DUCT: Fundição de Resina Dupla seguida de Tomografia Microcomputada para Análise hepática 3D

O protocolo descrito neste estudo foi aprovado e segue as regras e regulamentos de bem-estar animal do Estocolmo Norra Djurförsöksetiska nämnd (Conselho de Ética em Pesquisa animal de Estocolmo). Os animais utilizados neste estudo foram camundongos mutantes jag1H268Q em um fundo C3H/N e C57bl6J misto. Tanto o sexo masculino quanto o feminino foram incluídos no estudo. Os animais foram utilizados no pós-natal 15 ou como adultos entre 3 e 8 meses. 1. Injeções duplas de resina PreparaçãoPrepare a solução de resina. Para injeções duplas de resina do sistema, prepare as resinas amarelas e verdes, conforme descrito nas etapas 1.1.2-1.1.4. Prepare 1 mL de resina diluída por mouse. Resina Amarela: Diluir a borracha de silicone amarela (alta radiopacidade) com o diluído claro em uma diluição 3:1 para preparar a resina amarela para injeção. Resina Verde: Misture a borracha de silicone azul (radiopacidade indetectável) com o diluente claro em uma diluição 1:1 para preparar a resina azul. Para gerar resina verde, misture a resina azul diluída com a resina amarela diluída em uma proporção de 1:1. Vórtice a resina verde completamente até que a cor seja homogênea.NOTA: A resina azul tem uma radiopacidade muito baixa que não é detectável com microCT, o que, portanto, requer diluição com resina amarela para criar duas resinas com diferentes rádiopacidades.ATENÇÃO: A resina pode conter cromato de chumbo, que é um cancerígeno. Produz gases venenosos em um incêndio. Manuseie com cuidado e descarte a resina como resíduos perigosos. Prepare dois conjuntos de injeção (conjunto de injeção #1 e conjunto de injeção #2) com tubos conforme descrito nas etapas 1.1.6-1.1.11.NOTA: Para camundongos adultos (>P30 (pós-natal 30) = P30 – 2 anos), use o conjunto de injeção #1 (tubo PE10 com 0,6 mm de diâmetro externo) para injeção comum de ducto biliar e conjunto de injeção #2 (tubo PE50 com 0,96 mm de diâmetro externo) para injeção de veia portal. Para camundongos pós-natais jovens (até P30), prepare dois conjuntos de injeção #1, um para o ducto biliar e outro para injeção de veia portal (sem injeção nº 2, pois a veia do portal é muito estreita para acomodar tubos PE50). Para preparar o conjunto de injeção nº 1, corte 30 cm de tubulação PE10 e estique uma extremidade da tubulação à mão puxando-a até ficar o mais fina possível (Figura 1A,B, aproximadamente 0,15 mm de diâmetro, tubo PE10 não esticado tem 0,6 mm de diâmetro). Corte a ponta da tubulação PE10 esticada na diagonal para criar uma ponta chanfrada (Figura 1B). Conecte a extremidade não esticada da tubulação PE10 a uma agulha de 30 G (Figura 1A, conjunto de injeção #1). Para preparar o conjunto de injeção #2, corte 30 cm de tubulação PE50 e estique uma extremidade da tubulação à mão puxando-a até ficar fina o suficiente para caber na veia portal (Figura 1A,B, aproximadamente 0,7 mm, tubo PE50 não esticado tem 0,96 mm de diâmetro). Corte a ponta da tubulação PE50 esticada na diagonal para criar uma ponta chanfrada (Figura 1B). Conecte a extremidade não esticada da tubulação PE50 a uma agulha de 23 G (Figura 1A, conjunto de injeção #2).NOTA: Cada conjunto de injeção só pode ser usado para uma injeção, uma vez que a resina endurecerá na seringa e na tubulação. Ajuste o tamanho da ponta esticada e chanfrada com base no tamanho do ducto biliar comum e da veia portal do mouse, dependendo de sua idade, genótipo e fenótipo. Quando não tiver certeza sobre o tamanho e o ajuste da tubulação, insira a tubulação no duto ou vaso apropriado após a incisão e antes que a tubulação esteja cheia de resina. Se o tubo for muito largo para caber no duto/vaso, estique-o ainda mais. Anestesiar o animal por inalação de isoflurano (primeiro 4% na câmara de indução e ~2% usando o cone do nariz). Coloque o mouse em um banco ventilado em uma almofada de dissecção enquanto o mouse está respirando isoflurane através do cone do nariz. Verifique se o animal está inconsciente por um método recomendado pelo instituto/IRB, por exemplo, beliscando uma das patas.ATENÇÃO: A isoflurano pode causar sonolência ou tontura após a inalação e pode causar danos ao sistema cardiovascular e ao sistema nervoso central através de exposição prolongada ou repetida. Não inale. Manuseie a substância em um banco ventilado e em áreas bem ventiladas.NOTA: É possível utilizar outro método de anestesia, desde que seja compatível com perfusão cardíaca. Uma vez que o animal esteja inconsciente, pulverize o lado ventral com 70% de etanol para evitar interferência de peles. Usando tesoura de pele, corte a pele, fáscia e camada muscular começando na linha média da cavidade abdominal e corte até a cavidade torácica para expor os órgãos internos. Pegue o processo xifoide com fórceps para levantar o esterno e corte o diafragma e a caixa torácica em ambos os lados para expor o coração e os pulmões. Remova a caixa torácica cortando as costelas nos lados esquerdo e direito da caixa torácica com uma tesoura. Tome cuidado extra para não danificar o fígado, pois isso resultará em vazamento da resina. Usando fórceps retos, puxe o coração em direção ao fígado e corte o átrio direito. Insira uma agulha borboleta (23 G), conectada a uma bomba de perfusão peristáltica, no ventrículo esquerdo. Perfumar o rato transcardialmente com a solução de sal balanceada Hanks (HBSS) e heparina (1 U/g de peso corporal do rato). Perfuuse por 3 min com uma taxa de perfusão de 5 mL/min.NOTA: Se o rato estiver sendo perfundido corretamente, os órgãos internos ficarão pálidos, especialmente o fígado. Se, em vez disso, os pulmões estiverem ficando brancos, a agulha é inserida no ventrículo direito e deve ser reposicionada. Após a perfusão, o rato é exsanguinado e pode ser removido do cone do nariz e isoflurane. Desligue a bomba de isoflurane. Injeção de resina – Fundição de resina do sistema biliarMova o rato para o microscópio de dissecção, abdômen para cima, cauda em direção ao experimentador, e vá para longe do experimentador. Os marcos anatômicos de interesse são retratados na Figura 2A. Localize a veia cava inferior (Figura 2A) movendo o intestino para o lado. Use uma tesoura de mola para fazer uma pequena incisão transversal na veia cava inferior para permitir a liberação de pressão vascular hepática (Figura 2Bi). Expor o ducto biliar comum e a veia portal conforme descrito nas etapas 1.2.4- 1.2.6. Mova o intestino e o pâncreas para o lado direito (do experimentador) usando um cotonete de algodão com tampo tampão de fosfato (PBS). Gire o lado ventral do fígado em direção ao coração usando o cotonete de algodão molhado pbs para expor a superfície visceral e a região hilar. Localize o ducto biliar comum que corre da região hilar através do pâncreas e para o intestino no esfíncter de Oddi (Figura 2Bii, ducto biliar comum delineado com a linha pontilhada amarela, pontas de flecha preta apontam para Esfíncter de Oddi).NOTA: Certifique-se de que o fígado está úmido durante todo o procedimento, polvilhando-o com PBS. Tecido ao redor claro (área ~ 5 mm) do ducto biliar comum usando fórceps retos. Coloque a rosca de sutura de seda (tamanho 4-0, 0,17 mm, 3 – 5 cm de comprimento) sob o ducto biliar comum (Figura 2Bii) e amarre um nó de mão solta ao redor do ducto biliar comum (Figura 2Biii).NOTA: Escolha uma área para o nó no meio do caminho entre a região do hilar e o esfíncter de Oddi e a alguma distância da veia portal para que após a sutura seja apertada ao redor do ducto biliar comum, ela não interfira na injeção venosa do portal. Segure a tesoura de mola plana contra o ducto biliar comum para fazer uma incisão oblíqua ao ducto biliar comum no local onde o ducto biliar comum entra no pâncreas e no intestino ao lado do esfíncter de Oddi. (Figura 2Biv), linha pontilhada amarela descreve o esfíncter da região de Oddi, enfatizado por pontas de flecha pretas).NOTA: Este é um passo crucial. Faça um corte oblíquo e não transversal, e faça uma incisão; não corte o ducto biliar. Cortar todo o ducto biliar torna a inserção da tubulação muito desafiadora. Pouco antes do uso, misture 1 mL da resina amarela com 50 μL do agente de cura (preenchendo e esvaziando a seringa de 1 mL) e encha uma seringa Luer de 1 mL com a mistura de agente de cura . Conecte a seringa encheu com a tubulação (conjunto #1). Pressione o êmbolo para encher completamente a tubulação. Certifique-se de que o agente de resina/curaoma gotejamentos da ponta do tubo.NOTA: Evite e remova bolhas na seringa e tubos para obter melhores resultados. Utilizando fórceps, endireitar a área ao redor da incisão comum do ducto biliar e inserir a tubulação na abertura no ducto biliar comum (Figura 2Bv), com a borda mais longa da ponta chanfrada para baixo em direção ao lado dorsal do ducto biliar. Essa orientação garante que a resina possa sair da abertura do tubo, que está voltada para cima, para o duto (Figura 2Bv). Aperte o nó de rosca de seda para fixar o tubo dentro do ducto biliar comum (Figura 2Bvi). Injete a resina no ducto biliar comum. Observe a vesícula biliar e os lobos hepáticos individuais. Massageie o fígado com um cotonete de algodão molhado pbs para ajudar a espalhar a resina igualmente. Os ramos terminais dos dutos biliares cheios de resina (em camundongos do tipo selvagem) são ligeiramente visíveis na superfície hepática.NOTA: O tempo esperado para encher o fígado é de 30 a 100 s. Pare de injetar a resina quando pontos de resina aparecerem na superfície do fígado (Figura 2Ci, pontas de flecha azul) ou quando a resistência for atingida.NOTA: Trabalhe o mais rápido possível, pois a resina começa a endurecer após a adição do agente de cura da resina. O tempo de trabalho da adição do agente de cura é de aproximadamente 15 minutos. Remova a tubulação puxando-a para fora do ducto biliar comum e aperte rapidamente o nó de seda usando fórceps para evitar que a resina vaze. Corte as pontas soltas da sutura de seda, para que elas não interfiram com a injeção de veia portal. Descarte a tubulação contendo resina e a resina restante nos resíduos perigosos e a agulha nos resíduos afiados. Injeção de resina – Fundição de resina venosa portal Limpe a veia do portal (área ~5 mm) de seu tecido circundante cerca de 2 cm de sua entrada para o fígado usando fórceps retos. Coloque a rosca de sutura de seda (tamanho 4-0, 0,17 mm, 3 – 5 cm de comprimento) sob a área desmatada da veia portal (Figura 2Ci) e amarre um nó de mão solta (Figura 2Cii). Faça uma incisão longitudinal na veia portal distal para o fígado e o nó (Figura 2Ciii). Misture 1 mL da resina verde com 50 μL do agente de cura (enchendo e esvaziando uma seringa de 1 mL) e encha a seringa Luer de 1 mL com a mistura de agente de cura de resina. Conecte a seringa recheada com a tubulação (conjunto #2 para ratos >P30, novo conjunto #1 para ratos <P30). Pressione o êmbolo para encher completamente a tubulação. Certifique-se de que a resina escorre da ponta da tubulação.NOTA: Evite e remova bolhas na seringa e tubos para obter melhores resultados. Usando fórceps, endireitar a veia do portal puxando o tecido circundante em direção ao experimentador e inserir o tubo com a borda mais longa da ponta chanfrada em direção ao lado dorsal do vaso (Figura 2Ciii). Aperte o fio de seda para fixar o tubo na veia do portal. Injete a resina na veia do portal. Observe os vasos sanguíneos enchendo com resina. Massageie o fígado com um cotonete de algodão molhado pbs para ajudar a espalhar a resina igualmente (Figura 2Civ). Pare de injetar a resina quando todos os vasos sanguíneos estiverem cheios (extremidades das veias do portal são visíveis na periferia do fígado) ou quando a resistência é atingida.NOTA: Trabalhe rápido, pois a resina começa a endurecer após a adição do agente de cura. O tempo de trabalho da adição do agente de cura é de aproximadamente 15 minutos para o conjunto de injeção #1 e 25 min para o conjunto de injeção #2. Remova a tubulação puxando o tubo da veia do portal e aperte rapidamente o nó de seda usando fórceps para evitar que a resina vaze. Descarte a tubulação contendo resina e a resina restante nos resíduos perigosos e a agulha nos resíduos afiados. Dissecção e fixação hepáticaDisseca todo o fígado cortando-o do tecido circundante e do diafragma. Coloque suavemente todo o fígado em um tubo cônico vazio de 50 mL com o lado ventral voltado para cima e o lado dorsal descansando na parede do tubo cônico para evitar a deformação do fígado. Armazene o tubo cônico horizontalmente durante a noite a 4 °C para que a resina endureça completamente.NOTA: Qualquer recipiente que seja grande o suficiente para caber no fígado pode ser usado em vez de tubo cônico de 50 mL. O uso de um recipiente fundo plano aumentará a probabilidade de que o fígado não esteja deformado. Separe o fígado em lóbulos individuais. Faça uma seleção dos lóbulos que serão utilizados para análise microCT (1.4.4-1.4.5) ou controle de qualidade (1.4.6-1.4.8). Opcionalmente, use todo o fígado para limpeza óptica e microCT sem separá-lo em lóbulos individuais.NOTA: A arquitetura hepática dos sistemas biliar e vascular é diferente em cada lobo, e são, portanto, necessárias análises de lobos combinados. A limpeza óptica não interfere na digitalização de microCs, e o lobo(s) usado para controle de qualidade pode ser posteriormente escaneado com microCT. Por outro lado, as amostras escaneadas com microCT podem ser posteriormente eliminadas opticamente para comparação. Toda a análise hepática é assim possível. Em camundongos do tipo selvagem (fundo genético C3H/C57bl6), o lobo medial direito é preenchido primeiro por injeções de resina, tornando este um lobo adequado para análise de microCs, com a maior reprodutibilidade. O lobo lateral esquerdo é o maior lobo, no qual é, portanto, simples de pré-tela para qualidade de injeção. A seleção do lobo (ou fígado inteiro) utilizado para controle de qualidade e microCsedepende do modelo animal e da questão da pesquisa. Em um capô ventilado, prepare 4% de solução de formaldeído (10 -20 mL por tubo). Fixar os lóbulos usados para microCT com 4% de formaldeído durante a noite a 4 °C e depois lavar uma vez com PBS (10 -20 mL por tubo). Coletar resíduos de formaldeído em um recipiente separado. Mantenha os lóbulos do fígado em PBS a 4 °C para armazenamento a curto prazo ou 70% de etanol para armazenamento a longo prazo. Prossiga com a seção 2: Tomografia microcomputada.ATENÇÃO: O formaldeído causa toxicidade aguda se engolido, inalado ou em contato com a pele. Formaldeído é um líquido inflamável e vapor. Causa queimaduras graves na pele e danos nos olhos. Pode causar uma reação alérgica à pele. Fatal se inalado (concentrado ou em pó). Pode causar irritação respiratória. Suspeito de causar defeitos genéticos. Pode causar câncer. Causa danos aos órgãos (olhos, sistema nervoso central). Declarações de precaução – mantenha-se longe do calor, superfícies quentes, faíscas, chamas abertas e outras fontes de ignição. Nada de fumar. Use luvas de proteção e roupas de proteção. Em caso de derramamento, retire imediatamente todas as roupas que estavam contaminadas. Se estiver em contato com a pele: enxágue a área contaminada com água. Se inalado: remova a pessoa para o ar fresco e monitore a respiração se estiver confortável. Ligue imediatamente para um centro de venenos/ médico. Se nos olhos: enxágue os olhos com água por vários minutos. Se estiver presente e possível, remova as lentes de contato. Para controle de qualidade, fixe os lóbulos restantes (pelo menos um) com 50% de metanol (misturado com água deionizada) por um mínimo de 4h, balançando à temperatura ambiente, seguido por 100% de metanol durante a noite balançando à temperatura ambiente. Coletar resíduos de metanol em um recipiente separado.ATENÇÃO: O metanol causa toxicidade aguda se engolido, inalado ou em contato com a pele. Metanol é um líquido inflamável e vapor. Use luvas de proteção e roupas. Evite respirar ao manusear e mantenha-se afastado do fogo e do calor. Lave bem a pele depois de usar. Em caso de derramamento, retire imediatamente todas as roupas contaminadas. Enxágüe a pele com água. Se inalado: Remova a pessoa para o ar fresco e mantenha-se confortável para respirar. Se inalado, engolido ou exposto, ligue para um centro de venenos/ médico. Em um capô ventilado, prepare a solução de álcool benzílico e benzil (BA: BB, 1:2) (5 -10 mL por lobo). Coloque o lobo hepático em um tubo de polipropileno de 15 ou 50 mL (dependendo do tamanho do lobo) contendo solução BABB. Deixe balançando à temperatura ambiente até transparente. Esta etapa pode levar entre 2-16 h, dependendo do tamanho do lobo.NOTA: A solução BABB dissolve certos tipos de plástico. É seguro armazenar as amostras em tubos de polipropileno ou recipientes de vidro.ATENÇÃO: Benzoato de benzílico pode causar toxicidade aguda quando engolido. É tóxico para a vida aquática com efeitos duradouros. Declarações de precaução: lave bem a pele após o manuseio. É prejudicial quando engolido, em contato com a pele, ou inalado. Evite respirar vapores/vapores. Lave bem as mãos após o manuseio. Não coma, beba ou fume ao usar este produto. Se for engolido – ligue para um centro de veneno/médico se não estiver bem Use em áreas ventiladas. Coletar derramamento. Descarte o conteúdo/recipiente para uma usina de disposição de resíduos aprovada. Inspecione a qualidade da injeção. Apenas fígado bem injetado deve ser escaneado com microCT. 2. Tomografia microcomputnada Preparação da amostra Prepare 1% de gel de agarose misturando 100 mL de água destilada e 1 g de pó de agarose. Coloque a mistura em um micro-ondas e ferva a solução até que o pó de agarose se dissolva. Tempere o gel de 1% de agarose a ~40 °C para evitar danos térmicos à amostra hepática. Coloque o lóbulo(s) de interesse em um tubo cônico de 15 mL e encha-o com o gel de 1% de agarose para aproximadamente 2/3 do volume total do tubo. Esta etapa minimiza o movimento amostral indesejado durante a medição da TC. Medição da tomografiaNOTA: As seguintes etapas são dependentes de dispositivos CT, e configurações e ações específicas podem diferir para diferentes dispositivos ct e fabricantes. Neste protocolo, o scanner de tomografia microcomputante utilizado foi equipado com um tubo de raios-X nanofoco (180 kV/15 W), e dinâmico de painel plano 41|100 (4048 px x 4048 px, tamanho do pixel 100 mm com binning 2) para as medições ct. Monte o tubo cônico de 15 mL com a amostra no estágio rotacional de um dispositivo CT e permita que ele se adapte termicamente à câmara de medição por pelo menos 1 h. Quando a amostra estiver adaptada termicamente, centralize-a no Campo de Visão (FOV). Otimizar as distâncias de amostra de origem e detector de amostras (SSD, SDD) para atingir resolução de voxel suficiente, por exemplo, 12 μm para uma amostra hepática murina adulta ou 6,5 μm para fígado <P30, correspondente às dimensões de FOV (para hardware especificado de antemão) 24,3 mm × 24,3 mm e 13,2 mm × 13,2 mm respectivamente. Defina os parâmetros de aquisição (ou seja, acelerando a tensão e a corrente, exposição, binning, média) seguindo as recomendações do fabricante do dispositivo CT para atingir um nível suficiente de sinal detectado. Esses parâmetros não são apenas dependentes de dispositivos CT, mas também dependentes de amostras e devem ser otimizados para cada amostra. Em Hankeova et al.9, as configurações foram: tensão acelerada de 80 kV, corrente acelerada de 160 μA, tempo de exposição de 400 ms e 2000 imagens. Inicie uma medição de tomografia. Use um software dedicado de reconstrução tomográfica para reconstruir os dados ct. 3. Análise e segmentação de dados NOTA: As seguintes etapas são dependentes de software de processamento de imagem; configurações e ações específicas podem diferir dependendo do software utilizado. Carregar os dados ct: Selecione Arquivo > Importar > Comando. Uma nova seleção depende do formato específico dos dados do CT a serem processados. Use a função Determinação de superfície no painel superior para segmentar a resina nos dados usando limiar global. Na janela de diálogo, determine o valor limiar com a avaliação do histograma definindo a posição da linha “Isovalue” vermelha para segmentar apenas os vasos cheios de resina (ou seja, englobados pela linha amarela no apresentado “painel de visualização”) (Figura 3A). No painel esquerdo, selecione o módulo Criar ROI a partir de Volume/CAD/Malha para criar uma região de interesse (ROI) dos vasos cheios de resina. Na janela de diálogo, use a opção Criar ROI(s) do Solid, selecione o nome do volume processado e confirme. Eliminar a segmentação errônea de clusters de ruído na região de fundo deste ROI. Marque este ROI no painel direito, clique com o botão direito do mouse nele e selecione o ROI Split do módulo. Na janela de diálogo, defina o parâmetro de volume mínimo [voxel] para excluir todas as partículas de ruído – esse valor é experimentado e dependente de dados e deve ser otimizado para que cada amostra seja analisada (Figura 3B). Crie máscaras de canal suaves, contínuas e sólidas sem artefatos no ROI resina-fundido – por exemplo, presença de bolhas de ar ou vazamento de resina. No painel esquerdo, use o módulo Suavização, defina o parâmetro Força de Suavização para 1 ou 2 (dependendo dos dados individuais, quando valores mais altos podem levar à deformação do modelo, especialmente quando se trata de estruturas finas). Se necessário, execute este processo duas vezes (Figura 3C). Identifique e separe os sistemas tubulares individuais na máscara de resina segmentada. Crie um ROI separado para o sistema preenchido com a resina mais absortiva (a resina amarela usada para a injeção comum do ducto biliar) com valores de maior intensidade nos dados da tomografia. Siga o procedimento descrito na etapa 3.2. (Figura 3Di). Marque o novo ROI e o ROI da máscara de resina, clique com o botão direito do mouse e selecione Subtract ROI(S) e subtraia o novo ROI do ROI da máscara de resina para criar um novo ROI para o sistema tubular restante (Figura 3Dii, iii). Exporte os ROIs resultantes para ambos os sistemas tubulares em vários formatos, com base nas preferências do operador, para processamento subsequente em diferentes softwares. Além disso, processe os ROIs resultantes em um software gráfico de volume para exportar a visualização final na forma de uma imagem ou um vídeo.