних данных. С этой целью последние достижения в области серийной кристаллографии предложили новые возможности для захвата молекулярных изображений промежуточных продуктов и короткоживущих структурных видов при комнатной температуре ^1,2,3. В отличие от стратегии «один кристалл — один набор данных», широко используемой в обычной криокристаллографии, серийная кристаллография использует стратегию сбора данных, аналогичную стратегии криоэлектронной микроскопии с одной частицей. В частности, экспериментальные данные в серийной кристаллографии собираются в небольших фракциях из большого количества отдельных образцов с последующей интенсивной обработкой данных, в которой фракции данных оцениваются и объединяются в полный набор данных для определения 3D-структуры⁴. Эта стратегия «один кристалл — один выстрел» эффективно облегчает рентгеновское радиационное повреждение кристаллов белка при комнатной температуре посредством дифракции перед стратегией разрушения⁵.

Поскольку серийная кристаллография требует большого количества кристаллов белка для завершения набора данных, она создает серьезные технические проблемы для многих биологических систем, где образцы белка ограничены и / или связана деликатная обработка кристаллов. Другим важным соображением является то, как наилучшим образом сохранить целостность кристаллов в экспериментах по серийной дифракции. Методы дифракции in situ решают эти проблемы, позволяя кристаллам белка дифрагировать непосредственно из того места, где они растут, не нарушая уплотнения камеры кристаллизации ^6,7,8,9. Эти методы без обработки естественным образом совместимы с крупномасштабной последовательной дифракцией. Недавно мы сообщили о разработке и реализации кристаллизационного устройства для дифракции in situ на основе концепции кристалл-на-кристалле – белковых кристаллов, выращенных непосредственно на монокристаллическом кварце¹¹. Это устройство «кристалл на кристалле» предлагает несколько преимуществ. Во-первых, он имеет рентгеновское и светлое прозрачное окно, сделанное из монокристаллической кварцевой подложки, которая производит небольшое фоновое рассеяние, что приводит к отличным соотношениям сигнал/шум на дифракционных изображениях из кристаллов белка. Во-вторых, монокристаллический кварц является отличной пароизоляцией, эквивалентной стеклу, тем самым обеспечивая стабильную среду для кристаллизации белка. Напротив, другие кристаллизационные устройства, использующие подложки на полимерной основе, склонны к высыханию из-за паропроницаемости, если полимерный материал не имеет существенной толщины, что, следовательно, способствует высокому фоновому рассеянию¹⁰. В-третьих, это устройство позволяет доставлять большое количество кристаллов белка в рентгеновский луч без какой-либо формы манипуляции с кристаллами или сбора, что имеет решающее значение для сохранения целостности кристаллов¹¹.

Для оптимизации последовательных экспериментов по дифракции рентгеновских лучей с использованием кристаллических устройств мы разработали прототип дифрактометра, облегчающий легкое переключение между режимами¹² оптического сканирования и дифракции рентгеновских лучей. Этот дифрактометр имеет небольшую площадь и используется для последовательного сбора данных на двух линиях луча усовершенствованного источника фотонов (APS) в Аргоннской национальной лаборатории. В частности, мы использовали BioCARS 14-ID-B для дифракции Лауэ и LS-CAT 21-ID-D для монохроматических колебаний. Это дифрактометрическое оборудование не требуется, если синхротронная или рентгеновская лазерная линия свободных электронов оснащена двумя ключевыми возможностями: (1) моторизованное позиционирование образца с диапазоном перемещения ±12 мм вокруг рентгеновского пучка во всех направлениях; и (2) осевая цифровая камера для просмотра кристаллов при световом освещении, безопасная для исследуемых кристаллов белка. Монокристаллическое кварцевое устройство вместе с портативным дифрактометром и управляющим программным обеспечением для оптического сканирования, распознавания кристаллов и автоматизированного сбора данных in situ в совокупности составляют платформу inSituX для серийной кристаллографии. Хотя эта разработка в первую очередь мотивирована ее динамическими кристаллографическими приложениями с использованием полихроматического источника рентгеновского излучения, мы продемонстрировали потенциал этой технологии для поддержки методов монохроматических колебаний^10,12. Благодаря автоматизации эта платформа предлагает высокопроизводительный метод последовательного сбора данных при комнатной температуре с доступным потреблением белка.

В этом материале мы подробно описываем, как настроить кристаллизацию на кристалле в влажной лаборатории и как выполнять последовательный сбор рентгеновских данных на линии синхротронного пучка с помощью платформы inSituX.

Пакетный метод используется для установки кристаллизации на чипе в условиях, аналогичных условиям метода диффузии паров, полученного для того же образца белка (таблица 1). В качестве отправной точки мы рекомендуем использовать осадок в концентрации 1,2-1,5x от таковой для метода диффузии паров. При необходимости состояние кристаллизации партии может быть дополнительно оптимизировано с помощью тонкого сетчатого просеивания. Кварцевые пластины не нужны для оптимизационных испытаний; вместо этого можно использовать стеклянные крышки (см. ниже). Частично загруженные кристаллизационные устройства рекомендуются для проведения оптимизационных испытаний в меньших масштабах. Ряд белковых образцов был успешно кристаллизован на таких устройствах с использованием периодического метода¹⁰ (таблица 1).

Само устройство состоит из следующих частей: 1) наружного кольца; 2) две кварцевые пластины; 3) одна шайбообразная прокладка из пластика или нержавеющей стали; 4) стопорное кольцо; 5) микроскоп погружное масло в качестве герметика (рисунок 1). Общий объем кристаллизационного раствора, загруженного на один чип, зависит от цели эксперимента. Емкость камеры кристаллизации можно регулировать, выбирая прокладку различной толщины и/или внутреннего диаметра. Мы регулярно устанавливаем кристаллизационные устройства емкостью 10-20 мкл с использованием прокладок толщиной 50-100 мкм. Типичное устройство может производить от десятков до тысяч кристаллов белка, достаточных для последовательного сбора данных (рисунок 2).

В случае успеха кристаллизация на чипе будет производить десятки, сотни или даже тысячи кристаллов белка на каждом кварцевом устройстве, готовых к рентгеновской дифракции. На синхротронной лучевой линии такое устройство монтируется на трехосевой ступени трансляции дифрактометра с помощью кинематического механизма. Окно кристаллизации навесного устройства оптически сканируется и визуализируется на десятках-сотнях микроснимков. Эти микроснимки затем сшиваются в монтаж с высоким разрешением. Для светочувствительных кристаллов оптическое сканирование может быть выполнено под инфракрасным (ИК) светом, чтобы избежать непреднамеренной фотоактивации. Было разработано программное обеспечение для компьютерного зрения для идентификации и определения местоположения кристаллов белка, случайным образом распределенных на устройстве. Затем эти кристаллы ранжируются в соответствии с их размером, формой и положением, чтобы информировать или направлять стратегию сбора данных в серийной кристаллографии. Например, один или несколько выстрелов могут быть расположены на каждом целевом кристалле. Пользователи могли планировать один проход или несколько маршрутов через целевые кристаллы. Мы внедрили программное обеспечение для вычисления различных маршрутов путешествий. Например, кратчайший маршрут вычисляется с использованием алгоритмов, которые решают задачу¹³ коммивояжера. Для динамических кристаллографических применений насос-зонд можно выбрать время и продолжительность лазерных (накачки) и рентгеновских (зондовых) снимков. Автоматизированный последовательный сбор данных запрограммирован на перемещение каждого целевого кристалла в рентгеновский пучок один за другим.

К ключевым компонентам дифрактометра insituX относятся: 1) держатель прибора; 2) трехосевой этап трансляции; 3) источник света для оптического сканирования; 4) остановка рентгеновского пучка; 5) накачивать лазеры, если изучаются светочувствительные белки; 6) Микрокомпьютер Raspberry Pi, оснащенный ИК-чувствительной камерой; 7) программное обеспечение управления для синхронизации двигателей, камеры, источников света, накачки лазера и взаимодействия с элементами управления линией луча.