Protein Analizi için Fare Retinasındaki Fotoreseptör Hücre Bölmelerinin İzolasyonu İçin İki Peeling Yöntemi
Summary
Bu protokol, protein analizi için murin çubuk fotoreseptörlerinin hücre altı bölmelerini izole etmek için iki teknik sunar. İlk yöntem, çubuk dış segmentlerini ayırmak için canlı retina ve selüloz filtre kağıdı kullanırken, ikincisi çubuk iç ve dış segment katmanlarını soymak için liyofilize retina ve yapışkan bant kullanır.
Abstract
Çubuk fotoreseptörleri, farklı bölmelere sahip oldukça polarize duyusal nöronlardır. Fare çubukları uzun (~80 μm) ve incedir (~2 μm) ve retinanın en dış tabakasında, fotoreseptör tabakasında lateral olarak paketlenir ve bu da benzer hücre altı bölmelerin hizalanmasına neden olur. Geleneksel olarak, donmuş düz monte edilmiş retinanın teğetsel kesiti, farklı çubuk bölmeleri içindeki proteinlerin hareketini ve lokalizasyonunu incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, çubuk baskın fare retinasının yüksek eğriliği, teğetsel kesiti zorlaştırır. Kompartmanlar arasındaki protein taşınması çalışmasıyla motive olarak, çubuk dış segmentini (ROS) ve batı lekeleri için diğer hücre altı bölmeleri güvenilir bir şekilde izole eden iki soyma yöntemi geliştirdik. Nispeten hızlı ve basit tekniklerimiz, normal çubuklardaki önemli fotoreseptör proteinlerinin dağılımını ve yeniden dağılımını nicel olarak ölçmek için zenginleştirilmiş ve hücre altı spesifik fraksiyonlar sunar. Dahası, bu izolasyon teknikleri, hem sağlıklı hem de dejenere retina içindeki diğer hücresel tabakaların protein bileşimini izole etmek ve kantitatif olarak araştırmak için kolayca uyarlanabilir.
Introduction
Nöral retinanın en dış tabakasında sıkıca paketlenmiş çubuk fotoreseptör hücreleri, loş ışık görüşünün ayrılmaz bir parçasıdır. Sadık foton sayaçları olarak işlev görmek için, çubuklar, tek foton yakalamaya hızlı, güçlendirilmiş ve tekrarlanabilir tepkiler üretmek için fototransdüksiyon adı verilen G-proteini tabanlı bir sinyal yolu kullanır. Işığa verilen bu tepki nihayetinde plazma zarındaki akımda bir değişikliği tetikler ve daha sonra görsel sistemin geri kalanına sinyal verir1. Adından da anlaşılacağı gibi, her çubuk hücresi farklı bir çubuk benzeri şekle sahiptir ve bir dış segment (OS), iç segment (IS), hücre gövdesi (CB) ve sinaptik terminalden (ST) oluşan oldukça polarize bir hücresel morfoloji sergiler. Her hücre altı bölmenin kendine özgü protein makineleri (membrana bağlı ve çözünür), biyomoleküler özellikleri ve görsel fototransdüksiyon, genel temizlik ve protein sentezi ve sinaptik iletim gibi önemli roller oynayan protein kompleksleri vardır2,3.
30 yıldan fazla bir süre önce, hücre altı proteinlerin, özellikle transdüsin (işletim sisteminden uzak) ve arrestinin (işletim sistemine doğru) ışığa bağımlı karşılıklı hareketi ilk olarak gözlendi4,5,6,7. İlk başlarda, gözlemlenen bu fenomen, kısmen immünohistokimyanın epitop maskelemeye karşı savunmasızlığı nedeniyle şüphecilikle karşılandı8. 2000’li yılların başında, uyarana bağımlı protein translokasyonu, titiz ve zorlu bir fiziksel kesitleme tekniği kullanılarak doğrulandı9. Dondurulmuş düz monte kemirgen retinanın seri teğetsel kesitlenmesi ve ardından immünoblotlama, transdüsin9,10, arrestin11,12 ve recoverin13’ün hepsinin ışığa yanıt olarak hücre altı yeniden dağılıma uğradığını ortaya koymuştur. Bu anahtar sinyal proteinlerinin ışığa bağlı translokasyonunun sadece fototransdüksiyon kaskadının duyarlılığını düzenlemekle kalmayıp9,14,15, aynı zamanda ışık hasarına karşı nöroprotektif olabileceğine inanılmaktadır16,17,18. Çubuklardaki ışığa bağlı protein taşınması, çubuk hücresi biyolojisi ve fizyolojisi için çok önemli göründüğünden, protein dağılımını belirlemek için farklı hücre altı bölmelerin izolasyonuna izin veren teknikler değerli araştırma araçlarıdır.
Şu anda, çubuk hücre altı bölmelerini izole etmeyi amaçlayan birkaç yöntem vardır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çoğaltılması uzun ve zor olabilir veya büyük miktarda retinal izolat gerektirebilir. Örneğin, yoğunluk gradyanı santrifüjleme yoluyla çubuk dış segment (ROS) preparatları19, ROS’u retinal homojenattan ayırmak için yaygın olarak kullanılır. Bu yöntem batı lekesi için yaygın olarak kullanılır, ancak prosedür çok zaman alır ve en az 8-12 murin retina20 gerektirir. Öte yandan, donmuş murin ve sıçan retinasının seri teğetsel kesiti, OS, IS, CB ve ST9,11,13’ün izole edilmesinde başarıyla uygulanmıştır. Bununla birlikte, bu yöntem, teğetsel kesitten önce retina tabakalarını hizalamak için küçük ve oldukça kavisli murin retinanın tamamen düzleştirilmesi gerekliliği nedeniyle teknik olarak zordur. Görsel sistemin hastalıklarını özetleyen çok sayıda fare modeli ve transgenik fare bulunduğundan, bireysel çubuk bölmelerini güvenilir, hızlı ve kolay bir şekilde ayıran bir tekniğin yaratılması, her bir özel bölmede meydana gelen fizyolojik süreçleri ve sağlık ve hastalıkta görsel süreçlerin altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmada umut vaat etmektedir.
Bu araştırmaları kolaylaştırmak için, çubuk hücre altı bölmelerini mevcut protokollerden daha kolay izole eden iki soyma yöntemi tanımladık. Yama kelepçesi kaydı21 için floresan olarak etiketlenmiş bipolar hücreleri açığa çıkarma tekniğinden uyarlanan ilk soyma yöntemi, ROS’u canlı, izole edilmiş bir murin retinadan sırayla çıkarmak için selüloz filtre kağıdı kullanır (Şekil 1). Üç primer retinal hücre tabakasını bir chick22 ve frog23 retinadan izole eden bir prosedürden uyarlanan ikinci yöntem, liyofilize bir retinadan ROS ve çubuk iç segmentini (RIS) çıkarmak için yapışkan bant kullanır (Şekil 2). Her iki prosedür de 1 saatte tamamlanabilir ve oldukça kullanıcı dostudur. Batı lekesi için bu iki ayırma protokolünün etkinliğinin, çubuk transdüsin (GNAT1) ve arrestinin (ARR1) ışığa bağlı translokasyonunu göstermek için C57BL / 6J farelerden karanlığa adapte olmuş ve ışığa maruz kalan retinayı kullanarak doğrulanmasını sağlıyoruz. Ayrıca, bant soyma yöntemini kullanarak, tekniğimizin immünositokimya (ICC) ve batı lekeleri tarafından elde edilen protein lokalizasyon verileri arasındaki tutarsızlıkları incelemek ve ele almak için kullanılabileceğine dair ek kanıtlar sunuyoruz. Spesifik olarak, tekniğimiz şunları göstermiştir: 1) protein kinaz C-alfa (PKCa) izoformu sadece bipolar hücrelerde değil, aynı zamanda düşük konsantrasyonlarda da olsa murin ROS ve RIS’de de bulunur24,25 ve 2) rodopsin kinaz (GRK1) ağırlıklı olarak izole edilmiş OS örneğinde bulunur. Bu veriler, spesifik çubuk ve retinal proteinleri ayırmak ve ölçmek için iki soyma tekniğimizin etkinliğini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birçok retina hastalığı çubuk fotoreseptör hücrelerini etkileyerek çubuk ölümüne ve nihayetinde tam görme kaybına yol açar37. İnsan retinal dejenerasyonunun genetik ve mekanik kökenlerinin önemli bir kısmı, yıllar boyunca çok sayıda fare modelinde başarıyla özetlenmiştir. Bu bağlamda, bireysel çubuk hücre altı bölmelerini küçük fare retinasından kolayca ve seçici olarak ayırma yeteneği, retina hastalıklarının lokalize biyokimyasal ve moleküler temelleri ha…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma JC’ye NIH Grant EY12155, EY027193 ve EY027387 tarafından desteklenmiştir. Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, ABD) ve Natalie Chen’e (USC, Los Angeles, ABD) makaleyi düzelttikleri için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, ABD) ve Dr. Janos Peti-Peterdi’ye (USC, Los Angeles, ABD) yazarın sağladığı görüntüleri toplamak için gerekli ekipmanı sağladıkları için teşekkür ederiz. Materyal: Kasey Rose ve ark., Protein analizi için fare retinasında fotoreseptör hücre bölmelerinin ayrılması, Moleküler Nörodejenerasyon, yayınlanan [2017], [Springer Nature].
Materials
| 100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter | N/A | N/A | |
| 100% O2 tank | N/A | N/A | |
| 1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm | Genesee Scientific | 25-235 | |
| 4X SDS Sample Buffer | Millipore Sigma | 70607-3 | |
| 50 mL Falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 95% O2 and 5% CO2 tank | N/A | N/A | |
| Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| CaCl2 (99%, dihydrate) | Sigma | C-3881 | |
| Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) | WA Hammond Drierite Co LTD | 21005 | |
| Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
| Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Falcon-Corning | 08-772F | |
| Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) | VWR | 100499-578 | |
| Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) | VWT | 100499-580 | |
| KCl (99%) | Sigma | P-4504 | |
| Kimble Kontes pellet pestle | Sigma | z359971 | |
| Labconco Fast-Freeze Flasks | Labconco | N/A | |
| LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask | N/A | N/A | |
| MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
| Milli-Q/de-ionized water | EMD Millipore | N/A | |
| Na2HPO4 (powder) | J.T. Baker | 4062-01 | |
| NaCl (crystal) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
| NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
| OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
| OmniPur HEPES, Free Acid | EMD | 5320 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Reynolds Wrap Aluminum Foil | Reynolds Brands | N/A | |
| Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) | Scotch-3M | N/A | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D67501 | |
| Spectrafuge mini centrifuge | Labnet International, Inc | C1301 | |
| Tissue incubation chamber (purchased or custom made) | N/A | N/A | |
| Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
| Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
| VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine | SP Scientific | N/A | |
| VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) | VWR | 28310-015 | |
| Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
| Wide bore transfer pipet, Global Scientific | VWR | 76285-362 |
Riferimenti
- Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Koch, K. W., Dell’Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
- Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
- Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
- Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
- Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
- Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
- Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
- Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
- Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
- Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
- Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
- Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don’t). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
- Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
- Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscienze. 174, 37-49 (2011).
- McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
- Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
- Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
- Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
- Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
- Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
- Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
- Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
- Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
- Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
- Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
- Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
- Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
- Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
- Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
- Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
- Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
- Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
- Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
