DUCT: Двойное литье смолы с последующей микрокомпьютерной томографией для 3D-анализа печени

Протокол, описанный в этом исследовании, был одобрен и соответствует правилам и положениям о благополучии животных Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd (Стокгольмский совет по этике исследований животных). Животные, использованные в этом исследовании, были дикими или гомозиготными мутантными мышами Jag1H268Q на смешанном фоне C3H / N и C57bl6J. В исследование были включены как мужчины, так и женщины. Животных использовали на 15-й послеродовой день или во взрослом возрасте от 3 до 8 месяцев. 1. Двойные инъекции смолы ПодготовкаПриготовьте раствор смолы. Для двойных системных впрысков смолы приготовьте как желтые, так и зеленые смолы, как описано на этапах 1.1.2-1.1.4. Приготовьте 1 мл аликвоты разбавленной смолы на мышь. Желтая смола: Разбавьте желтый силиконовый каучук (с высокой рентгенопроницаемостью) прозрачным разбавителем в разведении 3:1 для приготовления желтой смолы для инъекций. Зеленая смола: смешайте синюю силиконовую резину (неопределяемую рентгенопроницаемость) с прозрачным разбавителем в разведении 1:1 для получения синей смолы. Для получения зеленой смолы смешайте разбавленную синюю смолу с разбавленной желтой смолой в соотношении 1:1. Тщательно вихрьте зеленую смолу, пока цвет не станет однородным.ПРИМЕЧАНИЕ: Синяя смола имеет очень низкую рентгенопроницаемость, которая не обнаруживается с помощью микроКТ, что поэтому требует разбавления желтой смолой для создания двух смол с различной рентгенопастульностью.ВНИМАНИЕ: Смола может содержать хромат свинца, который является канцерогеном. Он производит ядовитые газы в огне. Обращайтесь с осторожностью и утилизируйте смолу как опасные отходы. Подготовьте два набора инъекций (набор инъекций No1 и набор инъекций No2) с трубками, как описано на этапах 1.1.6-1.1.11.ПРИМЕЧАНИЕ: Для взрослых мышей (>P30 (послеродовой день 30) = P30 – 2 лет) используйте инъекционный набор No1 (трубка PE10 с наружным диаметром 0,6 мм) для инъекции в общий желчный проток и инъекционный набор No2 (трубка PE50 с наружным диаметром 0,96 мм) для инъекции в воротную вену. Для молодых послеродовых мышей (до P30) приготовьте два набора инъекций No 1, один для желчных протоков и один для инъекции в воротную вену (без набора инъекций No 2, поскольку портальная вена слишком узкая, чтобы вместить трубку PE50). Для приготовления инжекционного набора No1 нарежьте 30 см трубки PE10 и растяните один конец трубки вручную, потянув его до тех пор, пока он не станет как можно более тонким (рисунок 1A,B, диаметр примерно 0,15 мм, нерастянутая трубка PE10 диаметром 0,6 мм). Вырежьте наконечник растянутой трубки PE10 по диагонали, чтобы создать скошенный наконечник (рисунок 1B). Подключите нерастянутый конец трубки PE10 к игле 30 Г (Рисунок 1А, Набор для инъекций No1). Чтобы подготовить инъекционный набор No2, отрежьте 30 см трубки PE50 и растяните один конец трубки вручную, потянув его до тех пор, пока он не станет достаточно тонким, чтобы поместиться в портальную жилу (рисунок 1A,B, приблизительно 0,7 мм, нерастянутая трубка PE50 диаметром 0,96 мм). Вырежьте наконечник растянутой трубки PE50 по диагонали, чтобы создать скошенный наконечник (рисунок 1B). Подключите нерастянутый конец трубки PE50 к игле 23 G (рисунок 1A, набор инъекций No2).ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый набор инъекций может быть использован только для одной инъекции, так как смола затвердеет в шприце и трубке. Отрегулируйте размер растянутого и скошенного кончика в зависимости от размера общего желчного протока и воротной вены мыши в зависимости от ее возраста, генотипа и фенотипа. Если вы не уверены в размере и посадке трубки, вставьте трубку в соответствующий канал или сосуд после разреза и до того, как трубка будет заполнена смолой. Если трубка слишком широкая, чтобы поместиться в канале/сосуде, растяните ее дальше. Обезболить животное путем вдыхания изофлурана (первые 4% в индукционной камере и ~2% с помощью носового конуса). Поместите мышь на вентилируемую скамью на подушечку для рассечения, пока мышь дышит изофлураном через носовой конус. Убедитесь, что животное находится без сознания, с помощью метода, рекомендованного институтом / IRB, например, путем ущипывания одной из лап.ВНИМАНИЕ: Изофлуран может вызвать сонливость или головокружение при вдыхании и может вызвать повреждение сердечно-сосудистой системы и центральной нервной системы при длительном или повторном воздействии. Не вдыхайте его. Обрабатывайте вещество на вентилируемой скамье и в хорошо проветриваемых помещениях.ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать другой метод обезболивания, если он совместим с перфузией сердца. Как только животное потеряет сознание, опрыскивайте брюшную сторону 70% этанолом, чтобы предотвратить вмешательство из шерсти. Используя кожные ножницы, разрезайте кожу, фасции и мышечный слой, начиная со средней линии брюшной полости и прорезайте до грудной полости, чтобы обнажить внутренние органы. Захватите мечевидный отросток щипцами, чтобы поднять грудину и разрезать диафрагму и грудную клетку с обеих сторон, чтобы обнажить сердце и легкие. Снимите грудную клетку, разрезав ножницами ребра с левой и правой сторон грудной клетки. Будьте особенно осторожны, чтобы не повредить печень, так как это приведет к утечке смолы. С помощью прямых щипцов потяните сердце в сторону печени и отрежьте правое предсердие. Ввести иглу бабочки (23 г), соединенную с перистальтическим перфузионным насосом, в левый желудочек. Перфицитируйте мышь транскардиально сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS) и гепарином (1 ЕД/г массы тела мыши). Перфузия в течение 3 мин со скоростью перфузии 5 мл/мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышь перфузируется правильно, внутренние органы станут бледными, особенно печень. Если вместо этого легкие становятся белыми, игла вводится в правый желудочек и должна быть перемещена. После перфузии мышь отчаивается и может быть удалена из носового конуса и изофлурана. Выключите насос изофлурана. Инжекция смолы – Билиарная система литья смолПереместите мышь к микроскопу рассечения, живот вверх, хвост к экспериментатору и отойдите от экспериментатора. Анатомические ориентиры, представляющие интерес, изображены на рисунке 2А. Найдите нижнюю полую вену (рисунок 2А), переместив кишечник в сторону. Используйте пружинные ножницы, чтобы сделать небольшой поперечный разрез в нижней полой вене, чтобы обеспечить освобождение печеночного сосудистого давления (рисунок 2Bi). Обнажите общий желчный проток и воротную вену, как описано в шагах 1.2.4- 1.2.6. Переместите кишечник и поджелудочную железу в правую сторону (экспериментатора) с помощью фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), смоченного ватным тампоном. Переверните вентральную сторону печени к сердцу, используя смачиваемый PBS ватный тампон, чтобы обнажить висцеральную поверхность и область хилара. Найдите общий желчный проток, который проходит из хилярной области через поджелудочную железу и в кишечник в сфинктере Одди (Рисунок 2Bii, общий желчный проток, очерченный желтой пунктирной линией, черные наконечники стрел указывают на Сфинктер Одди).ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что печень влажная на протяжении всей процедуры, посыпав ее PBS. Очистите окружающие ткани (площадь ~ 5 мм) от общего желчного протока с помощью прямых щипцов. Поместите шелковую шовную нить (размер 4-0, 0,17 мм, длиной 3 – 5 см) под общий желчный проток (рисунок 2Bii) и завяжите свободный узел вокруг общего желчного протока (рисунок 2Biii).ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите область для узла на полпути между хилярной областью и сфинктером Одди и на некотором расстоянии от воротной вены, чтобы после того, как шов будет затянут вокруг общего желчного протока, он не мешал инъекции воротной вены. Держите пружинные ножницы плоско против общего желчного протока, чтобы сделать косой разрез к общему желчному протоку в том месте, где общий желчный проток попадает в поджелудочную железу и кишечник рядом со сфинктером Одди. (Рисунок 2Biv), желтая пунктирная линия очерчивает сфинктер области Одди, подчеркнутый черными наконечниками стрелок).ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг. Сделайте косой, а не поперечный разрез, и сделайте разрез; не разрывайте желчный проток. Разрезание всего желчного протока делает вставку трубки очень сложной. Непосредственно перед использованием смешайте 1 мл желтой смолы с 50 мкл отверждающего агента (путем заполнения и опорожнения шприца 1 мл) и заполните шприц Luer объемом 1 мл смесью смолы и отверждающего агента. Соедините наполненный шприц с трубкой (комплект No1). Нажмите на плунжер, чтобы полностью заполнить трубку. Убедитесь, что смесь смолы/отверждающего агента капает с кончика трубки.ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте и удаляйте пузырьки в шприце и трубке для достижения наилучших результатов. С помощью щипцов выпрямите область вокруг разреза общего желчного протока и вставьте трубку в отверстие в общем желчном протоке (рисунок 2Bv), с самым длинным краем скошенного кончика вниз к дорсальной стороне желчного протока. Такая ориентация гарантирует, что смола может выйти из отверстия трубки, которое обращено вверх, в воздуховод (рисунок 2Bv). Затяните узел шелковой нити, чтобы закрепить трубку внутри общего желчного протока (рисунок 2Bvi). Введите смолу в общий желчный проток. Наблюдают за желчным пузырем и отдельными долями печени. Массируйте печень ватным тампоном, смачиваемым PBS, чтобы помочь равномерно распределить смолу. Заполненные смолой концевые ветви желчных протоков (у мышей дикого типа) слабо видны на поверхности печени.ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемое время наполнения печени составляет 30 -100 с. Прекратите инъекцию смолы при появлении точек смолы на поверхности печени (рисунок 2Ci, синие наконечники стрелок) или при достижении сопротивления.ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте как можно быстрее, так как смола начинает затвердевать после добавления отверждающего агента смолы. Рабочее время от добавления отверждающего агента составляет примерно 15 мин. Снимите трубку, вытащив ее из общего желчного протока, и быстро затяните шелковый узел с помощью щипцов, чтобы предотвратить утечку смолы. Отрежьте рыхлые концы шелкового шва, чтобы они не мешали инъекции воротной вены. Утилизируйте трубки, содержащие смолу и оставшуюся смолу, в опасные отходы, а иглу в отходы острых предметов. Инжекция смолы – Портальное литье из венозной смолы Очистите воротную вену (площадь ~ 5 мм) от окружающих ее тканей примерно в 2 см от ее поступления в печень с помощью прямых щипцов. Поместите шелковую шовную нить (размер 4-0, 0,17 мм, длиной 3 – 5 см) под очищенный участок воротной жилы (рисунок 2Ci) и завяжите свободный узел (рисунок 2Cii). Сделайте продольный разрез в воротной вене дистально к печени и узлу (рисунок 2Ciii). Смешайте 1 мл зеленой смолы с 50 мкл отверждающего агента (путем заполнения и опорожнения шприца объемом 1 мл) и заполните шприц Luer объемом 1 мл смесью смолоотверждающего агента. Соедините заполненный шприц с трубкой (набор No2 для мышей >P30, новый набор No1 для мышей <P30). Нажмите на плунжер, чтобы полностью заполнить трубку. Убедитесь, что смола капает с кончика трубки.ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте и удаляйте пузырьки в шприце и трубке для достижения наилучших результатов. С помощью щипцов выпрямите воротную вену, потянув окружающие ткани в сторону экспериментатора и вставьте трубку с самым длинным краем скошенного кончика в сторону спинной стороны сосуда (рисунок 2Ciii). Затяните шелковую нить, чтобы закрепить трубку в воротной вене. Ввести смолу в воротную вену. Наблюдайте, как кровеносные сосуды заполняются смолой. Массируйте печень ватным тампоном, смачиваемым PBS, чтобы помочь равномерно распределить смолу (рисунок 2Civ). Прекратите инъекцию смолы, когда все кровеносные сосуды заполнены (концы портальных вен видны на периферии печени) или когда сопротивление будет удовлетворено.ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, так как смола начинает затвердевать после добавления отверждающего агента. Рабочее время от добавления отверждающего агента составляет приблизительно 15 мин для инъекционного набора No1 и 25 мин для инъекционного набора No2. Снимите трубку, вытащив трубку из портальной вены, и быстро затяните шелковый узел с помощью щипцов, чтобы предотвратить утечку смолы. Утилизируйте трубки, содержащие смолу и оставшуюся смолу, в опасные отходы, а иглу в отходы острых предметов. Рассечение и фиксация печениРассекните всю печень, отрезав ее от окружающих тканей и диафрагмы. Осторожно поместите всю печень в пустую коническую трубку объемом 50 мл, причем вентральная сторона обращена вверх, а спинная сторона опирается на стенку конической трубки, чтобы предотвратить деформацию печени. Храните коническую трубку горизонтально в течение ночи при температуре 4 °C, чтобы смола полностью затвердела.ПРИМЕЧАНИЕ: Любой контейнер, который достаточно велик, чтобы вместить печень, может быть использован вместо конической трубки объемом 50 мл. Использование контейнера с плоским дном увеличит вероятность того, что печень не деформируется. Разделите печень на отдельные доли. Сделайте выбор лепестков, которые будут использоваться для микроАКТ-анализа (1.4.4-1.4.5) или контроля качества (1.4.6-1.4.8). Необязательно используйте всю печень как для оптической очистки, так и для микроКТ, не разделяя ее на отдельные доли.ПРИМЕЧАНИЕ: Архитектура печени желчевыводящей и сосудистой систем различна в каждой доле, и поэтому необходимы соответствующие анализы долей. Оптическая очистка не препятствует микроКТ-сканированию, а мочки, используемые для контроля качества, могут быть впоследствии отсканированы с помощью микроКТ. И наоборот, образцы, отсканированные с помощью микроКТ, могут быть впоследствии оптически очищены для сравнения. Таким образом, возможен анализ всей печени. У мышей дикого типа (генетический фон C3H / C57bl6) правая медиальная доля заполняется сначала инъекциями смолы, что делает ее подходящей долей для анализа микроКТ с самой высокой воспроизводимостью. Левая боковая доля является самой большой долей, в которой, следовательно, легко провести предварительный скрининг на качество инъекции. Выбор доли (или всей печени), используемой для контроля качества и микроКТ-сканирования, зависит от животной модели и исследовательского вопроса. В проветриваемой вытяжке готовят 4% раствор формальдегида (10 -20 мл на пробирку). Зафиксируйте доли, используемые для микроКТ, 4% формальдегида на ночь при 4 °C, а затем промыть один раз PBS (10 -20 мл на тюбик). Соберите отходы формальдегида в отдельный контейнер. Держите доли печени в PBS при 4 °C для краткосрочного хранения или 70% этанола для длительного хранения. Перейдите к разделу 2: Микрокомпьютерная томография.ВНИМАНИЕ: Формальдегид вызывает острую токсичность при проглатывании, вдыхании или контакте с кожей. Формальдегид представляет собой легковоспламеняющуюся жидкость и пары. Это вызывает сильные ожоги кожи и повреждение глаз. Может вызвать аллергическую кожную реакцию. Смертельный исход при вдыхании (концентрированном или в порошке). Может вызвать раздражение дыхательных путей. Подозревается в возникновении генетических дефектов. Может вызвать рак. Вызывает поражение органов (глаз, центральной нервной системы). Меры предосторожности – держитесь подальше от тепла, горячих поверхностей, искр, открытого пламени и других источников возгорания. Не курить. Носите защитные перчатки и защитную одежду. В случае разлива немедленно снимите всю одежду, которая была загрязнена. При контакте с кожей: промойте загрязненный участок водой. При вдыхании: выводите человека на свежий воздух и следите за дыханием, если это удобно. Немедленно позвоните в токсикологический центр / врача. Если в глазах: промыть глаза водой в течение нескольких минут. Если есть и возможно, снимите контактные линзы. Для контроля качества зафиксируйте оставшиеся доли (по крайней мере, одну) 50% метанолом (смешанным с деионизированной водой) в течение минимум 4 ч, раскачивая при комнатной температуре, с последующим 100% метанолом в ночное раскачивание при комнатной температуре. Собирайте отходы метанола в отдельный контейнер.ВНИМАНИЕ: Метанол вызывает острую токсичность при проглатывании, вдыхании или контакте с кожей. Метанол представляет собой легковоспламеняющуюся жидкость и пар. Носите защитные перчатки и одежду. Избегайте дыхания при обращении и держитесь подальше от огня и тепла. Тщательно вымойте кожу после использования. В случае разлива немедленно снимите всю загрязненную одежду. Смойте кожу водой. При вдыхании: Выведите человека на свежий воздух и поддерживайте комфорт для дыхания. При вдыхании, проглатывании или воздействии вызовите токсикологический центр / врача. В вентилируемой вытяжке готовят бензиловый спирт и бензилбензоат (БА: ВВ, 1:2) (5 -10 мл на долю) раствор. Поместите долю печени в полипропиленовую трубку объемом 15 или 50 мл (в зависимости от размера доли), содержащую раствор BABB. Оставьте его раскачиваться при комнатной температуре до прозрачности. Этот шаг может занять от 2 до 16 часов в зависимости от размера доли.ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор BABB растворяет некоторые виды пластика. Безопасно хранить образцы в полипропиленовых трубках или стеклянной таре.ВНИМАНИЕ: Бензилбензоат может вызвать острую токсичность при проглатывании. Он токсичен для водной флоры и фауны с длительными последствиями. Меры предосторожности: тщательно вымойте кожу после обработки. Он вреден при проглатывании, при контакте с кожей или вдыхании. Избегайте вдыхания дыма / паров. Тщательно вымойте руки после обработки. Не ешьте, не пейте и не курите при употреблении этого продукта. При проглатывании – вызовите токсикологический центр/врача при плохом самочувствии Используйте в проветриваемых помещениях. Соберите разливы. Утилизируйте содержимое/контейнер на утвержденном заводе по утилизации отходов. Проверьте качество инъекции. Только хорошо введенная печень должна быть сканирована микроКТ. 2. Микрокомпьютерная томография Пробоподготовка Приготовить 1% агарозный гель, смешав 100 мл дистиллированной воды и 1 г порошка агарозы. Поместите смесь в микроволновую печь и кипятите раствор до тех пор, пока порошок агарозы не растворится. Смягчите 1% агарозный гель до ~40 °C, чтобы избежать термического повреждения образца печени. Поместите интересующую долю (доли) в коническую трубку объемом 15 мл и заполните ее 1% агарозным гелем примерно до 2/3 от общего объема трубки. Этот шаг сводит к минимуму нежелательное движение образца во время измерения КТ. Измерение КТПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги зависят от устройства КТ, и конкретные настройки и действия могут отличаться для разных устройств и производителей КТ. В этом протоколе используемый микрокомпьютерный томограф был оснащен нанофокусной рентгеновской трубкой (180 кВ/15 Вт) и плоскопанельной динамической 41|100 (4048 px x 4048 px, размер пикселя 100 мм с биннингом 2) для измерений КТ. Установите коническую трубку объемом 15 мл с образцом на вращательную ступень устройства КТ и позвольте ему термически адаптироваться к измерительной камере в течение не менее 1 ч. Когда образец термически адаптирован, центрируйте его в поле зрения (FOV). Оптимизировать расстояния до источника-образца и образца-детектора (SSD, SDD) для достижения достаточного разрешения воксела, например, 12 мкм для образца печени взрослой мышей или 6,5 мкм для печени <P30, что соответствует размерам FOV (для заранее указанного оборудования) 24,3 мм × 24,3 мм и 13,2 мм × 13,2 мм соответственно. Установите параметры сбора (т.е. ускорение напряжения и тока, экспозиция, биннинг, усреднение) в соответствии с рекомендациями производителя КТ-устройства для достижения достаточного уровня обнаруженного сигнала. Эти параметры зависят не только от устройства КТ, но и от образца и должны быть оптимизированы для каждого образца. В Hankeova et al.9 настройки были следующими: ускоряющее напряжение 80 кВ, ускоряющий ток 160 мкА, время экспозиции 400 мс и 2000 изображений. Начните измерение КТ. Используйте специальное программное обеспечение для томографической реконструкции для реконструкции данных КТ. 3. Анализ и сегментация данных ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги зависят от программного обеспечения обработки изображений; конкретные настройки и действия могут отличаться в зависимости от используемого программного обеспечения. Загрузите данные КТ: выберите команду «Файл > импорт >». Дальнейший выбор зависит от конкретного формата обрабатываемых данных КТ. Используйте функцию Определение поверхности на верхней панели, чтобы сегментировать смолу в данных с помощью глобального порогового значения. В диалоговом окне определите пороговое значение с помощью оценки гистограммы, установив положение красной линии «Isovalue» для сегментирования только наполненных смолой сосудов (т.е. охватываемых желтой линией в представленной «Панели предварительного просмотра») (рисунок 3A). На левой панели выберите модуль Создать ROI из Volume/CAD/Mesh , чтобы создать интересующую область (ROI) емкостей, заполненных смолой. В диалоговом окне используйте опцию Создать окупаемость инвестиций из Solid, выберите имя обрабатываемого тома и подтвердите. Исключить ошибочную сегментацию шумовых кластеров в фоновой области данной окупаемости инвестиций. Отметьте эту рентабельность инвестиций на правой панели, щелкните по ней правой кнопкой мыши и выберите модуль Split ROI. В диалоговом окне задайте параметр Minimum Volume [voxel] для исключения всех шумовых частиц – это значение зависит от эксперимента и данных и должно быть оптимизировано для каждого анализируемого образца (рисунок 3B). Создавайте гладкие, непрерывные и твердые маски каналов без артефактов в окупаемости инвестиций, например, присутствия пузырьков воздуха или утечки смолы. На левой панели используйте модуль Сглаживание, установите для параметра Прочность сглаживания значение 1 или 2 (в зависимости от отдельных данных, когда более высокие значения могут привести к деформации модели, особенно при работе с тонкими структурами). При необходимости запустите этот процесс дважды (рисунок 3C). Определите и разделите отдельные трубчатые системы в сегментированной смоляной маске. Создайте отдельную рентабельность инвестиций для системы, заполненной более абсорбирующей смолой (желтая смола, используемая для инъекции общего желчного протока) с более высокими значениями интенсивности в данных КТ. Выполните процедуру, описанную в шаге 3.2. (Рисунок 3Di). Отметьте новую рентабельность инвестиций и рентабельность инвестиций в маску смолы, щелкните правой кнопкой мыши и выберите Вычесть ROI (S) и вычтите новую рентабельность инвестиций из ROI маски смолы, чтобы создать новую рентабельность инвестиций для оставшейся трубчатой системы (рисунок 3Dii, iii). Экспортируйте результирующие ROI для обеих трубных систем в различных форматах, на основе предпочтений оператора, для последующей обработки в различном программном обеспечении. Кроме того, обработайте результирующие ROI в программном обеспечении объемной графики для экспорта окончательной визуализации в виде изображения или видео.