電子結晶学研究のための脂質単層法を用いたサンプル調製

2D結晶またはタンパク質のヘリカルアレイを介した電子回折は、好ましい症例^1、2、3においてサブナノメートル分解能^を達成することができる。特に興味深いのは、2D膜タンパク質アレイまたは結晶をほぼネイティブ環境で再構成する¹.結晶は特定の空間周波数での構造因子の強度を高める信号増幅器として機能するため、電子結晶学は、単粒子クライオEMよりも小分子などの高解像度で小さいサイズのターゲットを探査することを可能にします。電子ビームは、順序付けられた2Dアレイのタンパク質によって回折することができ、画像面が検出器⁴に記録される場所に応じて回折パターンまたは格子画像を生成する。回折強度を抽出し、結晶の2D投影構造を再構築するために処理することができます。電子はX線よりも大きな散乱断面を有し、その散乱は主に分子⁵内の電子と荷電原子とのクーロン相互作用に基づくラザフォードモデルに従う。2D膜結晶の厚さは、通常100nm未満であり、試料6内で動的散乱が起きることなく電子透過に適^している。電子結晶学的研究は、膜タンパク質および脂質タンパク質相互作用の高分解能構造情報^{を7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17}に対して強力なツールとして得ることを示している。

脂質単層は、空気水界面⁶で密に詰められたリン脂質からなる1つの脂質層であり、可溶性タンパク質または末梢膜タンパク質¹⁸に対する2Dアレイ形成を補助することができる。脂質の密度とそれらの横圧に応じて、脂質分子は、水溶液^1、6、19に露出したアシル鎖および親水性ヘッドグループに拡張された空気と水界面に秩序ある2Dアレイを形成することができる。脂質ヘッドグループは、静電相互作用を介してタンパク質と相互作用することができ、または特定のタンパク質ドメインに結合する親和性タグを提供するように改変することができる。例えば、DOGS-NTA-Ni(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[N-(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノジ酢酸)2-Ni^2+]は、ポリヒスチジンタグ20、21、22でタンパク質を結合する脂質単層を形成する際によく使用される。また、コレラ毒素Bは、構造研究^23,24のための脂質単層にガングリオシドGM1の特定の五糖類^を結合することができる。脂質のヘッドグループにタンパク質を固定することにより、脂質単層は、高解像度の電子結晶学的研究のために薄い2Dアレイの形成を支援することができます。脂質単層法は、ストレプトアビジン^2、25、アネキシン^V26、コレラ毒素^27、大腸菌ジラーゼBサブユニット^28、大腸菌RNAポリメラーゼ25、29、30、カルボキシ性シェルタンパク質³¹およびHIV-12血糖血症^{のタンパク質の構造研究のために電子結晶学に使用されてきた33.}脂質単層の安定性と化学的性質のために、サンプル調製のための異なる用途がクライオEMイメージング³⁴のために検討されている。しかし、タンパク質アレイ形成には最適化が必要です。

ここでは、クライオEMイメージングのための脂質単層の一般的な調製の詳細と、形成された単層の品質に影響を与える可能性のあるいくつかの考慮事項を提供します。