两种剥离方法，用于分离小鼠视网膜中的光感受器细胞区室以进行蛋白质分析

棒状光感受器细胞紧密地聚集在神经视网膜的最外层，是昏暗光视觉的一个组成部分。为了充当忠实的光子计数器，杆利用基于G蛋白的信号通路（称为光转导）来产生对单光子捕获的快速，放大和可重复的响应。这种对光的响应最终会触发质膜电流的变化，并随后向视觉系统的其余部分发出信号¹。顾名思义，每个杆细胞都具有独特的杆状形状，并表现出高度极化的细胞形态，由外段（OS），内段（IS），细胞体（CB）和突触末端（ST）组成。每个亚细胞区室具有特定的蛋白质机制（膜结合和可溶性）、生物分子特征和蛋白质复合物，这些蛋白质复合物起着至关重要的作用，如视觉光转导、一般内务管理和蛋白质合成以及突触传递^2，3。

30多年前，^{首次观察到亚}细胞蛋白的光依赖性相互运动，特别是转导素（远离OS）和停滞素（朝向OS），4^，5，6，7。早期，这种观察到的现象受到怀疑，部分原因是免疫组织化学对表位掩蔽的脆弱性⁸。在2000年代初，通过使用严格而艰苦的物理切片技术证实了刺激依赖性蛋白质易位⁹。对冷冻的平装啮齿动物视网膜进行连续切向切片，然后进行免疫印迹，结果显示，转导素^9，10，^{arrestin11，12}和^recoverin13都响应于光的亚细胞再分布。据信，这些关键信号蛋白的光驱动易位不仅调节光转导级联^{的灵敏度9，14，15}，而且还可能对光损伤具有神经保护作用^16，17，18。由于视杆细胞中的光驱动蛋白转运似乎对视杆细胞生物学和生理学非常重要，因此允许分离不同亚细胞区室以确定蛋白质分布的技术是有价值的研究工具。

目前，有几种旨在分离杆亚细胞区室的方法。然而，这些方法可能很长且难以复制，或者需要相当数量的视网膜分离物。例如，通过密度梯度离心¹⁹制备棒外段（ROS）通常用于将ROS与视网膜匀浆分离。这种方法广泛用于蛋白质印迹，但该过程非常耗时，并且至少需要8-12个小鼠视网膜²⁰。另一方面，冷冻小鼠和大鼠视网膜的连续切向切片已成功用于分离OS，IS，CB和^{ST9，11，13}。然而，这种方法在技术上具有挑战性，因为在切向切片之前，必须完全压平小而高度弯曲的小鼠视网膜以对齐视网膜层。由于有大量的小鼠模型和转基因小鼠概括视觉系统的疾病，因此创建一种可靠，快速且容易地分离单个杆室的技术有望揭示每个专用隔室中发生的生理过程以及健康和疾病中视觉过程背后的机制。

为了促进这些研究，我们描述了两种剥离方法，它们比目前的方案更容易分离杆亚细胞区室。第一种剥离方法改编自一种暴露荧光标记的双极细胞以进行膜片钳记录^的技术21，它采用纤维素滤纸从活的，分离的小鼠视网膜中依次去除ROS（图1）。第二种方法改编自从^{chick22和frog23}视网膜中分离出三个主要视网膜细胞层的程序，利用胶带从冻干视网膜中去除ROS和杆内段（RIS）（图2）。这两个程序都可以在1小时内完成，并且非常人性化。我们通过利用来自C57BL / 6J小鼠的黑暗适应和光暴露的视网膜来证明光诱导的杆转导素（GNAT1）和逮捕素（ARR1）的易位，从而验证了这两种分离方案对蛋白质印迹的有效性。此外，使用胶带剥离方法，我们提供了额外的证据，证明我们的技术可用于检查和解决通过免疫细胞化学（ICC）和蛋白质印迹获得的蛋白质定位数据之间的不一致。具体而言，我们的技术表明：1）蛋白激酶C-α（PKCα）亚型不仅存在于双极细胞中，还存在于小鼠ROS和RIS中，尽管浓度低^24，25和2）视紫红质激酶（GRK1）主要存在于分离的OS样品中。这些数据证明了我们的两种剥离技术在分离和定量特定视网膜蛋白和视网膜蛋白方面的有效性。