本文介绍了如何利用集成的多功能和用户可编程系统的详细逐步方案,该系统可实现自动多通道成像和机械生物学分析,以阐明Yes相关蛋白(YAP)的机械灵敏度。
活细胞的长期多功能成像和分析需要各种硬件和软件平台的简化功能协调。然而,手动控制不同制造商生产的各种设备是劳动密集型和耗时的,可能会降低所获取数据的准确性、可重复性和质量。因此,一个多合一和用户可编程的系统,能够实现自动,多功能和长期的图像采集,并与大多数荧光显微镜平台兼容,可以使科学界受益。本文介绍了利用新型集成软件系统的完整操作规程,该系统由(1)一个自制的软件程序组成,称为”自动多功能集成程序(AMFIP)”,可实现自动多通道成像采集,以及(2)一套定量成像分析和细胞牵引计算包。
该集成系统用于揭示CRISPR / Cas9工程人类正常细胞(B2B)和肺癌细胞(PC9)中机械敏感Yes相关蛋白(YAP)的时空分布与细胞力学(包括细胞扩散和牵引)之间以前未知的关系。利用该系统的多通道控制和读出能力,结果表明:(1)B2B正常细胞和PC9癌细胞在细胞扩散和迁移过程中显示出YAP表达,牵引和细胞动力学之间的明显关系;(2)PC9癌细胞在底物上施加明显的核周力。总之,本文提出了一个详细的逐步方案,说明如何利用集成的用户可编程系统,该系统能够实现自动多功能成像和分析,以阐明YAP机械灵敏度。这些工具为在细胞生理学和病理学背景下详细探索多方面的信号传导动力学开辟了可能性。
该方法的总体目标是实现活细胞的全光学多功能成像和分析。一体化成像程序可实现多功能光电器件的自动协调,将减少劳动密集型和容易出错的手动操作,对于研究人员进行长期活细胞成像至关重要1,2,3,4。然而,生物医学研究界现有的大多数公共项目要么仅适用于有限的光电子器件,要么需要额外的硬件来协调不同的设备5,6,7,8,9。最近,开发了一个基于软件的开源程序,名为”自动多功能集成程序(AMFIP)”,可实现多通道和延时成像。AMFIP基于Java语言和μManager11,12的应用程序编程接口(API),被开发为μManager中的一个插件,该插件执行定制的Java脚本,以完成多个光电硬件和软件平台(包括但不限于尼康平台)的基于软件的通信。AMFIP的建立为细胞行为的可编程和多功能询问开辟了可能性。本文建立了一种集成的实验和计算系统,将AMFIP与数字成像分析和细胞牵引力显微镜相结合。该系统能够阐明CRISPR / Cas9工程的人类正常B2B(图1)和肺癌PC9(图2)细胞系中不同的YAP机制生物学。该系统为科学界提供了一个全面的解决方案,避免了购买可能不适用于和/或与每个成像系统不兼容的额外控制设备的需求。
本文提出的方案介绍了如何(1)应用AMFIP对表达mNEonGreen2标记YAP的CRISPR / Cas9工程细胞系进行自动长期成像;(2)结合斐济ImageJ,MATLAB和Origin,根据其荧光强度(图3和图4),细胞位移场(图1C和图2C)和细胞牵引场(图1D和图2D)对YAP核/细胞质(N / C)比率进行定量分析).结果表明,(1)在具有生理相关机械刚度的底物上细胞扩散的前10小时内13,14,15,16,17,18,单个B2B细胞的YAP N / C比比与单个PC9细胞相比显示出更明显的时间依赖性变化和波动(图5和图6);(2)PC9癌细胞在其核周区域产生明显的牵引力(图7)。该协议中描述的集成系统和方法超越了特定类型的细胞和光遗传学分子。研究人员可以应用这些方案来定制其特定的活细胞询问实验,并在细胞生理学和病理学的背景下阐明多方面的信号传导动力学。
成像过程(步骤6.3)对于确保荧光图像具有足够好的质量以产生有效的定量结果至关重要。荧光蛋白或磁珠的z-stack图像应具有足够大的z范围,以包括样品跨越的所有Z位置的聚焦图像。另一个关键步骤是在溶解细胞后收集荧光珠的参考图像(步骤6.5)。由于参考图像需要在步骤6.3中的相同位置拍摄,因此不应在培养皿,环境室和显微镜之间引起相对位移。执行溶解步骤的调查人员必须小心地取下培养皿的盖子,并确保施加的机械扰动不足以改变培养皿在环境室中的位置。
下面提供了解决方案,以解决实验过程中可能发生的一些错误。如果在步骤 6.4 中单击 Enter 后未激活宏,则很可能是因为屏幕的左下角区域被非 Element 窗口占用。在这种情况下,需要清除窗口的左下角区域,以便在 Elements 中激活宏。另一个常见的错误是明场图像显示为黑色。这个问题是由获取荧光和明场图像之间的时间间隔不足引起的。荧光成像时间计数中的轻微延迟会随着时间的推移而累积,并导致相当大的延迟并干扰明场成像。一种解决方案是将所有位置的一个成像周期的持续时间调整为小于(不等于)连续运动开始之间的时间间隔。此操作将刷新时间计数,并消除每个映像周期开始时的累积误差。
这种全光学检测技术支持(1)广泛的硬件/软件,包括但不限于尼康,(2)不同类型的经过验证的水凝胶系统,包括明胶,PEG,基质凝胶和胶原蛋白I凝胶,以及(3)基于研究人员的不同需求的可编程定制。但是,如果商用显微镜无法提供任何底层控制功能,则使用AMFIP定制功能将变得具有挑战性。这种技术的另一个限制是样品在XY和焦点(Z)平面上的空间漂移。虽然在图像的后处理过程中可以克服这一限制,但必须改进自动对焦功能以校正样品的实时漂移。这种改进将提高成像过程的通量,并减少实验过程中漂移引起的潜在误差。
机电诊断器,如YAP,可以作为开发有前途的癌症疗法的新治疗靶点25,26,27。新出现的数据表明,YAP促进癌细胞的增殖和侵袭。力学诱导的YAP从细胞质到细胞核的易位激活了与细胞迁移,增殖,侵袭和凋亡相关的基因的转录,导致异常细胞行为28,29,30,31。这项工作旨在探索两种典型人肺癌和正常细胞系中YAP N / C比值与细胞力学的潜在相关性。在10小时细胞扩散期间,PC9细胞在细胞核和细胞质中显示出相似的YAP浓度(图3D和图5A)。B2B细胞在细胞核中显示出比细胞质中更高的YAP浓度(图3C和图5A)。在早期扩散阶段发现的这种关系与大多数已发表的研究结果不同,这些发现比较了正常细胞和癌细胞之间细胞核中的YAP浓度。虽然不一定处于早期扩散阶段,但大多数已发表的研究结果表明,YAP在癌细胞核中比在正常细胞核中更集中27,28。只有一项关于乳腺癌的研究报告了一个例外32,显示YAP更集中在细胞质中,这与我们目前在肺癌PC9细胞中的观察结果一致。据作者所知,这项工作是第一个在人类肺癌细胞系中显示较低的YAP N / C比率的工作。作者推测,PC9细胞中YAP N / C比率稳定的原因可能是由于细胞/细胞核扩散面积的低变化和PC9细胞在早期扩散阶段的牵引力。正在解剖PC9和B2B细胞中低YAP N / C比值的基础分子机制。
在铺展的前10小时内,这两个细胞系显示出YAP N / C比值,细胞牵引力和扩散面积之间的明显关系(图5)。对于B2B细胞,较高的YAP N / C比值与较高的细胞和细胞核扩散面积相关(图6A,B),这与其他正常细胞的报告数据一致33。有趣的是,尽管这种关系的发展趋势通常存在于所有记录的B2B细胞中,但发现了这种关系的两种不同程度(高和低)。同时扩散和迁移的B2B细胞表现出较低的牵引力和较高的细胞和细胞核扩散面积,YAP N / C比值较高(2.05±0.32)。对于扩散并保持在同一位置的B2B细胞,它们显示出更高的牵引力和较低的细胞和细胞核扩散面积,YAP N / C比值较低(1.74±0.21)。这两种度的关系在分叉的分散数据组中得到了证明(图6C,D)。如文献中报道的那样,静止的正常细胞,如胚胎成纤维细胞NIH 3T3细胞,具有比迁移细胞更高的牵引力34。本文报道的数据表明,扩散和非迁移的B2B细胞比扩散和迁移的B2B细胞具有更高的牵引力,可能表明非迁移细胞需要高牵引力才能在基质上稳定下来。
此外,这些数据表明,静止的正常B2B细胞产生更高的围核力,而其他研究人员之前的研究仅报告了在静止细胞外围产生的更高的细胞牵引力34,35,36,37。作者认为,实验中迁移的内在趋势的差异可能会导致这些矛盾的结果。在已发表的实验中,方形微图案被用来限制单个细胞的扩散并抑制迁移;细胞是否有迁移的倾向是未知的。由于迁移细胞通常在细胞的外围表现出高牵引力38,因此即使迁移受到限制,具有迁移倾向的细胞仍可能保持较高的外围牵引力。在本研究中,静止的细胞不受任何微模式的限制,但不迁移,这表明细胞倾向于维持其非迁移状态。另一种可能性是,由微图案定义的细胞形状可能会影响局灶粘附和牵引力的分布39。本研究的结果在没有任何限制性微图案的情况下产生,并代表了静止细胞在其原始形状中的力分布。
据作者所知,迄今为止只有一篇出版物专门报道了正常细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)中围核力的发现,这可能是由横跨细胞核的肌动蛋白帽引起的40。YAP细胞质到细胞核的易位与核周力的增加相关40。对相关文献的彻底搜索没有发现任何报道癌细胞中围核力或肌动蛋白帽的出版物。一项关于黑色素瘤癌细胞的间接研究表明,肌动蛋白边缘(另一个位于细胞核周围但不覆盖细胞核的核周组织)降低了细胞迁移率41,间接表明存在核周力。然而,没有直接的实验数据报告。在这项研究中,作者发现PC9和B2B细胞都显示出核周位移和牵引力。核力量的产生机制及其影响仍然存在争议。据报道,在正常细胞中,肌动蛋白帽在调节细胞核形态和染色质组织42中起作用,通过核骨架和细胞骨架(LINC)复合物43的连接子将机械信号从局灶粘附传递到细胞核中,并调节细胞迁移44。层粘连蛋白A / C与肌动蛋白帽的形成和破坏有关40,41,42,43,44。然而,声称肌动蛋白帽产生围核力的报告并未考虑肌动蛋白边缘40的潜在作用。在癌细胞中,层粘连蛋白A的过表达促进肌动蛋白边缘的形成并限制癌细胞迁移。层粘连蛋白B的过表达会减少肌动蛋白边缘的形成并促进迁移。由于核周围肌动蛋白组织的存在和层粘连蛋白A的影响,围核力可能参与这一过程。然而,这项研究的结果没有显示任何测量的围核力或肌动蛋白帽行为的证据。因此,在本研究中发现PC9细胞中的围核力是第一份显示肺癌细胞中围核力和位移的报告。作者目前正在研究CRISPR / Cas9工程PC9和B2B细胞中围核力的分子机制和功能。
除了本文所展示的全光学机械生物学询问之外,集成的多功能系统还可以应用于光学探测生命系统中无数其他重要的生理和病理信号。例如,作者的实验室最近建立了多个稳定转导的人癌细胞系,共表达三种光响应膜蛋白:膜电压指示剂QuasAr2(激发:640nm;发射:660nm-740nm),膜电压去极化器CheRiff(激发:488nm)和膜电压超极化器eNpHR3(激发:590nm)。这三种功能蛋白可以通过光谱正交激光线以无串扰的方式激活,从而实现膜电生理学的全光双向信号通信(读出和控制)。使用集成的光电子系统和手动膜片钳,作者验证了单个人类癌细胞和多细胞肿瘤球体中膜电压(Vm)的全光学控制和读数。全光电生理学询问为详细探索癌细胞中以前无法获得的生物电提供了可能性,这可能有助于从新轴上推进肿瘤生物学。
The authors have nothing to disclose.
该项目得到了UF健康癌症中心(X.T.和D.S.)的癌症试点奖和佳得乐奖启动包(X.T.)的财政支持。作者衷心感谢与Jonathan Licht博士(UFHCC),Rolf Renne博士(UFHCC),Ji-Hyun Lee博士(Biostatistics,UF),Hugh Fan博士(MAE,UF),Warren Dixon博士(MAE,UF),Ghatu Subhash博士(MAE,UF),Mark Sheplak博士(MAE和ECE,UF),Malisa Sarntinoranont博士(MAE,UF),Scott Banks博士(MAE,UF)的智力讨论和技术支持。 UF),Matthew Traum博士(MAE,UF),David Hahn博士(亚利桑那大学),王伟宏博士(甲骨文公司),Tan优华博士(香港理工大学)以及尼康的支持团队(Jose Serrano-Velez博士,Larry Kordon博士和Jon Ekman博士)。作者非常感谢Tang’s,Siemann’s和Guan研究实验室的所有成员以及MAE&ECE和物理与放射肿瘤科(UF)的所有工作人员的慷慨和有效的支持。
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-aldrich | 440140 | |
0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
8 Benchtop Centrifuge | Thermo | 75007210 | |
A1R confocal system | Nikon | HD25 | |
Acetic acid | Sigma-aldrich | 695092 | glacial, ACS reagent, ≥99.7% |
BEAS-2B (B2B) cells | Sigma-aldrich | 95102433 | human epithelial cells from lung tissue |
Carboxylate-Modified Microspheres | Invitrogen | F8797 | |
Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
Desktop Computer | Dell | 2018 | with Windows 10 operating system |
Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | 1.53k | |
Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
HEPES buffered saline | Sigma-aldrich | 51558 | |
Hydrazine hydrate solution | Sigma-aldrich | 53847 | |
IntelliJ IDEA | JetBrains | 2020 | Java development platform |
Java Development Kit | Oracle | 14.0 | |
Kimwipe | Kimtech Science | 3066-05 | |
MATLAB | MathWorks | 2020b | |
Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-218 | |
N,N′-Methylenebisacrylamide solution | Sigma-aldrich | M1533 | |
NIS-Elements software platform | Nikon | 4.50 | software platform |
Origin | OriginLab | OriginPro 2017 (Learning Edition) | data analysis and graphing software |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
PC9 cells | Sigma-aldrich | 90071810 | human adenocarcinoma cells from lung tissue |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-553S | high-fidelity DNA polymerase |
Scotch tape | Scotch | adhesive tape | |
Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-aldrich | 05030 | |
Super glue | Gorilla | cyanoacrylate glue | |
Ti2-E inverted microscope | Nikon | MEA54000 | |
TI2-S-SE-E Motorized Stage with Encoder | Nikon | MEC56120 | |
μManager | version 2.0 gamma | open source microscopy software (https://micro-manager.org/) |