ניקוי סלקטיבי של נמטודות קנורהבדיטיס פראיות להעשרה לחיידקי מיקרוביום מעיים

1. גרימת היווצרות דאואר לנמטודות בר על לוחות גז טבעי נוזלי לגדל את זן Caenorhabditis פראי על לוחות NGM סטנדרטיים עם OP50-1 E. coli כמקור מזון לאחר קבלת התולעים עם חיידק בלתי תרבותי של עניין. לדגור את הנמטודות ב 20 °C (50 °F).הערה: הטמפרטורה הסטנדרטית לגדל נמטודות Caenorhabditis היא בין 15-25 °C (70 °F), אבל צריך להיקבע אמפירית כדי למנוע אובדן של חיידק עניין. להרעיב את הצלחת של בעלי חיים ב 20 °C (4-5 ימים עד כל OP50-1 הוא נצרך ואת הרוב הגיע לשלב dauer.הערה: דאוארים הם זחלים ארוכי טווח המתפתחים עקב היעדר תזונה ויש להם גוון גוון. 2. שטיפת הנמטודות הוסף 5 מ”ל של M9 מדיה מלחים מינימליים (42 mM Na2HPO4, 22 מ”מ KH2PO4, 8.6 mM NaCl, 19 mM NH4Cl) לצלחת 6 ס”מ של תולעים מורעבות. באמצעות פיפטה זכוכית סטרילית ונורה, pipette עד M9 ותולעים מהצלחת ולהעביר אותם צינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ”ל. באמצעות צנטריפוגה קלינית, לסובב את התולעים בצינור ב 1000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר. באמצעות פיפטה סטרילית של 15 מ”ל, להסיר ולהשליך את supernatant M9 מעל גלולה של תולעים. אל תפריע לתולעים החיות בתחתית הצינור על ידי השארת כ 50 μL של M9 מעל התולעים. הוסף 10 מ”ל של M9 + 0.05% של Triton X-100 לאותו צינור צנטריפוגה והידק כראוי את מכסה הצינור. לדגור את הצינור על nutator במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את החיידקים החיצוניים. הסר את הצינור מן nutator ולסובב את התולעים ב 1000 x g עבור 30 s. באמצעות פיפטה סטרילית, להסיר ולהשליך את M9 supernatant מעל גלולה של תולעים. אל תפריע לתולעים החיות בתחתית הצינור על ידי השארת כ 50 μL של M9 מעל התולעים. בצע את השלבים 2.5-2.8 שלוש פעמים נוספות. 3. חיטוי הנמטודות הכן פתרון אנטיביוטי ו- SDS ב 10 מ”ל של חוצץ M9 על ידי הוספת 0.25% SDS (250 μL של 10% SDS), 50 מיקרוגרם / מ”ל של קרבניצילין, 25 מיקרוגרם/מ”ל של קנאמיצין, 12.5 מיקרוגרם/מ”ל של טטרציקלין, 100 מיקרוגרם/מ”ל של גנטאמיצין, 50 מיקרוגרם/מ”ל של סטרפטומיצין, 37.5 מיקרוגרם/מ”ל של כלוראמפניקול, ו-200 מיקרוגרם/מ”ל של צפוטקסימה (ראו טבלת חומרים). לדגור על הצינור המכיל נמטודות בתמיסת האנטיביוטיקה וה-SDS על מטור בטמפרטורת החדר למשך הלילה.הערה: כל התולעים והעוברים שאינם דאואר ימותו, אך רבות מתולעי דאואר ישרדו את תהליך הניקוי הזה. 4. הסרת פתרון האנטיביוטיקה וה-SDS ספין את התולעים בצינור ב 1000 x g במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות פיפטה סטרילית, להסיר את supernatant מצינור צנטריפוגה מבלי להפריע התולעים בתחתית הצינור. הוסף 10 מ”ל של M9 + 0.05% טריטון X-100 והידוק כראוי את המכסה של הצינור. לדגור על הצינור על nutator במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הצינור מן nutator לסובב את התולעים ב 1000 x g במשך 1 דקות. בצע את שלבים 4.2-4.3 שלוש פעמים. לאחר הכביסה האחרונה, להשאיר את גלולה תולעת ללא הפרעה בתחתית ב 100 μL של הפתרון ולהשליך את השאר. 5. להפיץ זן נמטודה נקי באמצעות פיפטה זכוכית סטרילית, להעביר 100 μL של supernatant ואת הכדור למרכז של צלחת NGM 10 ס”מ זרעים עם OP50-1. אפשר לצלחת להתייבש מבלי להפריע לנוזל במרכז. אפשר לדאוארים לזחול החוצה מהמרכז ודרך מדשאת OP50-1 למשך 5-10 דקות. הרימו בזהירות דאואר אחד וציפו אותו על צלחת זרעים של NGM 6 ס”מ. בסך הכל, לבחור לפחות 10 dauers צלחת אותם לוחות NGM בודדים 6 ס”מ זרעים עם OP50-1 (10 לוחות סה”כ). לדגור על הצלחות במשך 4-5 ימים ב 20 °C (5 °F) עד dauers גדל הדור הבא (F1) הגיע לשלב הבוגר. בדוק חזותית זיהום על כל הצלחות, נראה כמו צמיחה מיקרוביאלית שאינה OP50-1. עבור כל צלחת נקייה, לאמת את התפשטות המיקרואורגניזם של עניין באמצעות נורמרסקי או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, כגון פלואורסצנטית בהכלאה במקום (FISH)12, בהתאם פנוטיפ של עניין. 6. ניתוח מעיים וזיהוי PCR של מינים מיקרוביאליים לגדל בעלי חיים ב 20 °C (3-4 ימים) כדי לאפשר להם לגווע ברעב ולהפחית את כמות חיידקי OP50-1. הוסף 5 מ”ל של מדיה M9 לצלחת של תולעים מורעבות. באמצעות פיפטה זכוכית סטרילית ונורה, pipette את M9 + תולעים מהצלחת ולהעביר אותם צינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ”ל. באמצעות צנטריפוגה קלינית, לסובב את התולעים בצינור ב 1000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר. באמצעות פיפטה סטרילית של 15 מ”ל, הסר את הסופר-טבעי מצינור הצנטריפוגה מבלי להפריע לתולעים החיות בתחתית הצינור. הוסף 10 מ”ל של M9 + 0.05% Triton X-100 ודגר את הצינור על nutator במשך 20 דקות כדי להסיר חיידקים חיצוניים. חזור ארבע פעמים כדי לשטוף את התולעים. לאחר הכביסה האחרונה, באמצעות קצה פיפטה סטרילי, להסיר את supernatant מבלי להפריע את הכדור בתחתית 100 μL של הפתרון. בעזרת קצה פיפטה סטרילי, העבירו את M9 והתולעים לצלחת NGM לא מנוצלת ותנו לצלחת להתייבש בזמן שהתולעים זוחלות במשך 20 דקות כדי לעזור להסיר את OP50-1 מהעור והמעי. הוסף 250 μL של M9 לצלחת היבשה והשתמש פיפטה זכוכית להעביר M9 + תולעים ללוח NGM חדש unseeded. שוב, תן לצלחת להתייבש ולאפשר לתולעים לזחול במשך 20 דקות. הוסף 250 μL של M9 לצלחת ולהעביר 100 μL של M9 + תולעים לכוס שעון נקי. באמצעות שתי מחטי מזרק סטריליות 26 G, לערוף את הנמטודות על ידי החזקת התולעת למטה עם מחט אחת ושימוש במחט השנייה כדי לחתוך את התולעת. לאחר עריפת ראש, המעי (פרטני) ואת gonad (שקוף) מהגוף באופן טבעי לצאת מהגוף. לחתוך חתיכה של המעי החשוף על ידי החזקת המעי עם מחט אחת לחתוך אותו עם השני.הערה: אם אפשר, ודא כי החיידק של עניין עדיין קיים במעיים נצחיים באמצעות מיקרוסקופיה נורמרסקי, דגים, או אימונוהיסטוכימיה23. להעביר מעי ניתח יחיד לתוך צינור PCR 0.5 מ”ל המכיל 10 μL של מים סטריליים. חזור על הפעולה עבור סך של לפחות 5 צינורות PCR המכילים מעיים מבעלי חיים שונים. להקפיא את צינורות PCR ב -80 °C (5 °F) למשך מינימום של 5 דקות. מוציאים את צינורות ה-PCR מהמקפיא ומפשירים את הדגימות. Pipette את הנוזל למעלה ולמטה כמה פעמים כדי להפריד את החיידקים מן המעי. נהלו PCR באמצעות זוגות פריימר אוניברסליים כנגד רצף הדנ”א של תת-unit ריבוזומלי קטן של חיידקים, שמרים או מיקרוסורידיה, בהתאם לסוג המיקרואורגניזמים החשוד.הערה: לדוגמה, פרוטוקול מדגם באמצעות פריימרים אוניברסליים 16S חיידקי מוצג בטבלה 1. טהרו את האמפליקון באמצעות ערכת ניקוי וריכוז DNA מבוססת מסנן (ראו טבלת חומרים) ובצעו רצף של סנגר.