온칩 결정화 및 실온에서의 대규모 연속 회절

X 선 방사선의 이온화 효과로 인해 단백질 결정학은 지난 30 년 동안 극저온 조건으로 제한되었습니다. 따라서 기능 중 단백질 운동에 대한 현재의 지식은 주로 극저온 조건에서 다른 상태에서 관찰되는 정적 구조 간의 비교에서 비롯됩니다. 그러나 극저온 온도는 단백질 분자가 작동하는 동안 필연적으로 생화학 반응의 진행이나 서로 다른 구조적 상태 간의 상호 전환을 방해합니다. 결정학을 통해 원자 분해능에서 단백질 구조 역학을 직접 관찰하려면 실온에서 회절 실험을 수행하기 위한 강력하고 일상적인 방법이 필요하며, 이를 위해서는 샘플 전달, 데이터 수집 및 사후 데이터 분석의 기술 혁신이 필요합니다. 이를 위해 최근 연속 결정학의 발전은 실온 ^1,2,3에서 중간체 및 수명이 짧은 구조 종의 분자 이미지를 캡처하는 새로운 길을 제공했습니다. 기존의 저온 결정학에서 널리 사용되는 “1 결정 1 데이터 세트”전략과 달리 직렬 결정학은 단일 입자 초저온 전자 현미경과 유사한 데이터 수집 전략을 채택합니다. 특히, 연속 결정학의 실험 데이터는 많은 수의 개별 샘플에서 작은 분획으로 수집 된 다음 데이터 분획을 평가하고 3D 구조 결정을위한 완전한 데이터 세트로 결합하는 집중적 인 데이터 처리가 이루어집니다⁴. 이 “단결정 원샷” 전략은 파괴 전 회절 전략⁵를 통해 실온에서 단백질 결정에 대한 X선 방사선 손상을 효과적으로 완화합니다.

연속 결정학은 데이터 세트를 완성하기 위해 많은 수의 단백질 결정이 필요하기 때문에 단백질 샘플이 제한적이거나 섬세한 결정 처리가 관련된 많은 생물학적 시스템에 주요 기술적 과제를 제기합니다. 또 다른 중요한 고려 사항은 연속 회절 실험에서 결정 무결성을 가장 잘 보존하는 방법입니다. 현장 회절 방법은 결정화 챔버 6,7,8,9의 밀봉을 깨뜨리지 않고 단백질 결정이 성장하는 곳에서 직접 회절되도록 함으로써 이러한 문제를 해결합니다. 이러한 취급이 필요 없는 방법은 대규모 직렬 회절과 자연스럽게 호환됩니다. 우리는 최근에 단결정 석영¹¹에서 직접 성장한 단백질 결정인 결정 대 결정 개념에 기반한 현장 회절을 위한 결정화 장치의 설계 및 구현을 보고했습니다. 이 “크리스탈 온 크리스탈” 장치는 몇 가지 장점을 제공합니다. 첫째, 단결정 석영 기판으로 만들어진 X선 및 가벼운 투명 창이 있어 배경 산란이 거의 발생하지 않아 단백질 결정의 회절 이미지에서 신호 대 잡음비가 우수합니다. 둘째, 단결정 석영은 유리와 동등한 우수한 수증기 장벽이므로 단백질 결정화를위한 안정적인 환경을 제공합니다. 대조적으로, 중합체-기재를 사용하는 다른 결정화 장치는 중합체 물질이 상당한 두께를 갖지 않는 한 증기 투과성으로 인해 건조되기 쉽고, 이는 결과적으로 높은 배경 산란(¹⁰)에 기여한다. 셋째, 이 장치는 결정 무결성을 보존하는 데 중요한 결정 조작 또는 수확의 어떠한 형태도 없이 많은 수의 단백질 결정을 X선 빔에 전달할 수 있습니다(¹¹).

크리스탈 온 크리스탈 장치를 사용하여 연속 X선 회절 실험을 간소화하기 위해, 당사는 광학 스캐닝과 X선 회절 모드(¹²) 사이를 쉽게 전환할 수 있도록 회절계 프로토타입을 개발하였다. 이 회절계는 설치 공간이 작으며 아르곤 국립 연구소의 고급 광자 소스 (APS)의 두 빔 라인에서 직렬 데이터 수집에 사용되었습니다. 특히, 라우에 회절에는 BioCARS 14-ID-B를, 단색 진동에는 LS-CAT 21-ID-D를 사용했습니다. 싱크로트론 또는 X선 자유 전자 레이저 빔라인에 두 가지 주요 기능이 장착된 경우 이 회절계 하드웨어가 필요하지 않습니다: (1) 모든 방향으로 X선 빔 주위의 이동 범위가 ±12mm인 전동 샘플 포지셔닝; (2) 연구중인 단백질 결정에 안전한 빛 조명 아래에서 결정을보기위한 축상 디지털 카메라. 단결정 석영 장치는 휴대용 회절분석기 및 광학 스캐닝, 크리스탈 인식 및 자동화된 현장 데이터 수집을 위한 제어 소프트웨어와 함께 직렬 결정학을 위한 inSituX 플랫폼을 구성합니다. 이러한 개발은 주로 다색 X선 소스를 사용하는 동적 결정학 응용 분야에 의해 동기가 부여되지만, 우리는 단색 진동 방법^10,12를 지원하는 이 기술의 잠재력을 입증했습니다. 자동화를 통해 이 플랫폼은 저렴한 단백질 소비로 실온에서 높은 처리량의 직렬 데이터 수집 방법을 제공합니다.

이 기고에서는 습식 실험실에서 온칩 결정화를 설정하는 방법과 inSituX 플랫폼을 사용하여 싱크로트론 빔라인에서 직렬 X선 데이터 수집을 수행하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.

배치 방법은 동일한 단백질 샘플에 대해 얻은 증기 확산 방법과 유사한 조건에서 온칩 결정화를 설정하는 데 사용됩니다(표 1). 출발점으로 증기 확산 방법의 경우 1.2-1.5x 농도의 침전제를 사용하는 것이 좋습니다. 필요한 경우 미세 그리드 스크리닝을 통해 배치 결정화 조건을 추가로 최적화할 수 있습니다. 석영 웨이퍼는 최적화 시험에 필요하지 않습니다. 유리 커버 슬립을 대신 사용할 수 있습니다 (아래 참조). 부분적으로 로드된 결정화 장치는 최적화 시험을 더 작은 규모로 유지하기 위해 권장됩니다. 다수의 단백질 샘플이 배치 방법¹⁰ 을 사용하여 이러한 장치 상에서 성공적으로 결정화되었다(표 1).

장치 자체는 다음 부분으로 구성됩니다 : 1) 외부 링; 2) 2 개의 석영 웨이퍼; 3) 플라스틱 또는 스테인레스 스틸의 와셔와 같은 심 하나; 4) 고정 링; 5) 실란트로 현미경 침지 오일 (그림 1). 하나의 칩에로드 된 결정화 용액의 총 부피는 실험의 목적에 따라 다릅니다. 결정화 챔버의 용량은 다양한 두께 및/또는 내경의 심을 선택하여 조정할 수 있습니다. 우리는 두께가 50-100 μm인 심을 사용하여 10-20 μL 용량의 결정화 장치를 일상적으로 설정합니다. 일반적인 장치는 연속 데이터 수집에 적합한 수만에서 수천 개의 단백질 결정을 생성할 수 있습니다(그림 2).

성공하면 온칩 결정화는 X선 회절에 대비한 각 석영 장치에서 수십에서 수백 또는 수천 개의 단백질 결정을 생성합니다. 싱크로트론 빔 라인에서, 이러한 장치는 운동 학적 메커니즘을 사용하여 회절 계의 3 축 변환 스테이지에 장착된다. 장착 된 장치의 결정화 창은 광학적으로 스캔되고 수십에서 수백 개의 현미경 사진으로 이미지화됩니다. 그런 다음 이 현미경 사진을 고해상도 몽타주로 스티칭합니다. 감광성 결정의 경우, 의도하지 않은 광 활성화를 피하기 위해 적외선 (IR) 광 하에서 광학 스캐닝을 수행 할 수 있습니다. 컴퓨터 비전 소프트웨어는 장치에 무작위로 분포 된 단백질 결정을 식별하고 찾기 위해 개발되었습니다. 그런 다음 이러한 결정은 크기, 모양 및 위치에 따라 순위가 매겨져 직렬 결정학에서 데이터 수집 전략을 알리거나 안내합니다. 예를 들어, 단일 또는 다중 샷이 각 타겟 크리스탈에 위치 할 수 있습니다. 사용자는 대상 크리스탈을 통해 단일 패스 또는 여러 경로를 계획할 수 있습니다. 우리는 다양한 여행 경로를 계산하는 소프트웨어를 구현했습니다. 예를 들어, 최단 경로는 외판원 문제⁽¹³)를 해결하는 알고리즘을 사용하여 계산된다. 펌프-프로브 동적 결정학 어플리케이션의 경우 레이저(펌프) 및 X선(프로브) 샷의 타이밍과 지속 시간을 선택할 수 있습니다. 자동 직렬 데이터 수집은 각 표적 크리스탈을 X선 빔으로 차례로 전위하도록 프로그래밍됩니다.

insituX 회절분석기의 주요 구성 요소는 다음과 같습니다: 1) 장치 홀더; 2) 3축 변환 단계; 3) 광학 스캐닝을 위한 광원; 4) X 선 빔 정지; 5) 빛에 민감한 단백질을 연구하는 경우 레이저 펌프; 6) IR 민감한 카메라가 장착 된 라즈베리 파이 마이크로 컴퓨터; 7) 모터, 카메라, 광원, 펌프 레이저를 동기화하고 빔라인 제어와 인터페이스하는 제어 소프트웨어.