ファージディスプレイを使用してE3リガーゼ用ユビキチンバリアント変性変性器を開発する
Summary
ユビキチン化は翻訳後修飾の重要なタンパク質であり、その中で多くのヒト疾患に関与している調節不全である。このプロトコルは、ファージディスプレイを使用して、ユビキチン化の特異性、効率、パターンを制御するE3リガスの活性を結合および調節できる新しいユビキチン変異体を分離する方法を詳述する。
Abstract
ユビキチンは、ユビキチンプロテアソーム系のコア成分である小さな8.6 kDaタンパク質です。その結果、高い特異性を持つが、親和性が低いタンパク質の多様な配列に結合することができます。ファージディスプレイを通じて、ユビキチン変異体(UbV)は、野生型ユビキチンに対する親和性が向上し、標的タンパク質に対する結合特異性を維持するように設計することができる。ファージディスプレイはファージミドライブラリーを利用し、それにより、糸状M13バクテリオファージ(ファージ表面に外部に表示されるために選択される)のpIIIコートタンパク質がUbVと融合する。ヒト野生型ユビキチンの特定の残基は、標的タンパク質との新規相互作用を促進するために必要な多様性を導入しながら、タンパク質の構造の有害な変化を回避するようにUbVを生成するために軟らかくランダム化される(すなわち、天然の野生型配列に偏りがある)。ファージ表示プロセス中に、これらのUbVはファージコートタンパク質上に発現および表示され、目的のタンパク質に対してパンされます。標的タンパク質との良好な結合相互作用を示すUbVは保持され、一方、不良な結合剤は洗い流され、ライブラリプールから除去される。UbVの対応するファージミドを含むファージ粒子に取り付けられた保持されたUbVは、別のファージディスプレイで同じ標的タンパク質に対してパンできるように溶出し、増幅し、濃縮されます。通常、ファージディスプレイの最大5ラウンドが実行され、その間に弱くおよび/または無差別に結合するUbVに対して強い選択圧力が課され、親和性の高い人が濃縮され、濃縮されます。最終的には、野生型よりも標的タンパク質に対する特異性および/または親和性を示すUbVは単離され、さらなる実験を通じて特徴付けることができます。
Introduction
タンパク質とタンパク質相互作用の分子的詳細を理解することは、生物学的プロセスのシグナル伝達機構、特に臨床的に重要な疾患に寄与するシグナル伝達機構を解き出す上で重要です。近年、ファージディスプレイは、目的の標的タンパク質1,2,3,4に対する結合力が大幅に改善されたタンパク質/ペプチドを単離する実用的かつアクセス可能な方法として利用されており、タンパク質とタンパク質相互作用の細胞内プローブとして使用することができます。
ユビキチン化は酵素活性(E1活性化酵素→E2共役酵素→E3リガース)のカスケードであり、タンパク質基質にユビキチン(Ub)を共有結合して分解または細胞シグナル伝達の変化を仲介する。さらに、デュビキチナーゼはタンパク質からのユビキチンの除去を触媒する。したがって、細胞には何千ものUb依存性タンパク質相互作用があり、その大半は親和性は低いが特異性が高い共通の表面を認識し、大きく多様な表面を介して弱い相互作用を可能にする。
Ernstらは、高い選択性を維持しながら、関心のあるタンパク質に対する結合親和性を高めることができるかどうかを確認するために、Ubの既知の結合領域に突然変異を導入した。100億個以上(7.5 x 1010)Ub変異体(UbV)の組み合わせライブラリで、既知のUbタンパク質相互作用を媒介するUb表面全体の位置に変異が生まれました。このライブラリーは、M13バクテリオファージpIIIコートタンパク質を多様なUbVに融合させたフェゲミドで構成されていました。したがって、個々のUbVは、発現時にコートタンパク質を介してファージ表面に表示することができる。選択プロセス中に、標的タンパク質とのかなりの結合相互作用を有するUbVを表示するファージは、ファージディスプレイの後のラウンドで保持され、濃縮され、一方、標的タンパク質に不十分に結合するUbVを表示するファージは洗い流され、ファージプールから除去される。保持されたファージ粒子は、表示されたUbVに対応するファージミドを含み、それらを配列し、一度単離した後にさらに特徴付けることを可能にする。
このタンパク質工学戦略を用いて、UbV阻害剤はヒトデュビキチン酵素5およびウイルスプロテアーゼ6のために開発された。重要なことに、我々は、E2結合部位をハイジャックし、HECTドメイン7上のUb結合エキソサイトを占有するUbVを活性化することによって、ヒトHECTファミリーE3リガス用の阻害UbVを生成した。また、E2結合部位を標的とすることにより単量体リングファミリーE3を阻害し、均一体性RING E3s8を活性化するためにUbV二量体化を誘導することができる。マルチサブユニットリングE3の場合、UbvはRINGサブユニット(例えば、APC / C complex9)を標的にするか、または複合体形成を妨害することによって阻害を達成することができます(例えば、SCF E3s10の場合)。UbVを活用して、Ub-プロテアソーム系(UPS)におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を体系的に問い合わせて、UPS酵素の生化学的メカニズムをよりよく解読し、治療介入のための機能的部位を同定および検証することができます。
以下のプロトコルは、以前に生成されたファージ表示UbVライブラリを使用して目的のタンパク質を標的とする方法と、ファージディスプレイの連続したラウンドを介して標的タンパク質と相互作用するUbVバインダーを濃縮する方法を説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ステップ2.1(タンパク質調製物)で述べたように、タンパク質濃度を評価するために様々な方法を使用することができ、ファージディスプレイに使用される特定の標的タンパク質に基づいて、それぞれがユニークな利点と欠点を有するであろう。一般的なメソッドの詳細な説明とプロトコルのソースは、以前に提供されています 11.
前のラウンドのファー?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ユビキチン変異体技術は、博士サクデフ・シドゥ(トロント大学)の研究室で考案されました。WZは現在、人間とマイクロバイオームプログラムのCIFARアズリエリグローバルスカラーです。この研究は、WZ(RGPIN-2019-05721)に授与されたNSERCディスカバリー助成金によって資金提供されました。
Materials
| Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) | Fisher Scientific | 14-222-198 | Culturing phage outputs after phage display. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | Preparing plates for titering. |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V | BioShop Canada | ALB001 | Buffer component. |
| Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous | Millipore-Sigma | C1389-5G | Culturing phagemid-infected cells. |
| Compact Digital Microplate Shaker | Fisher Scientific | 11-676-337 | Shaking plates during incubation with the phage library. |
| Corning Microplate Aluminum Sealing Tape | Fisher Scientific | 07-200-684 | Sealing phage glycerol stocks. |
| Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Preparing plates for titering. |
| DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer | DeNovix | DS-11 FX+ | Protein concentration measurement. |
| Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Fisher Scientific | 7000133 | Storing phage glycerol stocks. |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | Phage elution. |
| Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C854003 | Bacterial strain for phage infection. |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | AAJ1792406 | Culturing M13K07 helper phage-infected cells. |
| M13KO7 Helper Phage | New England Biolabs | N0315S | Permit phagemid packing and secretion. |
| MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker | Fisher Scientific | 11-676-076 | Bacterial cell culture. |
| Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom | Life Technologies | 44-2404-21 | Immobilizing proteins. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution | Fisher Scientific | BP3994 | Buffer component/phage resuspension medium. |
| Polyester Films for ELISA and Incubation | VWR | 60941-120 | Covering the microplates during incubation. |
| Polyethylene Glycol 8000 (PEG) | Fisher Scientific | BP233-1 | Phage precipitation. |
| Sodium chloride | Millipore-Sigma | S3014 | Phage precipitation. |
| Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | Culturing phage inputs. |
| Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | Culturing E. coli OmniMax cells. |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP1525 | Neutralizing eluted phage solution. |
| Tryptone Powder | Fisher Scientific | BP1421-2 | Cell growth media component. |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | Buffer component. |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Cell growth media component. |
Riferimenti
- Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).
- Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
- Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
- Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
- Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
- Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).
- Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
- Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
- Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
- Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
- Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
- Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
- Sheehan, J., Marasco, W. A. Phage and yeast display. Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).
- Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
- Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. Biochimica. 30 (45), 1-7 (1991).
- Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
- Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
- Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
- Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
- Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
- Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
- Reiersen, H., et al. Covalent antibody display–an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
- Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
- Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
- Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).
