DUCT: Doppelharzguss mit anschließender Mikro-Computertomographie zur 3D-Leberanalyse

Das in dieser Studie beschriebene Protokoll wurde genehmigt und folgt den Tierschutzregeln und -vorschriften des Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd (Stockholmer Ethikrat für Tierversuche). Die in dieser Studie verwendeten Tiere waren wildtypische oder homozygote Jag1H268Q-mutante Mäuse mit einem gemischten C3H/N- und C57bl6J-Hintergrund. Sowohl Männer als auch Frauen wurden in die Studie eingeschlossen. Die Tiere wurden am postnatalen Tag 15 oder als Erwachsene zwischen 3 – 8 Monaten verwendet. 1. Doppelte Harzinjektionen PräparatHarzlösung vorbereiten. Für Doppelsystemharzinjektionen bereiten Sie sowohl gelbe als auch grüne Harze vor, wie in den Schritten 1.1.2-1.1.4 beschrieben. Bereiten Sie 1 ml Aliquots verdünntes Harz pro Maus vor. Gelbes Harz: Verdünnen Sie gelben Silikonkautschuk (hohe Radiopaziität) mit dem klaren Verdünnungsmittel in einer 3: 1-Verdünnung, um gelbes Harz für die Injektion vorzubereiten. Grünes Harz: Mischen Sie blauen Silikonkautschuk (nicht nachweisbare Radiopacität) mit dem klaren Verdünnungsmittel in einer 1: 1-Verdünnung, um blaues Harz herzustellen. Um grünes Harz zu erzeugen, mischen Sie das verdünnte blaue Harz mit dem verdünnten gelben Harz im Verhältnis 1: 1. Wirbeln Sie das grüne Harz gründlich, bis die Farbe homogen ist.HINWEIS: Blaues Harz hat eine sehr geringe Radiopazition, die mit microCT nicht nachweisbar ist, was daher eine Verdünnung mit gelbem Harz erfordert, um zwei Harze mit unterschiedlichen Radioppacitäten zu erzeugen.VORSICHT: Harz kann Bleichromat enthalten, das ein Karzinogen ist. Es produziert giftige Gase in einem Feuer. Vorsichtig behandeln und das Harz als Sondermüll entsorgen. Bereiten Sie zwei Injektionssätze (Injektionssatz Nr. 1 und Injektionssatz Nr. 2) mit Schläuchen vor, wie in den Schritten 1.1.6-1.1.11 beschrieben.HINWEIS: Für erwachsene Mäuse (>P30 (postnataler Tag 30) = P30 – 2 Jahre) verwenden Sie das Injektionsset Nr. 1 (PE10-Schlauch mit 0,6 mm Außendurchmesser) für die gemeinsame Gallengangsinjektion und das Injektionsset Nr. 2 (PE50-Schlauch mit 0,96 mm Außendurchmesser) für die Pfortaderinjektion. Bereiten Sie für junge postnatale Mäuse (bis P30) zwei Injektionssets Nr. 1 vor, eines für den Gallengang und eines für die Injektion der Pfortader (kein Injektionsset Nr. 2, da die Pfortader zu schmal ist, um PE50-Schläuche aufzunehmen). Um das Injektionsset Nr. 1 vorzubereiten, schneiden Sie 30 cm PE10-Schlauch ab und dehnen Sie ein Ende des Schlauches von Hand, indem Sie ihn ziehen, bis er so dünn wie möglich wird (Abbildung 1A,B, ca. 0,15 mm Durchmesser, ungespannter PE10-Schlauch hat 0,6 mm Durchmesser). Schneiden Sie die Spitze des gestreckten PE10-Schlauchs diagonal ab, um eine abgeschrägte Spitze zu erzeugen (Abbildung 1B). Schließen Sie das nicht gedehnte Ende des PE10-Schlauchs an eine 30-G-Nadel an (Abbildung 1A, Injektionsset Nr. 1). Um das Injektionsset Nr. 2 vorzubereiten, schneiden Sie 30 cm PE50-Schlauch aus und dehnen Sie ein Ende des Schlauches von Hand, indem Sie es ziehen, bis es dünn genug wird, um in die Pfortader zu passen (Abbildung 1A, B, ca. 0,7 mm, ungestreckter PE50-Schlauch hat einen Durchmesser von 0,96 mm). Schneiden Sie die Spitze des gestreckten PE50-Schlauchs diagonal ab, um eine abgeschrägte Spitze zu erzeugen (Abbildung 1B). Verbinden Sie das nicht gedehnte Ende des PE50-Schlauchs mit einer 23 G-Nadel (Abbildung 1A, Injektionsset Nr. 2).HINWEIS: Jedes Injektionsset kann nur für eine Injektion verwendet werden, da das Harz in der Spritze und im Schlauch aushärtet. Passen Sie die Größe der gestreckten und abgeschrägten Spitze basierend auf der Größe des gemeinsamen Gallengangs und der Pfortader der Maus an, abhängig von Alter, Genotyp und Phänotyp. Wenn Sie sich über die Größe und Passform des Schlauches nicht sicher sind, führen Sie den Schlauch nach dem Schnitt und bevor der Schlauch mit Harz gefüllt wird, in den entsprechenden Kanal oder behälter ein. Wenn der Schlauch zu breit ist, um in den Kanal / das Gefäß zu passen, dehnen Sie ihn weiter. Betäuben Sie das Tier durch Isofluran-Inhalation (zuerst 4% in der Induktionskammer und ~ 2% mit dem Nasenzapfen). Legen Sie die Maus auf eine belüftete Bank auf einem Sezierpad, während die Maus Isofluran durch den Nasenkegel atmet. Überprüfen Sie, ob das Tier bewusstlos ist, indem Sie eine vom Institut/IRB empfohlene Methode anwenden, z. B. indem Sie eine der Pfoten kneifen.VORSICHT: Isofluran kann beim Einatmen Schläfrigkeit oder Schwindel verursachen und durch längere oder wiederholte Exposition das Herz-Kreislauf-System und das zentrale Nervensystem schädigen. Atmen Sie es nicht ein. Behandeln Sie die Substanz auf einer belüfteten Bank und in gut belüfteten Bereichen.HINWEIS: Es ist möglich, eine andere Anästhesiemethode zu verwenden, solange sie mit der Herzperfusion kompatibel ist. Sobald das Tier bewusstlos ist, besprühen Sie die ventrale Seite mit 70% Ethanol, um Störungen durch das Fell zu verhindern. Schneiden Sie mit einer Hautschere die Haut, faszien- und Muskelschicht beginnend an der Mittellinie der Bauchhöhle und schneiden Sie bis zur Brusthöhle durch, um die inneren Organe freizulegen. Greifen Sie den Xiphoid-Prozess mit einer Pinzette, um das Brustbein anzuheben, und schneiden Sie das Zwerchfell und den Brustkorb auf beiden Seiten ab, um Herz und Lunge freizulegen. Entfernen Sie den Brustkorb, indem Sie die Rippen auf der linken und rechten Seite des Brustkorbs mit einer Schere durchschneiden. Achten Sie besonders darauf, die Leber nicht zu schädigen, da dies zum Austreten des Harzes führt. Ziehen Sie das Herz mit einer geraden Pinzette in Richtung Leber und schneiden Sie den rechten Vorhof weg. Führen Sie eine Schmetterlingsnadel (23 G), die mit einer peristaltischen Perfusionspumpe verbunden ist, in den linken Ventrikel ein. Perfundieren Sie die Maus transkardiell mit Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) und Heparin (1 U/g Körpergewicht der Maus). 3 min mit einer Perfusionsrate von 5 ml/min perfundieren.HINWEIS: Wenn die Maus richtig durchblutet wird, werden die inneren Organe blass, insbesondere die Leber. Wenn stattdessen die Lunge weiß wird, wird die Nadel in den rechten Ventrikel eingeführt und sollte neu positioniert werden. Nach der Perfusion wird die Maus exsanguiniert und kann aus dem Nasenkegel und Isofluran entfernt werden. Schalten Sie die Isofluranpumpe aus. Harzeninjektion – GallensystemharzgussBewegen Sie die Maus zum Seziermikroskop, den Bauch nach oben, den Schwanz in Richtung des Experimentators und den Kopf weg vom Experimentator. Die anatomischen Orientierungspunkte von Interesse sind in Abbildung 2A dargestellt. Lokalisieren Sie die vena cava inferior (Abbildung 2A), indem Sie den Darm zur Seite bewegen. Verwenden Sie eine Federschere, um einen kleinen Transversalschnitt in die untere Hohlvene zu machen, um die Freisetzung des hepatischen Gefäßdrucks zu ermöglichen (Abbildung 2Bi). Exponieren Sie den gemeinsamen Gallengang und die Pfortader wie in den Schritten 1.2.4- 1.2.6 beschrieben. Bewegen Sie den Darm und die Bauchspeicheldrüse mit einem mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung (PBS) benetzten Wattestäbchen auf die rechte Seite (des Experimentators). Drehen Sie die ventrale Seite der Leber mit dem PBS-benetzten Wattestäbchen in Richtung Herz, um die viszerale Oberfläche und die Hilarregion freizulegen. Lokalisieren Sie den gemeinsamen Gallengang, der von der Hilarregion über die Bauchspeicheldrüse und in den Darm am Schließmuskel von Oddi verläuft (Abbildung 2Bii, gemeinsamer Gallengang, der mit der gelb gepunkteten Linie umrandet ist, schwarze Pfeilspitzen zeigen auf den Schließmuskel von Oddi).HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Leber während des gesamten Verfahrens feucht ist, indem Sie sie mit PBS bestreuen. Entfernen Sie das umgebende Gewebe (Fläche ~ 5 mm) mit einer geraden Pinzette vom gemeinsamen Gallengang. Seidennahtfaden (Größe 4-0, 0,17 mm, 3 – 5 cm lang) unter den gemeinsamen Gallengang legen (Abbildung 2Bii) und einen losen Überhandknoten um den gemeinsamen Gallengang binden (Abbildung 2Biii).HINWEIS: Wählen Sie einen Bereich für den Knoten auf halbem Weg zwischen der Hilarregion und dem Schließmuskel von Oddi und in einiger Entfernung von der Pfortader, so dass nach dem Anziehen der Naht um den gemeinsamen Gallengang die Injektion der Pfortader nicht beeinträchtigt wird. Halten Sie die Federschere flach gegen den gemeinsamen Gallengang, um einen schrägen Schnitt in den gemeinsamen Gallengang an der Stelle zu machen, an der der gemeinsame Gallengang neben dem Schließmuskel von Oddi in die Bauchspeicheldrüse und den Darm gelangt. (Abbildung 2Biv), gelb gepunktete Linie umreißt den Schließmuskel der Oddi-Region, hervorgehoben durch schwarze Pfeilspitzen).HINWEIS: Dies ist ein entscheidender Schritt. Machen Sie einen schrägen und keinen transversalen Schnitt und machen Sie einen Schnitt; Den Gallengang nicht durchtrennen. Das Durchschneiden des gesamten Gallengangs macht das Einführen des Schlauches sehr schwierig. Kurz vor Gebrauch 1 mL des gelben Harzes mit 50 μL des Härters mischen (durch Befüllen und Entleeren der 1 mL Spritze) und eine 1 mL Luer Spritze mit der Harz-Härter-Mischung füllen. Verbinden Sie die gefüllte Spritze mit dem Schlauch (Set #1). Drücken Sie den Kolben, um den Schlauch vollständig zu füllen. Stellen Sie sicher, dass das Harz/Härtemittel-Gemisch von der Spitze des Schlauches tropft.HINWEIS: Vermeiden und entfernen Sie Blasen in der Spritze und im Schlauch, um beste Ergebnisse zu erzielen. Begradigen Sie mit einer Pinzette den Bereich um den gemeinsamen Gallengangsschnitt und führen Sie den Schlauch in die Öffnung im gemeinsamen Gallengang ein (Abbildung 2Bv), wobei die längste Kante der abgeschrägten Spitze nach unten zur dorsalen Seite des Gallengangs führt. Diese Ausrichtung sorgt dafür, dass Harz aus der nach oben gerichteten Schlauchöffnung in den Kanal austreten kann (Abbildung 2Bv). Ziehen Sie den Seidenfadenknoten fest, um den Schlauch im gemeinsamen Gallengang zu befestigen (Abbildung 2Bvi). Injizieren Sie das Harz in den gemeinsamen Gallengang. Beobachten Sie die Gallenblase und die einzelnen Leberlappen. Massieren Sie die Leber mit einem PBS-benetzten Wattestäbchen, um das Harz gleichmäßig zu verteilen. Die Endäste der harzgefüllten Gallengänge (bei Wildtyp-Mäusen) sind an der Leberoberfläche schwach sichtbar.HINWEIS: Die erwartete Zeit zum Füllen der Leber beträgt 30 -100 s. Hören Sie auf, das Harz zu injizieren, wenn Harzpunkte an der Oberfläche der Leber erscheinen (Abbildung 2Ci, blaue Pfeilspitzen) oder wenn der Widerstand erreicht ist.HINWEIS: Arbeiten Sie so schnell wie möglich, da das Harz nach Zugabe des Harzhärters zu härten beginnt. Die Arbeitszeit ab Zugabe des Härters beträgt ca. 15 min. Entfernen Sie den Schlauch, indem Sie ihn aus dem gemeinsamen Gallengang ziehen und den Seidenknoten schnell mit einer Pinzette festziehen, um zu verhindern, dass das Harz austritt. Schneiden Sie die losen Enden der Seidennaht weg, damit sie die Injektion der Pfortader nicht stören. Entsorgen Sie den harzhaltigen Schlauch und das verbleibende Harz in den gefährlichen Abfall und die Nadel in den Scharfkörperabfall. Harzinjektion – Pfortaderharzguss Reinigen Sie die Pfortader (Fläche ~ 5 mm) von ihrem umgebenden Gewebe etwa 2 cm von ihrem Eintritt in die Leber mit einer geraden Pinzette. Seidennahtfaden (Größe 4-0, 0,17 mm, 3 – 5 cm lang) unter den geräumten Bereich der Pfortader legen (Abbildung 2Ci) und einen losen Überhandknoten binden (Abbildung 2Cii). Machen Sie einen Längsschnitt in der Pfortader distal zur Leber und zum Knoten (Abbildung 2Ciii). Mischen Sie 1 mL des grünen Harzes mit 50 μL des Härters (durch Auffüllen und Entleeren einer 1 mL Spritze) und füllen Sie die 1 mL Luer Spritze mit dem Harzhärtergemisch. Verbinden Sie die gefüllte Spritze mit dem Schlauch (Set #2 für >P30 Mäuse, neues Set #1 für <P30 Mäuse). Drücken Sie den Kolben, um den Schlauch vollständig zu füllen. Stellen Sie sicher, dass das Harz von der Spitze des Schlauches tropft.HINWEIS: Vermeiden und entfernen Sie Blasen in der Spritze und im Schlauch, um beste Ergebnisse zu erzielen. Richten Sie die Pfortader mit einer Pinzette aus, indem Sie das umgebende Gewebe in Richtung des Experimentators ziehen, und führen Sie den Schlauch mit der längsten Kante der abgeschrägten Spitze in Richtung der dorsalen Seite des Gefäßes ein (Abbildung 2Ciii). Ziehen Sie den Seidenfaden fest, um den Schlauch in der Pfortader zu sichern. Injizieren Sie das Harz in die Pfortader. Beobachten Sie, wie sich die Blutgefäße mit Harz füllen. Massieren Sie die Leber mit einem PBS-benetzten Wattestäbchen, um das Harz gleichmäßig zu verteilen (Abbildung 2Civ). Hören Sie auf, das Harz zu injizieren, wenn alle Blutgefäße gefüllt sind (enden der Pfortadern sind an der Leberperipherie sichtbar) oder wenn der Widerstand erreicht ist.HINWEIS: Arbeiten Sie schnell, da das Harz nach der Zugabe des Härters zu härten beginnt. Die Arbeitszeit nach Zugabe des Härters beträgt ca. 15 min für Injektionsset Nr. 1 und 25 min für Injektionsset Nr. 2. Entfernen Sie den Schlauch, indem Sie den Schlauch aus der Pfortader herausziehen und den Seidenknoten schnell mit einer Pinzette festziehen, um zu verhindern, dass das Harz austritt. Entsorgen Sie den harzhaltigen Schlauch und das verbleibende Harz in den gefährlichen Abfall und die Nadel in den Scharfkörperabfall. Leberdissektion und FixierungSezieren Sie die gesamte Leber, indem Sie sie vom umgebenden Gewebe und dem Zwerchfell abschneiden. Legen Sie die gesamte Leber vorsichtig in ein leeres konisches 50-ml-Röhrchen, wobei die ventrale Seite nach oben zeigt und die dorsale Seite auf der Wand des konischen Tubus ruht, um eine Verformung der Leber zu verhindern. Lagern Sie das konische Rohr horizontal über Nacht bei 4 °C, damit das Harz vollständig aushärtet.HINWEIS: Jeder Behälter, der groß genug ist, um in die Leber zu passen, kann anstelle von 50 ml konischem Rohr verwendet werden. Die Verwendung eines Behälters mit flachem Boden erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die Leber nicht verformt ist. Trennen Sie die Leber in einzelne Lappen. Treffen Sie eine Auswahl der Lappen, die für die microCT-Analyse (1.4.4-1.4.5) oder die Qualitätskontrolle (1.4.6-1.4.8) verwendet werden. Verwenden Sie optional die gesamte Leber sowohl für die optische Reinigung als auch für die microCT, ohne sie in einzelne Lappen zu trennen.HINWEIS: Die Leberarchitektur des Gallen- und Gefäßsystems ist in jedem Lappen unterschiedlich, und daher sind abgestimmte Lappenanalysen erforderlich. Das optische Clearing stört das microCT-Scannen nicht, und die für die Qualitätskontrolle verwendeten Lappen können anschließend mit microCT gescannt werden. Umgekehrt können mit microCT gescannte Proben nachträglich optisch zum Vergleich freigegeben werden. Die gesamte Leberanalyse ist somit möglich. Bei Wildtyp-Mäusen (genetischer Hintergrund C3H/C57bl6) wird der rechte mediale Lappen zuerst durch Harzinjektionen gefüllt, was ihn zu einem geeigneten Lappen für die microCT-Analyse mit höchster Reproduzierbarkeit macht. Der linke Seitenlappen ist der größte Lappen, in dem es daher einfach ist, die Injektionsqualität vorzusieben. Die Auswahl des Lappens (oder der ganzen Leber), der für die Qualitätskontrolle und das MicroCT-Scannen verwendet wird, hängt vom Tiermodell und der Forschungsfrage ab. In einer belüfteten Haube 4% ige Formaldehydlösung (10 -20 ml pro Röhrchen) herstellen. Fixieren Sie die für microCT verwendeten Lappen mit 4% Formaldehyd über Nacht bei 4 °C und waschen Sie sie anschließend einmal mit PBS (10 -20 ml pro Tube). Sammeln Sie Formaldehydabfälle in einem separaten Behälter. Bewahren Sie die Leberlappen in PBS bei 4 °C für die kurzfristige Lagerung oder 70% Ethanol für die Langzeitlagerung auf. Fahren Sie mit Abschnitt 2: Mikro-Computertomographie fort.VORSICHT: Formaldehyd verursacht akute Toxizität, wenn es geschluckt, eingeatmet oder mit der Haut in Berührung kommt. Formaldehyd ist eine brennbare Flüssigkeit und Dampf. Es verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden. Kann eine allergische Hautreaktion verursachen. Tödlich beim Einatmen (konzentriert oder in Pulverform). Kann Atemwegsreizungen verursachen. Verdacht auf genetische Defekte. Kann Krebs verursachen. Verursacht Schäden an Organen (Augen, zentrales Nervensystem). Vorsichtshinweise – Von Hitze, heißen Oberflächen, Funken, offenen Flammen und anderen Zündquellen fernhalten. Rauchen verboten. Tragen Sie Schutzhandschuhe und Schutzkleidung. Im Falle eines Verschüttens sofort alle Kleidungsstücke ausziehen, die kontaminiert waren. Bei Kontakt mit der Haut: Spülen Sie den kontaminierten Bereich mit Wasser ab. Wenn eingeatmet: Entfernen Sie die Person an die frische Luft und überwachen Sie die Atmung, wenn Sie sich wohl fühlen. Rufen Sie sofort eine Giftnotrufzentrale / einen Arzt an. Wenn in den Augen: Spülen Sie die Augen mit Wasser für einige Minuten. Wenn vorhanden und möglich, entfernen Sie Kontaktlinsen. Zur Qualitätskontrolle fixieren Sie die verbleibenden Lappen (mindestens einen) mit 50% Methanol (gemischt mit deionisiertem Wasser) für mindestens 4 h, schaukeln bei Raumtemperatur, gefolgt von 100% Methanol über Nacht schaukeln bei Raumtemperatur. Sammeln Sie Methanolabfälle in einem separaten Behälter.VORSICHT: Methanol verursacht akute Toxizität, wenn es geschluckt, eingeatmet oder mit der Haut in Berührung kommt. Methanol ist eine brennbare Flüssigkeit und Dampf. Tragen Sie Schutzhandschuhe und -kleidung. Vermeiden Sie das Atmen bei der Handhabung und halten Sie sich von Feuer und Hitze fern. Waschen Sie die Haut gründlich nach der Anwendung. Im Falle eines Verschüttens sofort alle kontaminierten Kleidungsstücke ausziehen. Spülen Sie die Haut mit Wasser ab. Wenn eingeatmet: Entfernen Sie die Person an die frische Luft und halten Sie sich beim Atmen wohl. Wenn Sie eingeatmet, geschluckt oder exponiert werden, rufen Sie ein Giftzentrum / einen Arzt an. In einer belüfteten Haube Benzylalkohol und Benzylbenzoat (BA: BB, 1:2) (5 -10 ml pro Lappen) Lösung herstellen. Legen Sie den Leberlappen in ein 15- oder 50-ml-Polypropylenröhrchen (abhängig von der Größe des Lappens), das BABB-Lösung enthält. Lassen Sie es bei Raumtemperatur schaukeln, bis es transparent ist. Dieser Schritt kann je nach Größe des Lappens zwischen 2-16 h dauern.HINWEIS: Die BABB-Lösung löst bestimmte Arten von Kunststoff auf. Es ist sicher, die Proben in Polypropylenröhrchen oder Glasbehältern zu lagern.VORSICHT: Benzylbenzoat kann beim Verschlucken akute Toxizität verursachen. Es ist giftig für Wasserlebewesen mit lang anhaltender Wirkung. Vorsichtshinweise: Die Haut nach der Handhabung gründlich waschen. Es ist schädlich, wenn es geschluckt wird, mit der Haut in Berührung kommt oder eingeatmet wird. Vermeiden Sie das Einatmen von Rauch / Dämpfen. Waschen Sie sich nach der Handhabung gründlich die Hände. Essen, trinken oder rauchen Sie nicht, wenn Sie dieses Produkt verwenden. Bei Verschlucken – bei Unwohlsein eine Giftnotrufzentrale / einen Arzt aufsuchen In belüfteten Bereichen anwenden. Sammeln Sie verschüttetes Material. Entsorgen Sie den Inhalt/Behälter einer zugelassenen Abfallentsorgungsanlage. Überprüfen Sie die Qualität der Injektion. Nur gut injizierte Leber sollte mit microCT gescannt werden. 2. Mikro-Computertomographie Probenvorbereitung Bereiten Sie 1% Agarosegel vor, indem Sie 100 ml destilliertes Wasser und 1 g Agarosepulver mischen. Legen Sie die Mischung in eine Mikrowelle und kochen Sie die Lösung, bis sich das Agarosepulver auflöst. Temperieren Sie das 1% ige Agarosegel auf ~ 40 ° C, um eine thermische Schädigung der Leberprobe zu vermeiden. Legen Sie den oder die Lappen von Interesse in ein 15 ml konisches Röhrchen und füllen Sie es mit dem 1% igen Agarosegel auf etwa 2/3 des Gesamtvolumens des Röhrchens. Dieser Schritt minimiert unerwünschte Probenbewegungen während der CT-Messung. CT-MessungHINWEIS: Die folgenden Schritte sind CT-geräteabhängig, und spezifische Einstellungen und Aktionen können sich für verschiedene CT-Geräte und Hersteller unterscheiden. In diesem Protokoll wurde der verwendete Mikrocomputertomograph mit einer Nanofokus-Röntgenröhre (180 kV/15 W) und einem dynamischen Flachbildschirm 41|100 (4048 px x 4048 px, Pixelgröße 100 mm mit Binning 2) für die CT-Messungen ausgestattet. Montieren Sie das konische 15-ml-Rohr mit der Probe auf der Rotationsstufe eines CT-Geräts und lassen Sie es sich für mindestens 1 h thermisch an die Messkammer anpassen. Wenn die Probe thermisch angepasst ist, zentrieren Sie sie im Sichtfeld (FOV). Optimieren Sie die Entfernungen zwischen Quellprobe und Probendetektor (SSD, SDD), um eine ausreichende Voxelauflösung zu erreichen, z. B. 12 μm für eine adulte Murinenleberprobe oder 6,5 μm für <P30-Leber, entsprechend den Abmessungen des Sichtfelds (für zuvor spezifizierte Hardware) 24,3 mm × 24,3 mm bzw. 13,2 mm × 13,2 mm. Stellen Sie die Erfassungsparameter (z. B. Beschleunigung von Spannung und Strom, Exposition, Binning, Mittelwertbildung) gemäß den Empfehlungen des CT-Geräteherstellers ein, um ein ausreichendes Maß an erkanntem Signal zu erreichen. Diese Parameter sind nicht nur CT-geräteabhängig, sondern auch probenabhängig und sollten für jede Probe optimiert werden. In Hankeova et al.9 waren die Einstellungen: 80 kV Beschleunigungsspannung, 160 μA Beschleunigungsstrom, 400 ms Belichtungszeit und 2000 Bilder. Starten Sie eine CT-Messung. Verwenden Sie eine spezielle tomographische Rekonstruktionssoftware, um die CT-Daten zu rekonstruieren. 3. Analyse und Datensegmentierung HINWEIS: Die folgenden Schritte sind von der Bildverarbeitungssoftware abhängig. Spezifische Einstellungen und Aktionen können je nach verwendeter Software unterschiedlich sein. CT-Daten laden: Wählen Sie Datei > Befehl > importieren. Eine weitere Auswahl ist abhängig vom spezifischen Format der zu verarbeitenden CT-Daten. Verwenden Sie die Funktion Oberflächenbestimmung auf der oberseiten Seite, um das Harz in den Daten mithilfe der globalen Schwelle zu segmentieren. Bestimmen Sie im Dialogfenster den Schwellenwert mit Histogrammauswertung, indem Sie die Position der roten “Isovalue”-Linie so einstellen, dass nur die mit Harz gefüllten Behälter segmentiert werden (d.h. von der gelben Linie im dargestellten “Vorschaufenster” umschlossen) (Abbildung 3A). Wählen Sie im linken Bereich das Modul ROI aus Volumen/CAD/Mesh erstellen aus , um eine Region of Interest (ROI) der mit Harz gefüllten Behälter zu erstellen. Verwenden Sie im Dialogfenster die Option ROI(s) aus Solid erstellen, wählen Sie den Namen des verarbeiteten Volumes aus und bestätigen Sie. Eliminieren Sie fehlerhafte Segmentierungen von Rauschclustern im Hintergrundbereich dieses ROI. Markieren Sie diesen ROI im rechten Bereich, klicken Sie mit der rechten Maustaste darauf und wählen Sie das Modul Split ROI aus. Setzen Sie im Dialogfenster den Parameter Minimum Volume [voxel] so, dass alle Rauschpartikel ausgeschlossen werden – dieser Wert ist experiment- und datenabhängig und muss für jede zu analysierende Probe optimiert werden (Abbildung 3B). Erstellen Sie glatte, kontinuierliche und feste Kanalmasken ohne Artefakte im HARZguss-ROI – z. B. das Vorhandensein von Luftblasen oder Harzleckagen. Verwenden Sie im linken Bereich das Modul Glättung, setzen Sie den Parameter Glättungsfestigkeit auf 1 oder 2 (abhängig von den einzelnen Daten, wenn höhere Werte zu einer Modellverformung führen können, insbesondere bei feinen Strukturen). Führen Sie diesen Prozess bei Bedarf zweimal aus (Abbildung 3C). Identifizieren und trennen Sie die einzelnen röhrenförmigen Systeme in der segmentierten Harzmaske. Erstellen Sie einen separaten ROI für das System, das mit dem absorbierenderen Harz (dem gelben Harz, das für die übliche Gallenganginjektion verwendet wird) mit höheren Intensitätswerten in den CT-Daten gefüllt ist. Befolgen Sie das in Schritt 3.2 beschriebene Verfahren. (Abbildung 3Di). Markieren Sie den neuen ROI und den ROI der Harzmaske, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie ROI(S) subtrahieren und den neuen ROI vom ROI der Harzmaske subtrahieren, um einen neuen ROI für das verbleibende Rohrsystem zu erstellen (Abbildung 3Dii, iii). Exportieren Sie die resultierenden ROIs für beide Rohrsysteme in verschiedenen Formaten, basierend auf den Präferenzen des Bedieners, zur anschließenden Verarbeitung in unterschiedlicher Software. Verarbeiten Sie außerdem die resultierenden ROIs in einer Volumengrafiksoftware, um die endgültige Visualisierung in Form eines Bildes oder eines Videos zu exportieren.