Détection d’indel suite à la mutagénèse CRISPR/Cas9 à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution chez le moustique Aedes aegypti
Summary
Cet article détaille un protocole d’identification rapide des indels induits par CRISPR/Cas9 et la sélection de lignées mutantes chez le moustique Aedes aegypti à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution.
Abstract
L’édition de gènes de moustiques est devenue une routine dans plusieurs laboratoires avec la mise en place de systèmes tels que les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN), les nucléases à doigts de zinc (ZFN) et les endonucléases de homing (HE). Plus récemment, la technologie CRISPR (CRISPR) / protéine 9 associée à CRISPR (CAS9) a offert une alternative plus facile et moins chère pour l’ingénierie du génome de précision. Après l’action de la nucléase, les voies de réparation de l’ADN répareront les extrémités brisées de l’ADN, introduisant souvent des indels. Ces mutations hors cadre sont ensuite utilisées pour comprendre la fonction des gènes dans les organismes cibles. Un inconvénient, cependant, est que les individus mutants ne portent aucun marqueur dominant, ce qui rend l’identification et le suivi des allèles mutants difficiles, en particulier aux échelles nécessaires pour de nombreuses expériences.
L’analyse de fusion à haute résolution (HRMA) est une méthode simple pour identifier les variations dans les séquences d’acides nucléiques et utilise des courbes de fusion PCR pour détecter de telles variations. Cette méthode d’analyse post-PCR utilise des colorants fluorescents à double brin liant l’ADN avec une instrumentation dotée d’une capacité de capture de données de contrôle de la température et facilement mise à l’échelle à des formats de plaques à 96 puits. Décrit ici est un flux de travail simple utilisant HRMA pour la détection rapide des indels induits par CRISPR / Cas9 et l’établissement de lignées mutantes chez le moustique Ae. aegypti. De manière critique, toutes les étapes peuvent être effectuées avec une petite quantité de tissu de jambe et ne nécessitent pas de sacrifier l’organisme, ce qui permet d’effectuer des croisements génétiques ou des tests de phénotypage après le génotypage.
Introduction
En tant que vecteurs d’agents pathogènes tels que les virus de la dengue1, zika2 et chikungunya3, ainsi que des parasites du paludisme4, les moustiques représentent une menace importante pour la santé publique humaine. Pour toutes ces maladies, l’intervention de transmission est fortement axée sur la lutte contre les moustiques vecteurs. L’étude des gènes importants, par exemple, dans la permissivité des agents pathogènes, la condition physique des moustiques, la survie, la reproduction et la résistance aux insecticides est essentielle pour développer de nouvelles stratégies de lutte contre les moustiques. À ces fins, l’édition du génome chez les moustiques devient une pratique courante, en particulier avec le développement de technologies telles que les HE, les ZFN, les TALEN et, plus récemment, CRISPR avec Cas9. L’établissement de souches génétiquement modifiées implique généralement le croisement d’individus porteurs des mutations souhaitées pendant quelques générations afin de minimiser les effets hors cible et fondateurs (goulot d’étranglement), suivis du croisement d’individus hétérozygotes pour générer des lignées homozygotes ou trans-hétérozygotes. En l’absence d’un marqueur dominant, le génotypage moléculaire est nécessaire dans ce processus car, dans de nombreux cas, aucun trait phénotypique clair ne peut être détecté pour les mutants hétérozygotes.
Bien que le séquençage soit l’étalon-or pour la caractérisation génotypique, le faire sur des centaines, voire des milliers d’individus, entraîne des coûts, de la main-d’œuvre et du temps importants pour obtenir des résultats, ce qui est particulièrement critique pour les organismes à courte durée de vie tels que les moustiques. Les solutions de rechange couramment utilisées sont le test de nucléase Surveyor5 (SNA), le test T7E16 et l’analyse de fusion à haute résolution (HRMA, examiné dans 7). SNA et T7E1 utilisent tous deux des endonucléases qui ne coupent que des bases incompatibles. Lorsqu’une région mutée du génome mutant hétérozygote est amplifiée, des fragments d’ADN provenant d’allèles mutants et de type sauvage sont recuits pour former de l’ADN double brin dépareillé (ADNds). Le SNA détecte la présence d’inadéquations par digestion avec une endonucléase spécifique à l’inadéquation et une électrophorèse simple sur gel d’agarose. Alternativement, HRMA utilise les propriétés thermodynamiques de l’ADNds détectés par les colorants fluorescents liant l’ADNds, la température de dissociation du colorant variant en fonction de la présence et du type de mutation. HRMA a été utilisé pour la détection de polymorphismes mononucléotidiques (SNP)8, le génotypage mutant du poisson zèbre9, les applications microbiologiques10 et la recherche en génétique végétale11, entre autres.
Cet article décrit HRMA, une méthode simple de génotypage moléculaire pour les moustiques mutants générée par la technologie CRISPR/Cas9. Les avantages de HRMA par rapport aux techniques alternatives comprennent 1) la flexibilité, car elle s’est avérée utile pour divers gènes, une large gamme de tailles d’indel, ainsi que la distinction entre différentes tailles d’indel et la différenciation hétérozygote, homozygote et trans-hétérozygote12,13,14, 2) le coût, car il est basé sur les réactifs PCR couramment utilisés, et 3) le gain de temps, car il peut être effectué en quelques heures seulement. En outre, le protocole utilise une petite partie du corps (une jambe) comme source d’ADN, permettant au moustique de survivre au processus de génotypage, permettant l’établissement et le maintien de lignées mutantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analyse de fusion à haute résolution offre une solution simple et rapide pour l’identification des indels générés par la technologie CRISPR/Cas9 chez le moustique vecteur Ae. aegypti. Il offre de la flexibilité, permettant le génotypage des moustiques mutés pour un large éventail de gènes allant du muscle de vol au métabolisme du fer et plus encore13,14. HRMA peut être effectué en quelques heures seulement, de la collecte de l’échan…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Toutes les figurines ont été créées avec Biorender.com sous licence à la Texas A & M University. Ce travail a été soutenu par des fonds de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses (AI137112 et AI115138 à Z.N.A.), texas a & M AgriLife Research dans le cadre du programme de subventions pour les maladies tronquées par insectes et le national Institute of Food and Agriculture de l’USDA, projet Hatch 1018401.
Materials
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
Riferimenti
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