室温でのオンチップ結晶化と大規模シリアル回折

X線放射の電離効果により、タンパク質結晶構造解析は、過去30年間の極低温条件に大部分が限定されてきました。したがって、その機能中のタンパク質運動に関する現在の知識は、主に極低温条件下で異なる状態で観察された静的構造間の比較から生じます。しかし、極低温は、タンパク質分子が働いている間、生化学反応または異なる立体構造状態間の相互変換の進行を必然的に妨げます。結晶構造解析によりタンパク質の構造ダイナミクスを原子分解能で直接観察するためには、室温での回折実験を行うための堅牢でルーチン的な方法が必要であり、サンプルデリバリー、データ収集、事後データ解析の技術革新が必要です。この目的のために、最近の連続結晶学の進歩は、室温で中間体および短寿命構造種の分子画像をキャプチャするための新しい手段を提供しました^1,2,3。従来のクライオ結晶学で広く使用されている「1結晶1データセット」戦略とは対照的に、シリアル結晶構造解析は、単粒子クライオ電子顕微鏡と同様のデータ収集戦略を採用しています。具体的には、シリアル結晶学の実験データを多数の個々のサンプルから小さなフラクションに収集し、その後、データフラクションを評価して3D構造決定のための完全なデータセットに結合する集中的なデータ処理を行います⁴。この「ワンクリスタルワンショット」戦略は、破壊前の回折戦略⁵を介して、室温でのタンパク質結晶へのX線放射損傷を効果的に緩和します。

連続結晶構造解析は、データセットを完成させるために多数のタンパク質結晶を必要とするため、タンパク質サンプルが限られている、および/または繊細な結晶の取り扱いが伴う多くの生物学的システムにとって大きな技術的課題となります。もう一つの重要な考慮事項は、連続回折実験において結晶の完全性を最もよく維持する方法です。in situ回折法は、タンパク質結晶が結晶化^{チャンバー6,7,8,9}のシールを壊すことなく、タンパク質結晶が成長する場所から直接回折できるようにすることで、これらの懸念に対処します。これらの取り扱い不要の方法は、大規模な連続回折と自然に互換性があります。我々は最近、単結晶水晶¹¹上で直接成長させたタンパク質結晶という結晶オンクリスタルの概念に基づくin situ回折のための結晶化装置の設計と実装を報告した。この「クリスタルオンクリスタル」デバイスには、いくつかの利点があります。第一に、単結晶石英基板で作られたX線および光透過性の窓を特徴としており、バックグラウンド散乱がほとんどないため、タンパク質結晶からの回折画像において優れたS/N比が得られます。第二に、単結晶石英はガラスと同等の優れた蒸気バリアであり、それによってタンパク質結晶化のための安定した環境を提供する。対照的に、ポリマーベースの基板を使用する他の結晶化デバイスは、ポリマー材料が実質的な厚さを有しない限り、蒸気透過性のために乾燥する傾向があり、その結果、高いバックグラウンド散乱に寄与する¹⁰。第三に、この装置は、結晶の完全性を維持するために重要な、いかなる形態の結晶操作または収穫もなしに、多数のタンパク質結晶をX線ビームに送達することを可能にする¹¹。

結晶オンクリスタルデバイスを使用した連続X線回折実験を合理化するために、光学スキャンモードとX線回折モードの切り替えを容易にする回折計のプロトタイプを開発しました¹²。この回折計は設置面積が小さく、アルゴンヌ国立研究所の先端光子源(APS)の2つのビームラインでのシリアルデータ収集に使用されています。具体的には、ラウエ回折にはBioCARS 14-ID-Bを、単色振動にはLS-CAT 21-ID-Dを用いました。この回折計ハードウェアは、シンクロトロンまたはX線自由電子レーザービームラインに2つの重要な機能を備えている場合は必要ありません:(1)X線ビームの周りの移動範囲が±12mmのすべての方向への電動サンプル位置決め。(2)研究中のタンパク質結晶に対して安全な光照明下での結晶観察用の軸上デジタルカメラ。単結晶石英デバイスは、ポータブル回折計、光学スキャン、結晶認識、および自動in situデータ収集用の制御ソフトウェアとともに、シリアル結晶学用のinSituXプラットフォームを構成します。この開発は主に多色X線源を用いた動的結晶学アプリケーションによって動機付けられていますが、単色振動法をサポートするこの技術の可能性を実証しました^10,12。自動化により、このプラットフォームは、手頃な価格のタンパク質消費で室温での高スループットのシリアルデータ収集方法を提供します。

本稿では、ウェットラボでのオンチップ結晶化のセットアップ方法や、inSituXプラットフォームを用いたシンクロトロンビームラインでの連続X線データ収集方法について詳しく説明します。

バッチ法は、同じタンパク質サンプルに対して得られた蒸気拡散法と同様の条件下でオンチップ結晶化をセットアップするために使用されます(表1)。出発点として、蒸気拡散法の1.2〜1.5倍の濃度の沈殿剤を使用することをお勧めします。必要に応じて、バッチ結晶化条件は、ファイングリッドスクリーニングによってさらに最適化することができます。石英ウェーハは最適化試験には必要ありません。代わりにガラスカバースリップを使用できます(以下を参照)。最適化試行を小規模に保つために、部分的に負荷された結晶化装置をお勧めします。多数のタンパク質試料が、バッチ法¹⁰ を用いてそのような装置上で首尾よく結晶化された(表1)。

デバイス自体は次の部分で構成されています:1)外輪。2)2枚の石英ウェーハ。3)プラスチックまたはステンレス鋼の1つのワッシャーのようなシム。4)保持リング;5)シーラントとして顕微鏡浸漬油(図1)。1つのチップに装填された結晶化溶液の総量は、実験の目的によって異なります。結晶化チャンバーの容量は、異なる厚さおよび/または内径のシムを選択することによって調整することができる。厚さ50〜100μmのシムを用いて、容量10〜20μLの結晶化装置を日常的に設置しています。一般的なデバイスは、シリアルデータ収集に適した数万から数千のタンパク質結晶を生成できます(図2)。

オンチップ結晶化が成功すると、X線回折の準備が整った各石英デバイス上に数十から数百または数千のタンパク質結晶が生成されます。シンクロトロンビームラインでは、このような装置を運動機構を用いて回折計の3軸並進ステージに実装します。マウントされたデバイスの結晶化ウィンドウは、光学的にスキャンされ、数十から数百の顕微鏡写真で画像化されます。次に、これらの顕微鏡写真を高解像度のモンタージュにステッチします。感光性結晶の場合、意図しない光活性化を避けるために、赤外線(IR)光下で光学走査を行うことができます。デバイス上にランダムに分布するタンパク質結晶を識別して特定するためのコンピュータービジョンソフトウェアが開発されました。次に、これらの結晶は、そのサイズ、形状、および位置に従ってランク付けされ、シリアル結晶学におけるデータ収集戦略に情報を提供またはガイドします。たとえば、単一または複数のショットを各ターゲットクリスタルに配置することができます。ユーザーは、ターゲットのクリスタルを通過する単一のパスまたは複数のルートを計画できます。様々な走行ルートを計算するためのソフトウェアを実装しています。たとえば、最短ルートは、巡回セールスマン問題¹³ に対処するアルゴリズムを使用して計算されます。ポンププローブ動的結晶学アプリケーションでは、レーザー(ポンプ)およびX線(プローブ)ショットのタイミングと持続時間を選択できます。自動シリアルデータ収集は、ターゲットの各結晶を次々にX線ビームに移すようにプログラムされています。

insituX回折計の主要コンポーネントには、1)デバイスホルダーが含まれます。2)3軸平行移動ステージ。3)光学スキャン用の光源。4)X線ビームストップ。5)光感受性タンパク質が研究されている場合はレーザーを励起します。6)IR感度カメラを搭載したラズベリーパイマイコン。7)モーター、カメラ、光源、ポンプレーザーを同期させ、ビームライン制御とインターフェースするための制御ソフトウェア。