JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

DUCT: Double Resin Casting seguito da Tomografia Micro-Computerizzata per Analisi 3D del Fegato

Published: September 28, 2021
doi:
10.3791/62941
, , , , , , ,
1Karolinska Institutet, 2Central European Institute of Technology

Summary

La tomografia micro-computerizzata a doppia colata di resina, o DUCT, consente la visualizzazione, la digitalizzazione e la segmentazione di due sistemi tubolari contemporaneamente per facilitare l’analisi 3D dell’architettura degli organi. DUCT combina l’iniezione ex vivo di due resine radiopace seguita dalla scansione tomografica micro-computerizzata e dalla segmentazione dei dati tomografici.

Abstract

Il fegato è il più grande organo interno negli esseri umani e nei topi e l’elevata autofluorescenza rappresenta una sfida significativa per valutare l’architettura tridimensionale (3D) dell’organo a livello dell’intero organo. L’architettura del fegato è caratterizzata da molteplici strutture ramificate lumenizzate, che possono essere riempite con resina, compresi gli alberi vascolari e biliari, stabilendo un modello altamente stereotipato nel parenchima altrimenti ricco di epatociti. Questo protocollo descrive la pipeline per l’esecuzione della tomografia micro-computerizzata a doppia colata di resina, o “DUCT”. DUCT comporta l’iniezione della vena porta e del dotto biliare comune con due diverse resine sintetiche radiopache, seguite dalla fissazione dei tessuti. Il controllo di qualità mediante la compensazione di un lobo, o dell’intero fegato, con un agente di compensazione ottica, consente la pre-screening di campioni opportunamente iniettati. Nella seconda parte della pipeline DUCT, un lobo o l’intero fegato possono essere utilizzati per la scansione della tomografia micro-computerizzata (microCT), la segmentazione (semi)automatizzata e il rendering 3D delle reti venose e biliari del portale. MicroCT produce dati di coordinate 3D per le due resine che consentono un’analisi qualitativa e quantitativa dei due sistemi e della loro relazione spaziale. DUCT può essere applicato al fegato di topo postnatale e adulto e può essere ulteriormente esteso ad altre reti tubolari, ad esempio reti vascolari e vie aeree nei polmoni.

Introduction

La fusione di resina per organo è una tecnica che risale al 17 ° secolo1. Uno dei primi esempi di fusione di resina moderna è stato eseguito sul fegato umano da un’autopsia. I dotti biliari intraepatici sono stati riempiti con un mezzo di contrasto mescolato con gelatina, seguito da imaging con una scansione TC a raggi X2. Lo scopo della tecnica DUCT è quello di visualizzare, digitalizzare e analizzare due reti tubolari in resina, in tandem, in 3D.

DUCT si basa sulla vasta conoscenza esistente della colata di resina epatica a sistema singolo3,4,5,6,7,8 e si estende alla visualizzazione e all’analisi 3D simultanee di due sistemi9. DUCT ha avanzato la fusione di resina singola a doppia resina mescolando due resine radiopache di diverso contrasto e iniettando queste resine in due reti diverse, in particolare il dotto biliare comune e la vena porta. DUCT può essere applicato a giovani topi postnatali con risultati riproducibili già dal giorno 15 postnatale (P15). Rispetto alle tecniche di imaging basate sulla microscopia, il vantaggio principale è che DUCT è più veloce, privo di anticorpi e l’autofluorescenza del tessuto epatico non interferisce con l’imaging. Inoltre, DUCT fornisce dati quantitativi che descrivono lo stato di lumenizzazione, il diametro interno, la connettività di rete e la perfusione. Distinguere tra la presenza di cellule che formano lumen e la loro morfogenesi de facto in tubi è essenziale per analizzare gli organi in cui sono presenti cellule duttali ma non formano tubi, come può essere il caso della sindrome di Alagille10. Il principale svantaggio di DUCT è la limitata penetrazione della resina, che è viscosa e non entra in tubi con un piccolo calibro (<5 μm). DUCT può essere applicato per qualsiasi struttura tubulare dopo aver determinato il punto di ingresso dell'iniezione, come i sistemi circolatori arteriosi e venosi, le vie aeree, il dotto biliare extraepatico o i vasi linfatici. Potrebbe quindi facilitare l'analisi dell'architettura dell'intero organo di altri tessuti come polmoni e pancreas.

Le immagini segmentate MicroCT possono essere elaborate utilizzando software di imaging disponibili in commercio, come ImageJ, o pipeline scritte su misura (ad esempio, MATLAB). Il fegato iniettato con resina può essere analizzato qualitativamente per l’espansione e la connettività della rete o quantitativamente per volume, lunghezza, ramificazione, tortuosità di un singolo sistema e l’interazione tra due sistemi come la distanza tra due sistemi o la dipendenza dal punto di diramazione (il sistema 1 si dirama in prossimità della ramificazione del sistema 2?). La pipeline DUCT che comprende l’iniezione di resina, la scansione microCT e la segmentazione dei dati CT, combinata con un’analisi quantitativa dettagliata dei meccanismi architettonici di due sistemi tubolari, potrebbe fornire uno standard per l’analisi del fegato intero in modelli animali.

Protocol

Il protocollo descritto in questo studio è stato approvato e segue le norme e i regolamenti sul benessere degli animali dello Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd (comitato etico per la ricerca sugli animali di Stoccolma). Gli animali utilizzati in questo studio erano topi mutanti Jag1H268Q di tipo selvatico o omozigote su uno sfondo misto C3H / N e C57bl6J. Sia i maschi che le femmine sono stati inclusi nello studio. Gli animali sono stati utilizzati al giorno 15 postnatale o come adulti tra 3 e 8 mesi. 1. Doppie iniezioni di resina PreparazionePreparare la soluzione di resina. Per le iniezioni di resina a doppio sistema, preparare sia resine gialle che verdi come descritto nei passaggi 1.1.2-1.1.4. Preparare 1 mL di aliquote di resina diluita per topo. Resina gialla: gomma siliconica gialla diluita (alta radiopacità) con il diluente trasparente in una diluizione 3:1 per preparare la resina gialla per l’iniezione. Resina verde: mescolare la gomma siliconica blu (radiopacità non rilevabile) con il diluente trasparente in una diluizione 1: 1 per preparare la resina blu. Per generare resina verde, mescolare la resina blu diluita con la resina gialla diluita in un rapporto di 1:1. Vortice la resina verde accuratamente fino a quando il colore è omogeneo.NOTA: La resina blu ha una radiopacità molto bassa che non è rilevabile con il microCT, che quindi richiede la diluizione con resina gialla per creare due resine con radiopacità diverse.ATTENZIONE: La resina può contenere cromato di piombo, che è cancerogeno. Produce gas velenosi in un incendio. Maneggiare con cura e smaltire la resina come rifiuto pericoloso. Preparare due set di iniezione (set di iniezione #1 e set di iniezione #2) con tubi come descritto nei passaggi 1.1.6-1.1.11.NOTA: Per i topi adulti (>P30 (giorno 30 postnatale) = P30 – 2 anni), utilizzare il set di iniezione #1 (tubo PE10 con diametro esterno di 0,6 mm) per l’iniezione e l’iniezione del dotto biliare comune #2 (tubo PE50 con diametro esterno di 0,96 mm) per l’iniezione della vena porta. Per i topi postnatali giovani (fino a P30), preparare due set di iniezione #1, uno per il dotto biliare e uno per l’iniezione della vena porta (nessun set di iniezione #2 poiché la vena porta è troppo stretta per ospitare tubi PE50). Per preparare il set di iniezione #1, tagliare 30 cm di tubo in PE10 e allungare un’estremità del tubo a mano tirandolo fino a quando non diventa il più sottile possibile (Figura 1A, B, diametro di circa 0,15 mm, tubo in PE10 non allungato ha un diametro di 0,6 mm). Tagliare diagonalmente la punta del tubo PE10 allungato per creare una punta smussata (Figura 1B). Collegare l’estremità non tesa del tubo PE10 a un ago da 30 G (Figura 1A, set di iniezione #1). Per preparare il set di iniezione #2, tagliare 30 cm di tubo in PE50 e allungare a mano un’estremità del tubo tirandolo fino a quando non diventa abbastanza sottile da adattarsi alla vena porta (Figura 1A, B, circa 0,7 mm, il tubo PE50 non allungato ha un diametro di 0,96 mm). Tagliare diagonalmente la punta del tubo PE50 allungato per creare una punta smussata (Figura 1B). Collegare l’estremità non allungata del tubo PE50 a un ago da 23 G (Figura 1A, set di iniezione #2).NOTA: Ogni set di iniezione può essere utilizzato solo per un’iniezione poiché la resina si indurisce nella siringa e nel tubo. Regolare la dimensione della punta allungata e smussata in base alle dimensioni del dotto biliare comune e della vena porta del topo, a seconda dell’età, del genotipo e del fenotipo. Quando non si è sicuri delle dimensioni e dell’adattamento del tubo, inserire il tubo nel condotto o nel recipiente appropriato dopo l’incisione e prima che il tubo sia riempito di resina. Se il tubo è troppo largo per adattarsi al condotto / vaso, allungarlo ulteriormente. Anestetizzare l’animale per inalazione di isoflurano (prima il 4% nella camera di induzione e ~ 2% usando il cono del naso). Posizionare il mouse su una panca ventilata su un pad di dissezione mentre il mouse respira isoflurano attraverso il cono del naso. Verificare che l’animale sia incosciente con un metodo raccomandato dall’istituto / IRB, ad esempio pizzicando una delle zampe.ATTENZIONE: L’isoflurano può causare sonnolenza o capogiri dopo l’inalazione e può causare danni al sistema cardiovascolare e al sistema nervoso centrale in caso di esposizione prolungata o ripetuta. Non inalarlo. Maneggiare la sostanza su un banco ventilato e in aree ben ventilate.NOTA: È possibile utilizzare un altro metodo di anestesia, purché sia compatibile con la perfusione cardiaca. Una volta che l’animale è incosciente, spruzzare il lato ventrale con etanolo al 70% per evitare interferenze dalla pelliccia. Usando le forbici per la pelle, tagliare la pelle, la fascia e lo strato muscolare a partire dalla linea mediana della cavità addominale e tagliare fino alla cavità toracica per esporre gli organi interni. Afferrare il processo xifoide con una pinza per sollevare lo sterno e tagliare il diaframma e la gabbia toracica su entrambi i lati per esporre il cuore e i polmoni. Rimuovere la gabbia toracica tagliando le costole sui lati sinistro e destro della gabbia toracica con le forbici. Prestare particolare attenzione a non danneggiare il fegato in quanto ciò comporterà perdite di resina. Usando una pinza dritta, tirare il cuore verso il fegato e tagliare via l’atrio destro. Inserire un ago a farfalla (23 G), collegato a una pompa di perfusione peristaltica, nel ventricolo sinistro. Perfondere il topo transcardialmente con la soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) e l’eparina (1 U/g di peso corporeo del topo). Perfusare per 3 min con una velocità di perfusione di 5 ml/min.NOTA: Se il topo viene perfuso correttamente, gli organi interni diventeranno pallidi, in particolare il fegato. Se, invece, i polmoni stanno diventando bianchi, l’ago viene inserito nel ventricolo destro e deve essere riposizionato. Dopo la perfusione, il topo viene dissanguato e può essere rimosso dal cono del naso e dall’isoflurano. Spegnere la pompa isoflurano. Iniezione di resina – Fusione di resina per sistema biliareSposta il mouse al microscopio di dissezione, l’addome verso l’alto, la coda verso lo sperimentatore e allontanati dallo sperimentatore. I punti di riferimento anatomici di interesse sono raffigurati nella Figura 2A. Individuare la vena cava inferiore (Figura 2A) spostando l’intestino di lato. Utilizzare le forbici a molla per effettuare una piccola incisione trasversale nella vena cava inferiore per consentire il rilascio della pressione vascolare epatica (Figura 2Bi). Esporre il dotto biliare comune e la vena porta come descritto nei passaggi 1.2.4- 1.2.6. Spostare l’intestino e il pancreas sul lato destro (dello sperimentatore) usando un batuffolo di cotone bagnato con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Capovolgere il lato ventrale del fegato verso il cuore usando il batuffolo di cotone bagnato PBS per esporre la superficie viscerale e la regione ilare. Individuare il dotto biliare comune che corre dalla regione ilare attraverso il pancreas e nell’intestino nello sfintere di Oddi (Figura 2Bii, dotto biliare comune delineato con la linea tratteggiata gialla, punte di freccia nere puntano allo sfintere di Oddi).NOTA: Assicurarsi che il fegato sia umido durante tutta la procedura cospargendolo con PBS. Pulire il tessuto circostante (area ~ 5 mm) dal dotto biliare comune usando una pinza diritta. Posizionare il filo di sutura di seta (dimensioni 4-0, 0,17 mm, lungo 3 – 5 cm) sotto il dotto biliare comune (Figura 2Bii) e legare un nodo sciolto attorno al dotto biliare comune (Figura 2Biii).NOTA: Scegliere un’area per il nodo a metà strada tra la regione ilare e lo sfintere di Oddi e ad una certa distanza dalla vena porta in modo che dopo che la sutura è stata serrata attorno al dotto biliare comune, non interferirà con l’iniezione della vena porta. Tenere le forbici a molla piatte contro il dotto biliare comune per fare un’incisione obliqua al dotto biliare comune nel punto in cui il dotto biliare comune entra nel pancreas e nell’intestino accanto allo sfintere di Oddi. (Figura 2Biv), la linea tratteggiata gialla delinea lo sfintere della regione di Oddi, enfatizzata da punte di freccia nere).NOTA: Questo è un passaggio cruciale. Fai un taglio obliquo e non trasversale e fai un’incisione; non recidere il dotto biliare. Il taglio attraverso l’intero dotto biliare rende l’inserimento del tubo molto impegnativo. Poco prima dell’uso, mescolare 1 mL di resina gialla con 50 μL dell’agente polimerizzante (riempiendo e svuotando la siringa da 1 mL) e riempire una siringa Luer da 1 mL con la miscela resina-agente polimerizzante. Collegare la siringa riempita con il tubo (set #1). Premere lo stantuffo per riempire completamente il tubo. Assicurarsi che la miscela resina/agente polimerizzante goccioli dalla punta del tubo.NOTA: Evitare e rimuovere le bolle nella siringa e nel tubo per ottenere i migliori risultati. Usando la pinza, raddrizzare l’area intorno all’incisione del dotto biliare comune e inserire il tubo nell’apertura nel dotto biliare comune (Figura 2Bv), con il bordo più lungo della punta smussata verso il basso verso il lato dorsale del dotto biliare. Questo orientamento assicura che la resina possa uscire dall’apertura del tubo, che è rivolta verso l’alto, nel condotto (Figura 2Bv). Stringere il nodo del filo di seta per fissare il tubo all’interno del dotto biliare comune (Figura 2Bvi). Iniettare la resina nel dotto biliare comune. Osservare la cistifellea e i singoli lobi del fegato. Massaggiare il fegato con un batuffolo di cotone bagnato pbS per aiutare a diffondere la resina allo stesso modo. I rami terminali dei dotti biliari pieni di resina (nei topi selvatici) sono debolmente visibili sulla superficie del fegato.NOTA: Il tempo previsto per riempire il fegato è di 30 -100 s. Interrompere l’iniezione della resina quando i punti di resina appaiono sulla superficie del fegato (Figura 2Ci, punte di freccia blu) o quando si incontra resistenza.NOTA: Lavorare il più velocemente possibile poiché la resina inizia a indurirsi dopo aver aggiunto l’agente polimerizzante della resina. Il tempo di lavoro dall’aggiunta dell’agente di polimerizzazione è di circa 15 minuti. Rimuovere il tubo estraendolo dal dotto biliare comune e stringere rapidamente il nodo di seta usando una pinza per evitare che la resina fuoriesca. Tagliare via le estremità sciolte della sutura di seta, in modo che non interferiscano con l’iniezione della vena porta. Smaltire il tubo contenente resina e la resina rimanente nei rifiuti pericolosi e l’ago nei rifiuti taglienti. Iniezione di resina – Colata di resina per vene portanti Eliminare la vena porta (area ~ 5 mm) dal tessuto circostante a circa 2 cm dal suo ingresso al fegato usando una pinza diritta. Posizionare il filo di sutura di seta (dimensioni 4-0, 0,17 mm, lungo 3 – 5 cm) sotto l’area liberata della vena porta (Figura 2Ci) e legare un nodo sciolto (Figura 2Cii). Fare un’incisione longitudinale nella vena porta distale al fegato e al nodo (Figura 2Ciii). Mescolare 1 mL di resina verde con 50 μL dell’agente polimerizzante (riempiendo e svuotando una siringa da 1 mL) e riempire la siringa Luer da 1 mL con la miscela di agenti di resina-agente polimerizzante. Collegare la siringa riempita con il tubo (set #2 per mouse >P30, nuovo set #1 per mouse <P30). Premere lo stantuffo per riempire completamente il tubo. Assicurarsi che la resina goccioli dalla punta del tubo.NOTA: Evitare e rimuovere le bolle nella siringa e nel tubo per ottenere i migliori risultati. Usando la pinza, raddrizzare la vena porta tirando il tessuto circostante verso lo sperimentatore e inserire il tubo con il bordo più lungo della punta smussata verso il lato dorsale del vaso (Figura 2Ciii). Stringere il filo di seta per fissare il tubo nella vena porta. Iniettare la resina nella vena porta. Osservare i vasi sanguigni che si riempiono di resina. Massaggiare il fegato con un batuffolo di cotone bagnato pbS per aiutare a diffondere equamente la resina (Figura 2Civ). Interrompere l’iniezione della resina quando tutti i vasi sanguigni sono pieni (le estremità delle vene porta sono visibili alla periferia del fegato) o quando si incontra resistenza.NOTA: Lavorare velocemente poiché la resina inizia a indurirsi dopo l’aggiunta dell’agente polimerizzante. Il tempo di lavoro dovuto all’aggiunta dell’agente polimerizzante è di circa 15 minuti per il set di iniezione # 1 e 25 minuti per il set di iniezione # 2. Rimuovere il tubo estraendo il tubo dalla vena porta e stringere rapidamente il nodo di seta usando una pinza per evitare che la resina fuoriesca. Smaltire il tubo contenente resina e la resina rimanente nei rifiuti pericolosi e l’ago nei rifiuti taglienti. Dissezione e fissazione del fegatoSezionare l’intero fegato tagliandolo via dal tessuto circostante e dal diaframma. Posizionare delicatamente l’intero fegato in un tubo conico vuoto da 50 ml con il lato ventrale rivolto verso l’alto e il lato dorsale appoggiato sulla parete del tubo conico per prevenire la deformazione del fegato. Conservare il tubo conico orizzontalmente durante la notte a 4 °C affinché la resina si indurisca completamente.NOTA: Qualsiasi contenitore abbastanza grande da adattarsi al fegato può essere utilizzato al posto del tubo conico da 50 ml. L’uso di un contenitore a fondo piatto aumenterà la probabilità che il fegato non sia deformato. Separare il fegato in singoli lobi. Effettuare una selezione dei lobi che verranno utilizzati per l’analisi microCT (1.4.4-1.4.5) o il controllo di qualità (1.4.6-1.4.8). Facoltativamente utilizzare l’intero fegato sia per la compensazione ottica che per la microCT senza separarlo in singoli lobi.NOTA: L’architettura epatica dei sistemi biliare e vascolare è diversa in ciascun lobo e sono quindi necessarie analisi dei lobi abbinate. La compensazione ottica non interferisce con la scansione microCT e i lobi utilizzati per il controllo qualità possono essere successivamente scansionati con microCT. Al contrario, i campioni scansionati con microCT possono essere successivamente cancellati otticamente per il confronto. L’intera analisi del fegato è quindi possibile. Nei topi wild-type (background genetico C3H/C57bl6), il lobo mediale destro viene riempito prima mediante iniezioni di resina, rendendolo un lobo adatto per l’analisi microCT, con la massima riproducibilità. Il lobo laterale sinistro è il lobo più grande, in cui è quindi semplice pre-schermare per la qualità dell’iniezione. La selezione del lobo (o fegato intero) utilizzato per il controllo di qualità e la scansione microCT dipende dal modello animale e dalla domanda di ricerca. In una cappa ventilata, preparare una soluzione di formaldeide al 4% (10 -20 ml per tubo). Fissare i lobi utilizzati per la microCT con il 4% di formaldeide durante la notte a 4 °C e successivamente lavare una volta con PBS (10 -20 ml per tubo). Raccogliere i rifiuti di formaldeide in un contenitore separato. Mantenere i lobi epatici in PBS a 4 °C per la conservazione a breve termine o al 70% di etanolo per la conservazione a lungo termine. Procedere con la sezione 2: Tomografia micro-computerizzata.ATTENZIONE: La formaldeide provoca tossicità acuta se ingerita, inalata o a contatto con la pelle. La formaldeide è un liquido infiammabile e vapore. Provoca gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Può causare una reazione allergica cutanea. Fatale se inalato (concentrato o in polvere). Può causare irritazione respiratoria. Sospettato di causare difetti genetici. Può causare il cancro. Provoca danni agli organi (occhi, sistema nervoso centrale). Consigli di prudenza: tenere lontano da calore, superfici calde, scintille, fiamme libere e altre fonti di accensione. Vietato fumare. Indossare guanti protettivi e indumenti protettivi. In caso di fuoriuscita, togliere immediatamente tutti gli indumenti contaminati. Se a contatto con la pelle: sciacquare la zona contaminata con acqua. Se inalato: rimuovere la persona all’aria aperta e monitorare la respirazione se confortevole. Chiama immediatamente un centro antiveleni / medico. Se negli occhi: sciacquare gli occhi con acqua per diversi minuti. Se presente e possibile, rimuovere le lenti a contatto. Per il controllo di qualità, fissare i lobi rimanenti (almeno uno) con metanolo al 50% (miscelato con acqua deionizzata) per un minimo di 4 ore, oscillando a temperatura ambiente, seguito da metanolo al 100% durante la notte oscillando a temperatura ambiente. Raccogliere i rifiuti di metanolo in un contenitore separato.ATTENZIONE: Il metanolo provoca tossicità acuta se ingerito, inalato o a contatto con la pelle. Il metanolo è un liquido e un vapore infiammabili. Indossare guanti e indumenti protettivi. Evitare di respirare durante la manipolazione e tenere lontano da fuoco e calore. Lavare accuratamente la pelle dopo l’uso. In caso di fuoriuscita, togliere immediatamente tutti gli indumenti contaminati. Risciacquare la pelle con acqua. Se inalato: rimuovere la persona all’aria aperta e mantenere confortevole per la respirazione. Se inalato, ingerito o esposto, chiamare un centro antiveleni / medico. In una cappa ventilata, preparare l’alcool benzilico e il benzil benzoato (BA: BB, 1:2) (5 -10 ml per lobo) soluzione. Posizionare il lobo epatico in un tubo di polipropilene da 15 o 50 ml (a seconda delle dimensioni del lobo) contenente la soluzione di BABB. Lasciarlo dondolare a temperatura ambiente fino a quando non è trasparente. Questo passaggio può richiedere tra 2-16 ore a seconda delle dimensioni del lobo.NOTA: La soluzione BABB scioglie alcuni tipi di plastica. È sicuro conservare i campioni in tubi di polipropilene o contenitori di vetro.ATTENZIONE: Il benzil benzoato può causare tossicità acuta quando ingerito. È tossico per la vita acquatica con effetti di lunga durata. Consigli di prudenza: lavare accuratamente la pelle dopo la manipolazione. È dannoso se ingerito, a contatto con la pelle o inalato. Evitare di respirare fumi/vapori. Lavarsi accuratamente le mani dopo la manipolazione. Non mangiare, bere o fumare quando si utilizza questo prodotto. Se ingerito – chiamare un centro antiveleni / medico se malato Uso in aree ventilate. Raccogli le fuoriuscite. Smaltire il contenuto/contenitore in un impianto di smaltimento dei rifiuti riconosciuto. Ispezionare la qualità dell’iniezione. Solo il fegato ben iniettato deve essere scansionato con microCT. 2. Tomografia micro-computerizzata Preparazione del campione Preparare il gel di agarosio all’1% mescolando 100 ml di acqua distillata e 1 g di polvere di agarosio. Mettere la miscela in un forno a microonde e far bollire la soluzione fino a quando la polvere di agarosio si dissolve. Temperare il gel di agarosio all’1% a ~ 40 ° C per evitare danni termici al campione di fegato. Posizionare il lobo o i lobi di interesse in un tubo conico da 15 ml e riempirlo con il gel di agarosio all’1% a circa 2/3 del volume totale del tubo. Questo passaggio riduce al minimo il movimento indesiderato del campione durante la misurazione TC. Misurazione TCNOTA: i seguenti passaggi dipendono dal dispositivo CT e le impostazioni e le azioni specifiche possono differire per i diversi dispositivi CT e produttori. In questo protocollo, lo scanner di tomografia micro-computerizzata utilizzato era dotato di un tubo a raggi X nanofocus (180 kV / 15 W) e di un dinamico a schermo piatto 41|100 (4048 px x 4048 px, dimensione dei pixel 100 mm con binning 2) per le misurazioni CT. Montare il tubo conico da 15 ml con il campione sullo stadio di rotazione di un dispositivo CT e consentirgli di adattarsi termicamente alla camera di misura per almeno 1 ora. Quando il campione è adattato termicamente, centrarlo nel campo visivo (FOV). Ottimizzare le distanze sorgente-campione e del rilevatore di campioni (SSD, SDD) per raggiungere una risoluzione voxel sufficiente, ad esempio 12 μm per un campione di fegato murino adulto o 6,5 μm per il fegato <P30, corrispondenti alle dimensioni di FOV (per hardware specificato in precedenza) rispettivamente 24,3 mm × 24,3 mm e 13,2 mm × 13,2 mm. Impostare i parametri di acquisizione (ad esempio, accelerazione di tensione e corrente, esposizione, binning, media) seguendo le raccomandazioni del produttore del dispositivo CT per raggiungere un livello sufficiente di segnale rilevato. Questi parametri non sono solo dipendenti dal dispositivo CT, ma anche dal campione e dovrebbero essere ottimizzati per ciascun campione. In Hankeova et al.9, le impostazioni erano: tensione di accelerazione di 80 kV, corrente di accelerazione di 160 μA, tempo di esposizione di 400 ms e 2000 immagini. Avviare una misurazione TC. Utilizzare un software di ricostruzione tomografica dedicato per ricostruire i dati CT. 3. Analisi e segmentazione dei dati NOTA: i seguenti passaggi dipendono dal software di elaborazione delle immagini; impostazioni e azioni specifiche possono variare a seconda del software utilizzato. Carica i dati CT: seleziona File > Comando Importa >. Un’ulteriore selezione dipende dal formato specifico dei dati CT da elaborare. Utilizzare la funzione Determinazione superficie sul pannello superiore per segmentare la resina nei dati utilizzando la soglia globale. Nella finestra di dialogo, determinare il valore di soglia con la valutazione dell’istogramma impostando la posizione della linea rossa “Isovalore” per segmentare solo i vasi riempiti di resina (cioè racchiusi dalla linea gialla nel “Pannello anteprima” presentato) (Figura 3A). Nel pannello di sinistra, selezionare il modulo Crea ROI da Volume/CAD/Mesh per creare una regione di interesse (ROI) dei recipienti riempiti di resina. Nella finestra di dialogo, utilizzare l’opzione Crea ROI da Solido, selezionare il nome del volume elaborato e confermare. Elimina la segmentazione errata dei cluster di rumore nell’area di sfondo di questo ROI. Contrassegna questo ROI sul pannello di destra, fai clic con il pulsante destro del mouse su di esso e seleziona il modulo Split ROI. Nella finestra di dialogo, impostare il parametro Volume minimo [voxel] per escludere tutte le particelle di rumore – questo valore dipende dall’esperimento – e dai dati e deve essere ottimizzato per ogni campione da analizzare (Figura 3B). Crea maschere di canale lisce, continue e solide senza artefatti nel ROI della resina, ad esempio presenza di bolle d’aria o perdite di resina. Nel pannello di sinistra, utilizzate il modulo Smoothing, impostate il parametro Smoothing Strength su 1 o 2 (a seconda dei singoli dati, quando valori più alti potrebbero portare alla deformazione del modello, specialmente quando si tratta di strutture fini). Se necessario, eseguire questo processo due volte (Figura 3C). Identificare e separare i singoli sistemi tubolari nella maschera in resina segmentata. Creare un ROI separato per il sistema riempito con la resina più assorbente (la resina gialla utilizzata per l’iniezione del dotto biliare comune) con valori di intensità più elevati nei dati CT. Seguire la procedura descritta nel passaggio 3.2. (Figura 3Di). Contrassegnare il nuovo ROI e il ROI della maschera in resina, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Sottrai ROI(S) e sottrarre il nuovo ROI dal ROI della maschera in resina per creare un nuovo ROI per il sistema tubolare rimanente (Figura 3Dii, iii). Esportare i ROI risultanti per entrambi i sistemi tubolari in vari formati, in base alle preferenze dell’operatore, per la successiva elaborazione in diversi software. Inoltre, elaborare i ROI risultanti in un software di grafica di volume per esportare la visualizzazione finale sotto forma di immagine o video.

Representative Results

Cosa fareLa doppia iniezione di resina di successo si ottiene quando sia i dotti biliari intraepatici che la vascolarizzazione della vena porta sono ben riempiti. Come fase di controllo qualità, la cancellazione di un lobo (ad esempio, il lobo laterale sinistro) consente la verifica di un’iniezione riuscita, seguita dall’imaging dei lobi di interesse. Il lobo otticamente cancellato può essere scansionato in seguito utilizzando microCT; quindi è possibile cancellare otticamente l’intero fegato. Nel fegato di topo ben iniettato, la vascolarizzazione della vena porta deve essere riempita con resina fino a quando la periferia epatica e la resina devono essere visibili nei rami laterali (Figura 4), e questa architettura è fedelmente ricapitolata nei dati scansionati e segmentati microCT. Inoltre, i dotti biliari intraepatici ben iniettati dovrebbero essere visibili accanto ai principali rami della vena porta che si estendono quasi fino alla periferia e la resina dovrebbe essere visibile nei principali rami laterali. Se il lobo di controllo supera la fase di controllo qualità, i lobi di interesse (incluso quello otticamente cancellato) possono essere scansionati con microCT. Il risultato dei dati segmentati da un fegato ben iniettato è mostrato per un topo P15 (Figura 4A,B) e un topo adulto (Figura 4C,D). Cosa non fareIl tessuto epatico intatto è un prerequisito per un’iniezione di successo. Prestare particolare attenzione quando si taglia la cavità addominale e il diaframma per non graffiare accidentalmente il tessuto epatico. Se c’è un danno fisico al fegato durante questa procedura, è molto probabile che la resina fuoriesca durante l’iniezione della vena porta (Figura 5A). Non è possibile ottenere una buona iniezione del sistema vascolare se il fegato è fisicamente danneggiato. Uno degli errori più comuni è il riempimento del fegato con resina che può portare a sfide per la visualizzazione o l’analisi. Una delle cause del riempimento insufficiente del sistema è l’indurimento prematuro della resina nell’ago o nella punta del tubo prima che l’iniezione sia completata (Figura 5B, punte di freccia blu, staffe raffigurano bolle di grandi dimensioni). Una buona pratica è quella di utilizzare un set di iniezione per animale e lavorare velocemente dopo che l’agente polimerizzante è stato aggiunto alla resina. Se la resina si indurisce durante l’iniezione (che può essere osservata da un sistema semi-riempito, qui esemplificato con una vascolarizzazione della vena porta semi-riempita) rimuovere il tubo, tagliare la punta del tubo (sempre in diagonale per creare una punta smussata) e spingere lo stantuffo. Se la resina inizia a gocciolare di nuovo, reinserire con cura il tubo e fissarlo con la sutura. Se la resina si è indurita nell’ago, sostituire completamente il tubo, riempirlo di resina (evitando bolle), reinserire con cura il tubo e fissarlo con la sutura. Può essere difficile sostituire il tubo, specialmente nei giovani topi postnatali < P30, poiché il tessuto è più fragile. Un'altra causa di scarso riempimento di resina della vascolarizzazione della vena porta può essere insufficiente perfusione transcardica (Figura 5C, punte di freccia blu denotano sangue visibile nei rami terminali). Questo può essere osservato quando le punte dei vasi sono piene di sangue invece di resina. Per evitare questo, assicurarsi che la vena porta (al di fuori del fegato) non contenga sangue prima dell’iniezione. La terza causa di fegato sottoriempito è quando il tubo viene inserito troppo in profondità nel fegato ed entra in un ramo verso uno dei lobi. Per evitare ciò, inserire il tubo ad un minimo di 0,5 cm dall’ingresso al fegato. Al contrario, uno o entrambi i sistemi si riempiono di resina (Figura 5D). È necessario monitorare visivamente il fegato durante l’iniezione. La fusione del sistema biliare con resina è più impegnativa della colata di resina della vena porta poiché i condotti riempiti di resina sono solo debolmente visibili sulla superficie del fegato ed è difficile valutare quando il sistema è quasi pieno e quando fermarsi. Quando piccoli punti di resina gialla appaiono sulla superficie del fegato (Figura 2Ci, punta di freccia blu), questo è un segno che il sistema biliare è completamente riempito e la resina sta iniziando a fuoriuscire dai dotti. Le perdite di resina minori possono essere corrette manualmente durante la segmentazione dei dati microCT (Figura 5D, pannelli di destra). Se la pressione di iniezione è troppo alta, ciò può causare la rottura di vasi o condotti (Figura 5E), danneggiando irreversibilmente l’architettura del recipiente o del condotto. Il fegato non sarà adatto per la scansione o l’analisi microCT. Per evitare il riempimento eccessivo della resina, ottimizzare il giusto volume e la giusta pressione utilizzati per l’iniezione in ogni modello di mouse. Quando si lavora con topi che sono stati sfidati con una dieta tossica, modificazione genetica o danno epatico che colpisce il sistema biliare o venoso, o rigidità epatica, la pressione e il volume dell’iniezione potrebbero dover essere regolati in quanto il volume e la pressione tollerati possono essere diversi dai topi selvatici. Questo protocollo descrive l’iniezione manuale dei due sistemi, ma è possibile collegare la siringa ad una pompa per standardizzare la pressione di iniezione. Le bolle sono un altro artefatto di iniezione molto comune che porta al riempimento sparso delle reti tubolari (Figura 5F-H, punte di freccia blu). Per evitare la formazione di bolle, assicurarsi che la siringa e il tubo non contengano bolle, siano completamente riempiti di resina e che la resina goccioli dalla punta del tubo prima dell’iniezione. Piccole bolle che appaiono come aree negative sui dati microCT possono essere corrette manualmente durante le fasi di post-elaborazione, sebbene ciò sia laborioso. Fresco è il miglioreL’utilizzo di resina gialla fresca è un fattore cruciale, che influisce in modo significativo sul contrasto delle due resine e sulla segmentazione dei dati microCT. Quando si utilizza la resina appena aperta (Figura 6A) c’è una chiara differenza di contrasto tra i dotti biliari iniettati con resina gialla (bianco brillante) e le vene porta iniettate di resina verde (grigio brillante). Il fegato iniettato con resina fresca viene facilmente lavorato utilizzando la soglia globale automatizzata. Con lo stoccaggio prolungato, la resina precipita e il contrasto diminuisce. Dopo 3 mesi di conservazione, il contrasto può ancora essere sufficiente per distinguere la vena porta dal dotto biliare (Figura 6B), ma la precipitazione influisce sulla miscelazione delle due resine, che è visibile come un’opacità eterogenea nella vena porta riempita (Fig 6B, punte di freccia blu). Il contrasto eterogeneo influisce negativamente sulla soglia automatizzata e richiede correzioni manuali, il che aumenta il tempo di elaborazione. Se la resina è più vecchia di sei mesi, il contrasto si è degradato a un punto in cui non è possibile distinguere il dotto biliare iniettato di giallo dalla vena porta iniettata di verde in base al loro solo contrasto (Figura 6C). In questo caso, il dotto biliare e la vena porta devono essere segmentati manualmente in base al loro diametro e posizione nella regione ilare e seguiti manualmente per tutti i dati microCT. Questa procedura è estremamente dispendiosa in termini di tempo e meglio evitare. Figura 1: Set di iniezione per la fusione della resina. (A) Il set di iniezione #1 comprende un ago da 30 G e un tubo in PE10 lungo circa 30 cm. Il set di iniezione #2 è composto da un ago da 23 G e un tubo in PE50 lungo ~ 30 cm. (B) La punta del tubo viene allungata e tagliata ad angolo per creare una punta smussata. Il righello in A e B è un righello centimetrico, con incrementi maggiori di 1 cm, incrementi intermedi di 5 mm e incrementi minori di 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Diagramma di flusso per colata di resina doppia. (A) Schema che mostra il sistema circolatorio venoso murino e il cuore con l’atrio destro evidenziato, che deve essere tagliato prima della perfusione, e il ventricolo sinistro in cui deve essere inserito l’ago per la perfusione per lavare via il sangue dal sistema circolatorio. La vena cava inferiore deve essere recisa sotto i reni per alleviare la pressione vascolare. (B) Diagramma di flusso di iniezione della resina del dotto biliare. (i) Zoom dell’immagine di (A) raffigurante dove separare l’IVC. (ii) Immagine raffigurante il dotto biliare comune (linea tratteggiata gialla) dalla regione ilare del fegato allo sfintere di Oddi (punte di freccia nere), con filo di sutura sotto il dotto biliare comune cancellato. (iii) Posizione adatta per il nodo overhand sciolto attorno al dotto biliare comune. (iv) La linea tratteggiata gialla e le punte di freccia nere etichettano lo sfintere di Oddi, dimostrando l’angolo obliquo per l’incisione e come l’apertura dovrebbe apparire dopo l’incisione ad angolo obliquo. (v) Schema che dimostri l’orientamento dell’apertura smussata del tubo PE10 (verso l’alto) al momento dell’inserimento. vi) Aspetto dell’iniezione di resina gialla; la resina dovrebbe facilmente passare il nodo legato liberamente. IVC, vena cava inferiore; CBD, dotto biliare comune. (C) Diagramma di flusso di iniezione della resina della vena porta. (i) La linea tratteggiata verde segna la vena porta dalla regione ilare. Le punte di freccia blu etichettano il sistema biliare sovraffollato. (ii) Posizione adatta per il nodo overhand sciolto intorno alla vena porta. (iii) Schema che dimostri l’apertura smussata (verso l’alto) al momento dell’inserimento. iv) Aspetto del fegato dopo l’iniezione di resina verde e resina gialla; notare il vaso sanguigno pieno di resina nella periferia del fegato. PV, vena porta. La Figura 2A è stata creata con Biorender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Elaborazione dei dati Micro CT nel software di grafica di volume. (A) Determinazione della superficie, (i) isovalore sovrastimato (l’anteprima corrente della selezione è mostrata in colore giallo), (ii) isovalore sottovalutato, (iii) selezione ottimale dell’isovalo per una corretta determinazione superficiale della vena porta e dei dotti biliari. (B) Dividere la regione di interesse (ROI) creata dalla determinazione della superficie, (i) impostare il valore nella finestra di dialogo abbastanza in alto da rimanere solo un segmento (il più grande), (ii) nei fotogrammi gialli vengono mostrate le particelle più piccole (escluse). (C) Levigatura superficiale dei dati, (i) la funzione di levigatura è sul pannello di sinistra, (ii) impostare la forza di levigatura su 1 (max. 2) e creare un nuovo ROI levigato, (iii) dati levigati. (D) Separazione dei singoli sistemi tubolari, (i) nella funzione di determinazione della superficie impostare l’isovalore in modo che solo il sistema biliare sia incluso nella selezione (l’anteprima corrente della selezione è mostrata in colore giallo), (ii) contrassegnare il ROI di entrambi i sistemi e il ROI del solo sistema biliare e sottrarre il ROI del sistema biliare dal ROI di entrambi i sistemi, (iii) Vena porta mostrata in grigio, il sistema biliare mostrato in verde. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Sistemi di dotto biliare ben iniettato (BD) e vena porta (PV). (A) Lobo mediale destro (RML) otticamente eliminato del fegato postnatale del giorno 15 (P15) iniettato con due resine nei due sistemi. Scala barra 1 mm. (B) Rendering 3D di P15 RML mostrato in (A) raffigurante la vascolarizzazione della vena porta in bianco e il sistema biliare in verde. Scala barra 1 mm. (C) RML otticamente cancellato del fegato adulto iniettato con due resine nei due sistemi. Scala barra 1 mm. (D) Rendering 3D di RML adulto mostrato in (C) raffigurante la vascolarizzazione della vena porta in bianco e sistema biliare in verde. H = ilare, P = periferico. Scala barra 1 mm. I pannelli A, B, D sono adattati con il permesso di Hankeova et al.9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Sfide comuni delle iniezioni di fegato a doppia resina. (A) L’immagine raffigura un fegato che è stato accidentalmente graffiato durante l’apertura iniziale della cavità addominale e la resina sta perdendo attraverso il taglio (punta di freccia blu). (B) Sistema di vene porta scarsamente iniettato a causa dell’indurimento della resina. Le punte di freccia blu etichettano i rami terminali vuoti e le parentesi rosse etichettano le bolle di grandi dimensioni. Scala barra 1 mm. (C) Sistema di vene porta scarsamente iniettato a causa della scarsa perfusione transcardica. Le punte di freccia blu etichettano il sangue visibile nei rami terminali. Scala barra 1 mm. (D) Sistema biliare sovrariempito manifestato da sfere isolate di resina. I pannelli di sinistra mostrano il fegato otticamente cancellato e i pannelli di destra mostrano l’immagine renderizzata 3D microCT. I contorni punteggiati blu raffigurano le regioni di zoom.in. Le punte di freccia nere etichettano una parte del fegato che è stata danneggiata durante la compensazione ottica dopo la scansione microCT. Scala bar 1 mm. (E) L’alta pressione durante l’iniezione di resina può causare la rottura della vena porta (l’animale in questo pannello porta una mutazione Jag1H268Q), contrassegnata da punte di freccia blu. Barra della scala 1 mm. (F) Bolle nella resina durante l’iniezione della vena porta (punte di freccia blu) e (G) iniezione del sistema biliare (punta di freccia blu), barra della scala 1 mm. (H) Scansione MicroCT di bolle (punta freccia blu), rami terminali scarsamente riempiti (parentesi rosse) e perdite di resina (punta freccia gialla), barra della scala 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Contrasto differenziale della resina. (A) La resina gialla appena aperta genera un contrasto sufficiente per distinguere la vena porta iniettata dalla resina (grigia) e i dotti biliari (bianchi). (B) Tre mesi di conservazione della resina gialla portano alla precipitazione della resina con conseguente opacità eterogenea (vena porta grigio-bianca, punta di freccia blu). (C) La conservazione prolungata (>6 mesi) di resina gialla riduce il contrasto tra la vena porta (grigia) e i dotti biliari (grigio). Barra della scala 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Diversi passaggi critici determinano il successo del DUCT, dalla preparazione del campione ai parametri del dispositivo CT. Per ottenere i migliori risultati, è necessario utilizzare resina ben contrastata, ben iniettata e priva di bolle per consentire un’elaborazione digitale semplice con soglia automatizzata per ottenere dati, immagini e filmati 3D. Con l’allenamento e seguendo questo protocollo, il 90% delle iniezioni ha successo e si traduce in dati riproducibili. È importante utilizzare resina gialla fresca per ottenere il miglior contrasto tra i due sistemi iniettati. La resina gialla ha una radiopacità molto forte, mentre la resina blu ha una radiopacità non rilevabile. I migliori risultati si ottengono entro i primi tre mesi dall’apertura di una nuova bottiglia di resina gialla. Con il tempo, la resina precipita e dopo una conservazione più lunga (>6 mesi), le resine gialle e verdi non saranno più distinguibili nelle scansioni TC. Le immagini con scarso contrasto richiedono un tracciamento manuale esteso e dispendioso in termini di tempo e la segmentazione dei due sistemi. Successivamente, il tubo ben allungato è indispensabile per adattarsi al dotto biliare comune dei topi adulti e al dotto biliare comune e alla vena porta dei topi postnatali. Il punto di ingresso per l’iniezione deve essere creato con cura. Se il dotto biliare comune viene tagliato trasversalmente, è probabile che si stacchi dal tessuto circostante, impedendo l’ingresso riuscito del tubo. Questo passaggio è particolarmente delicato per i topi postnatali in cui il dotto biliare comune si ritrae e si “raggomitola” se si è staccato dal tessuto circostante, rendendo l’inserimento del tubo estremamente impegnativo. L’ingresso e l’iniezione del dotto biliare comune possono richiedere un po ‘di pratica. Durante la preparazione del tubo con resina e durante l’iniezione, evitare la formazione di bolle poiché le bolle creeranno spazio negativo nelle immagini TC e richiederanno una correzione manuale dispendiosa in termini di tempo. È importante massaggiare delicatamente il fegato rotolando sulla sua superficie con un batuffolo di cotone bagnato durante e dopo la procedura di iniezione in quanto ciò facilita anche la diffusione della resina. Dopo il completamento dell’iniezione e la rimozione del tubo, il nodo di sutura della seta deve essere stretto rapidamente e con attenzione, in modo che la resina non fuoriesca dal fegato prima che polimerizzi completamente. Per un’imaging microCT di successo, il campione deve essere correttamente fissato in posizione con agarosio e adattato termicamente per eliminare gli artefatti di movimento nei dati CT. Anche le impostazioni di acquisizione sono di fondamentale importanza, che dovrebbero essere ottimizzate per raggiungere un’adeguata risoluzione spaziale per risolvere strutture fini.

Modifiche tecniche alla procedura di iniezione possono essere apportate per ottenere l’iniezione nei topi più giovani. Attualmente, la fusione di resina di fegati di topo più giovani è limitata dalla disponibilità di tubi sufficientemente sottili, con PE10 che è il più piccolo tubo disponibile in commercio. Tanimizu et al. hanno iniettato con successo inchiostro di carbonio nel dotto biliare embrionale del giorno 17 (E17) usando capillari di vetro11. Sarebbero quindi interessanti i test futuri per verificare se la resina può essere consegnata tramite capillare di vetro. DUCT è stato ulteriormente adattato per iniettare altri sistemi tubolari come le vie aeree e la vascolarizzazione dell’arteria polmonare dei polmoni9. La doppia iniezione di resina potrebbe anche essere modificata per essere utilizzata con altre resine disponibili in commercio, oppure questo protocollo potrebbe essere utilizzato per iniezioni con inchiostro di carbonio.

Uno dei principali fattori limitanti della tubazione DUCT è la viscosità della resina. DUCT può essere utilizzato solo per la fusione in resina di strutture tubolari di diametro superiore a 5 μm. In questo set di dati, la resina potrebbe penetrare tubi con il diametro più piccolo di 5 μm9. Questa limitazione dimensionale preclude l’analisi di duttili fini e piccoli capillari. Per far avanzare ulteriormente la tubazione DUCT verso recipienti di calibro più piccolo, è necessario testare altre resine disponibili in commercio o lo sviluppo di nuovi agenti radiopaci a bassa viscosità può migliorare la penetrazione del lume.

In Hankeova et al.9, DUCT è stato confrontato con altre due tecniche comunemente usate, iniezioni di inchiostro a doppio carbonio seguite da pulizia dei tessuti e fotografia standard, e iDISCO + con colorazione dei vasi sanguigni con actina delle cellule muscolari alfa-lisce e dotti biliari con citocheratina 7, seguita da imaging 3D9. DUCT ha superato gli altri due metodi in termini di doppia analisi (che è stata difficile per iDISCO + a causa dell’elevata autofluorescenza epatica), imaging 3D e quantificazione (non possibile con l’iniezione di inchiostro di carbonio) e lumenizzazione (DUCT fornisce dati per l’architettura del lumen interno e la perfusione del sistema). Come accennato in precedenza, il limite principale di DUCT è la dimensione minima del lumen che può essere iniettata e analizzata (limite di 5 μm), un parametro in cui sia l’iniezione di inchiostro di carbonio che iDISCO+ hanno funzionato meglio. DUCT è superiore alla colata di resina a sistema singolo3,5,6 perché consente l’analisi di ciascun sistema iniettato separatamente e facilita anche la doppia indagine 3D per studiare la relazione architettonica tra i due sistemi.

DUCT può essere applicato per studiare due reti tubolari in 3D. Come prova di principio, DUCT è stato utilizzato per visualizzare i sistemi biliari e delle vene portarie del fegato e la vascolarizzazione dell’arteria polmonare e le vie aeree nel polmone9. I dotti biliari intraepatici si sviluppano adiacenti alla vena porta e la vena porta fornisce un modello strutturale e un centro di segnalazione che regola la crescita e la differenziazione dell’albero biliare12. In Hankeova et al.9, DUCT ha esplorato la rigenerazione biliare in un modello murino per la malattia pediatrica umana Sindrome di Alagille. DUCT ha rivelato meccanismi architettonici precedentemente non riportati che il sistema biliare ha utilizzato per ottenere un volume simile a un tipo selvaggio9. I topi con sindrome di Alagille hanno utilizzato due diverse strategie: (1) nelle regioni ilare e centrale del fegato, il sistema biliare ha aumentato la sua ramificazione e (2) nella periferia epatica, i dotti biliari generati de novo erano altamente tortuosi. Questi due fattori combinati hanno prodotto un volume del sistema biliare quasi normale, nonostante l’architettura anormale. Inoltre, DUCT ha rilevato una ramificazione anomala del dotto biliare che si è verificata indipendentemente dalla ramificazione della vena porta e dai dotti biliari che formano ponti di collegamento tra due vene porta9. Questi fenotipi sarebbero impossibili da rilevare nella fusione di singole resine e potrebbero essere interpretati erroneamente nelle sezioni istologiche 2D come proliferazione dei dotti biliari. DUCT fornisce quindi dati che descrivono l’architettura 3D di due reti tubolari a livello dell’intero organo o lobo con la possibilità di analisi quantitative qualitative e approfondite. DUCT potrebbe essere un nuovo standard per lo sviluppo postnatale del fegato e le analisi di rigenerazione epatica in diversi modelli animali.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Kari Huppert e Stacey Huppert per la loro esperienza e il loro aiuto per quanto riguarda la cannulazione dei dotti biliari e la loro ospitalità di laboratorio. Ringraziamo anche Nadja Schultz e Charlotte L. Mattsson per il loro aiuto con la cannulazione del dotto biliare comune.

Ringraziamo le seguenti Agenzie Concedenti per il loro supporto:

Per il lavoro in ERA Lab: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (sovvenzione iniziale delle fondazioni svedesi), Associazione europea per lo studio del fegato (Premio Daniel Alagille), Fondazione svedese Heart-Lung (20170723) e Vetenskapsrådet (2019-01350).

Per il lavoro in JK Lab: Riconosciamo l’infrastruttura di ricerca CzechNanoLab supportata da MEYS CR (LM2018110). J.K. grazie al supporto della sovvenzione FSI-S-20-6353.

Materials

1.5 mL SafeSeal micro tubes Sarstedt 72.706
23 G butterfly needle with tubing BD bioscience 367283
25 G needle BD bioscience 305122
30 G needle BD bioscience 305106
Agarose Top-Bio P045
Benzyl alcohol Sigma Aldrich 108006
Benzyl benzoate Sigma Aldrich B6630
Corning 50 mL tubes Sigma Aldrich CLS430829-500EA polypropylene
Cotton swabs Medicarier 60406
Dissection Microscope Leica Camera AG Leica M60
Dulbecco's phosphate-buffered saline ThermoFisher Scientific 14190144
Ethanol 70% VWR 83801.41
Falcon tube 15 mL Verkon 331.850.084.006
Forceps curved Fine Science Tools 11051-10 Fine Graefe 10 cm curved
Forceps straight Fine Science Tools 11050-10 Fine Graefe 10 cm straight
Formaldehyde solution Sigma Aldrich F8775
GE Phoenix v|tome|x L 240 Waygate Technologoies micro computed tomography scanner
Hanks' Balanced Salt Solution ThermoFisher Scientific 14025092
Heparin Leo Pharma B01AB01 5000 IE/mL
Isolfurane Baxter FDG9623
Methanol ThermoFisher Scientific 11413413
MICROFIL Flowtech MV-122 synthetic resin yellow
MICROFIL Flowtech MV-120 synthetic resin blue
MICROFIL Flowtech MV-diluent clear resin diluent
Pasteur pipette Verkon 130.690.424.503
Peristaltic pump AgnThos 010.6131.M20
phoenix datos|x 2.0 software Baker Hughes CT data reconstruction software
Rocker VWR 444-0142
Silk suture AgnThos 14757 Black silk, 4-0, sterile, 100 m
Skin scissor Fine Science Tools 14058-09 Iris straight tip 9 cm
Spring scissor Fine Science Tools 15000-03 Vannas micro, straight tip 2 mm
Syringe 1 mL Luer BD bioscience 303172
Tubing PE10 BD bioscience 427401
Tubing PE50 BD bioscience 427411
VG Studio MAX 3.3 software Volume Graphics GmbH CT data processing and analysis software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. On the preparation of multicolored corrosion specimens. The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).
  2. Ludwig, J., et al. Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques. Hepatology. 27, 893-899 (1998).
  3. Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction. American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
  4. Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation. American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
  5. Sparks, E. E., et al. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
  6. Cuervo, H., et al. Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice. Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).
  7. Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63, 550-565 (2016).
  8. Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272 (2012).
  9. Hankeova, S., et al. DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome. Elife. 1, 1-29 (2021).
  10. Andersson, E. R., et al. Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations. Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).
  11. Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64, 175-188 (2016).
  12. Ober, E. A., Lemaigre, F. P. Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis. Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).

Tags

3D Liver AnalysisDUCTDouble Resin CastingMicro-computed TomographyLiver Vascular SystemBiliary SystemLiver DiseaseLiver RegenerationBile DuctCommon Bile DuctResin InjectionLiver AnatomyLiver Visualization

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Hankeova, S., Salplachta, J., Van Hul, N., Kavkova, M., Iqbal, A., Zikmund, T., Kaiser, J., Andersson, E. R. DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis. J. Vis. Exp. (175), e62941, doi:10.3791/62941 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image