Denne protokol præsenterer en metode til at øge procentdelen af tumorindholdet i formalinfikserede paraffinindlejrede vævsprøver.
Tilstedeværelsen af kontaminerende ikke-tumorvæv i formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) væv kan i høj grad undergrave genomiske undersøgelser. Heri beskriver vi makrodissektion, en metode designet til at øge det procentvise tumorindhold i en vævsprøve ved at fjerne og eliminere uønsket væv inden udførelse af downstream-nukleinsyreekstraktioner. FFPE vævsblokke blev sektioneret til at producere 4-5 μm glidemonterede vævssektioner. Et repræsentativt afsnit blev indsendt til hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning og efterfølgende gennemgået af en bestyrelsescertificeret patolog. Under gennemgangen identificerede og markerede patologen regionerne af tumorvæv i H&E. Når den var færdig, blev den markerede H&E brugt til at guide resektion af de serielle ufarvede sektioner fra den samme vævsblok. For at demonstrere virkningerne af makrodissektion blev RNA ekstraheret fra matchede makrodissekterede og ikke-dissekerede diffuse store B-celle lymfomer (DLBCL) kørt på et digitalt genekspressionsassay, der var i stand til at bestemme DLBCL-subtype og BCL2-translokationsstatus. Resultaterne viste, at makrodissektion ændrede subtypen eller BCL2-translokationsstatusopkaldene i 60% af de undersøgte prøver. Afslutningsvis er makrodissektion en enkel og effektiv metode til udførelse af tumorberigelse forud for nukleinsyreekstraktioner, hvis produkt derefter med sikkerhed kan anvendes i nedstrøms genomiske undersøgelser.
Formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) væv, indsamlet som en del af den normale kliniske diagnostiske proces og opbevaret i kliniske vævslagre, udgør en enorm ressource til human forskning, herunder kræftforskning1. Efterhånden som vores forståelse af menneskelig sygdom uddybes, bliver det mere og mere klart, at sygdomme, der tidligere blev anset for at være enkeltenheder baseret på morfologiske og immunophenotypiske egenskaber, faktisk består af forskellige molekylære undertyper, der kræver molekylære subtyping-assays. Følgelig er genomiske assays med høj følsomhed, der er i stand til at skelne disse undertyper, blevet stadig vigtigere2. Selvom FFPE-væv er kendt for at være dårligt kompatible med genomiske teknikker på grund af fikseringsrelaterede problemer, efterhånden som teknologi og protokoller udvikler sig, bliver disse teknikker i stigende grad kompatible med dette klinisk allestedsnærværende vævsformat 3,4,5. FFPE-væv er imidlertid ofte blandinger af tumor- og ikke-tumorvævsmaterialer, hvor tilstedeværelsen af ikke-tumormateriale ofte er uønsket og, hvis det er til stede i en høj andel, kan undergrave og påvirke resultaterne af genomiske analyser betydeligt6. Faktisk anvendes et tumorindhold på mindst 60 % ofte til sådanne analyser, hvor væv, der ligger under denne tærskel, kan udelukkes, selv om det ellers opfylder undersøgelseskriterierne7. Dette kan være særligt problematisk i sjældne sygdomsindstillinger, hvor patientvæv er dyrebart og vanskeligt at indsamle i stort antal.
Makrodissektion er en metode, der minimerer virkningerne af lavt tumorindhold ved at reducere mængden af normalt væv3. Fjernelsen af sådant forvirrende ikke-tumormateriale før nukleinsyreekstraktion kan signifikant øge tumorprocentindholdet og dermed tumorrenheden af de ekstraherede nukleinsyrer. Vævsresektion er kritisk afhængig af ekspert patologisk gennemgang, hvor tumorregionen identificeres og cirkles på en frisk genereret hæmatoxylin og eosin (H&E) farvet vævssektion af en bestyrelsescertificeret patolog8. Den cirklede H&E bruges derefter til at guide fjernelse og indsamling af henholdsvis uønsket og målvæv. Denne protokol beskriver trinene i makrodissektion fra patologisk gennemgang gennem vævshøstning som udført på AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory på Mayo Clinic.
FFPE væv er ofte heterogene blandinger af tumor og ikke-tumor væv. Genomiske tests med høj følsomhed bliver mere og mere udbredt i både kliniske og forskningsmæssige indstillinger, men kan blive forvirret af tilstedeværelsen af forurenende ikke-tumorvæv. Faktisk anbefales et minimum tumorindhold på 60% ofte til genomiske undersøgelser. Procent tumor kan bestemmes af det vævsområde, der optages af tumormaterialet eller af andelen af tumorceller i vævet. Selvom tumor efter område er en almindeligt anvendt metrik for tumorrenhed, skildrer den ikke altid en nøjagtig beskrivelse af vævet. Overvej to væv, begge med 1000 celler, hvoraf 500 er tumorceller. I væv A er de 500 ikke-tumorceller stromale celler med lignende volumener som tumorcellen. I dette væv kan procentdelen af tumor betragtes som 50% af både cellularitet og areal. I væv B er de 500 ikke-tumorceller fedtceller med volumener, der er 4x tumorcellens. I dette væv er procentdelen tumor stadig 50% efter cellularitet, men 20% efter område. Et tredje væv, væv C, består af 500 tumorceller plus 400 fedtceller og 800 stromale celler med volumener, der er henholdsvis 4x og 0,5x tumorcellernes. Givet 100 fedtceller svarer til volumenet af 800 stromale celler, er procentdelen af tumor af væv C 29% efter cellularitet (500/1700), men stadig 20% efter område. Væv D består også af tumor-, fedt- og stromale celler med volumenforhold på 1x, 4x og 0,1x. Antallet af celler er dog henholdsvis 400, 10 og 720. Således er procentdelen tumor af væv D 35% efter cellularitet (400/1130), men 78% efter område. Disse eksempler er alt for forenklede og afspejler ikke vævssammensætninger i den virkelige verden, men formidler klart vigtigheden af vævssammensætning og forskellen mellem tumorindhold efter område og efter cellularitet. Det er vigtigt, at når det kommer til berigelse af tumorindhold til downstream nukleinsyreekstraktion, er tumorcellulæritet den vigtigere egenskab på grund af det øgede confoundingspotentiale ved ekstraktion af genomisk materiale fra flere ikke-tumorceller end tumorceller. Dette understreger ikke kun behovet for at vurdere tumorindholdet i væv med hensyn til procentvis cellularitet, men også behovet for at fjerne uønsket væv for at minimere eventuelle negative virkninger af ikke-tumorvævet. Der er flere metoder til rådighed til vævsberigelse, hvor de vigtigste er makrodissivektion og mikrodissicering.
Makrodissektion, metoden beskrevet i denne protokol, er relativt hurtig, enkel og kræver ikke dyrt eller specialiseret udstyr. Selvom makrodissektion i høj grad kan forbedre tumorindholdet, er det vigtigt at forstå, at det ikke fuldstændigt eliminerer ikke-tumormateriale. Formålet med makrodissektion er at berige vævet af interesse tilstrækkeligt gennem udelukkelse af uønsket væv for at reducere “støj” fra uønsket væv, hvilket igen kan forbedre signalet om interesse fra vævet af interesse. Makrodissektion medieret tumorberigelse er således en måde at forbedre signal-støj-forholdet for bedre at detektere markører af interesse, især tumorspecifikke molekylære markører med lav overflod eller dårlig ekspression. Makrodissektion har imidlertid begrænsninger på grund af manglen på præcision, der tilbydes af grove værktøjer såsom barberblade og er modtagelig for præcisionsproblemer, der stammer fra linjetykkelsen af patologens markør, samt potentielle fejl ved sporing af patologernes H&E-afgrænsninger. Som nævnt ovenfor er det ikke muligt at opnå 100% tumorrenhed på grund af tilstedeværelsen af iboende og tumorfremkaldende stromale elementer (dvs. bindevæv, stromale fibroblaster, blodkar, godartede reaktive lymfocytter, makrofager) indlejret i selve tumoren. Faktisk inducerer mange invasive eller diffust infiltrative maligniteter et robust desmoplastisk stromalt respons, hvilket resulterer i klynger af tumorceller, der er tæt blandet med stromale fibroblaster og andre ikke-neoplastiske celletyper; hvor tumorer forbundet med dette stromale reaktionsmønster, såsom kræftvævi bugspytkirtlen 21, kan drage større fordel af digitalt guidet mikrodissektion snarere end manuel makrodissektion.
Manuel mikrodissivektion udføres under et mikroskop for at hjælpe identifikation, dissektion og isolering af vævsspecifikke celler eller populationer ved hjælp af en nål eller skalpel og har fordelen ved øget præcision i forhold til makrodissektion22. Manuel mikrodissektion er imidlertid en besværlig proces, der mangler den finesse, der er nødvendig for komplekse væv med lavt tumorindhold eller indviklede funktioner, der er uforenelige med manuel dissektion. Sådanne væv kan dissekeres ved hjælp af automatiserede metoder med høj præcision som laserfangst mikrodissektion. Faktisk har digitalt guidet mikrodissektion vist sig at give højere procentdel tumorindhold sammenlignet med manuel makrodissektion i kræftvæv i bugspytkirtlen23. Ulemperne ved disse automatiserede metoder med høj præcision, såsom behovet for specialiseret, dyrt udstyr og højtuddannede personer, har imidlertid hindret dets inkorporering i arbejdsgange. En undersøgelse af de Bruin et al., der sammenlignede virkningerne af makrodissektion og laserfangstmikrodissektion (LCM) på genekspressionsprofilering, viste, at LCM-prøver havde lave samlede RNA-udbytter (30 ng gennemsnit) og krævede to runder mRNA-amplifikation for at opfylde cDNA-bibliotekets prep-inputtærskel24. Forfatterne fandt ud af, at de resulterende LCM-genekspressionsprofiler blev påvirket af runderne af mRNA-amplifikation mere end makrodissektionsprofiler blev påvirket af ikke-tumorstromale bidrag og konkluderede, at makrodissektion kunne anvendes tilstrækkeligt til at generere pålidelige genekspressionsdata24.
En væsentlig fordel ved NanoString digital genekspressionsprofilering, især når man arbejder med stærkt nedbrudt FFPE-afledt RNA, er, at det ikke kræver enzymatiske afhængige processer såsom RNA-amplifikation eller forberedelse af cDNA-biblioteker. Imidlertid er assays typisk optimeret til input mellem 50-300 ng af total RNA25,26, som baseret på resultaterne af de Bruin et al.24 muligvis ikke er kompatible med mikrodissekteret væv uden at øge vævsinputtet; en ugunstig efterspørgsel i en tid, hvor vævsprøver i stigende grad indsamles som små biopsier snarere end kirurgiske resektion. RNA-indgangene, der blev anvendt til DLBCL90-assayet, varierede fra 68,5-300 ng for både det makrodissektionerede og ikke-dissekerede væv. Resultaterne viser, at makrodissektion resulterede i opkaldsændringer i 60% af de undersøgte prøver, og at disse ændringer blev observeret uanset RNA-input af de makrodisserede prøver. COO-sandsynligheden for det lave RNA-input greb imidlertid ind i COO GCB /UNC-sandsynlighedsopkaldstærsklen, hvor tærsklerne er 0 til 0,9 til 1,0 for ABC-opkald20. De vigtigste DLBCL COO-undertyper er GCB og ABC, som udgør 41% og 44% af alle DLBCL-tilfælde, hvor UNC repræsenterer en mellemgruppe af de to og ABC er den mest aggressive20,27. Mens COO-opkaldsændringen ved makrodissering af prøve C således ikke forårsagede en ærlig ændring i COO-undertype fra GCB til ABC, kan ændringen fra GCB til UNC antyde et skift i retning af en mere aggressiv sygdom. Desuden viser nylige undersøgelser, at UNC-undertypen ikke blot er en mellemliggende undertype, og at den potentielt kan besidde subtypespecifikke terapeutisk udnyttelige egenskaber28. Tilsvarende forårsagede makrodissering af prøver A og E ikke ærlige ændringer i DHITsig-opkald fra DH-negativ til DH-positiv eller omvendt. Imidlertid er bevægelserne af en GCB-prøve (prøve A) fra NEG til UNCLASS og en ABC-prøve (prøve E) fra UNCLASS til NEG ved makrodissektion biologisk passende, da dobbelt hittranslokationer, der involverer BCL2, rapporteres at være et udelukkende GCB-fænomen19. Selvom translokationer traditionelt og allestedsnærværende detekteres af FISH i kliniske omgivelser, er der et voksende momentum for at identificere en alternativ mindre involveret og tidskrævende metode til deres påvisning. DLBCL90-analysen er et vigtigt værktøj, der imødekommer dette behov, hvor begrundelsen for dets anvendelse styrkes ved konstateringen af, at dette assay er i stand til at detektere translokationer kryptiske til FISH-sonder, der anvendes i klinisk diagnostik29.
Makrodissektionsprotokollen beskrevet ovenfor skitserer en simpel metode, der gør det muligt for forskere at øge tumorindholdet i vævsprøver, der normalt ville falde under almindeligt anvendte undersøgelseskriterier. Inkludering af makrodissektion i en undersøgelsesarbejdsgang gør det muligt for forskere at redde dårligt tumortæt væv fra undersøgelsesudelukkelse ved at øge deres tumorindhold. Til gengæld tillader dette øget tillid til, at de resulterende RNA- og DNA-eluater repræsenterer tumoren under genomisk undersøgelse. Selvom der findes andre mere præcise metoder til vævsdissektion, er makrodissektion sandsynligvis tilstrækkelig for tumorer, der vokser på en mere ekspansiv, ikke-infiltrativ, arklignende eller solid måde. Resultaterne præsenteret her fremhæver vigtigheden af tumorrenhed i genomiske assays og makrodissektion som et pålideligt værktøj til at opnå dette.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde støttes af NIH-finansieret AIDS og Cancer Specimen Resource (ACSR, UM1 CA181255-2) under sit biospecimen videnskabsprogram. Videoen blev filmet, og redigering efter produktionen blev udført af Mayo Clinic Media Services.
200-proof ethanol | Decon | 2701 | |
AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | DNA/RNA FFPE extraction kit |
Coplin pots | Various | x | |
DLBCL90 probes | NanoString | various | Digital gene expression profiling based DLBCL90 assay |
d-Limonene | VWR | 89376-092 | |
Forceps | Various | x | |
Glass micrscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
Glycerol | VWR | 0854-1L | |
Master kits | NanoString | various | |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Microtubes | Ambion | AM12400 | |
NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer for DNA, RNA and protein qualitation |
nCounter | NanoString | x | Digital gene expression profiling platform used to run the DLBCL90 assay |
Permanent marker | Electrib Microscope Sciences | 72109-12 | |
Razor blade dispenser | Electrib Microscope Sciences | 71985-10 | |
Razor blades | Electrib Microscope Sciences | 71985-23 | |
Tissue digestion buffer | Qiagen | 80234 | |
Ultrapure water | VWR | SH30538.02 | |
Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |