Yeni İzole Edilmiş Fare Hepatositlerinin Süspansiyonunda Yağ Asidi β-Oksidasyonunun Ölçülmesi

Yağ asidi β-oksidasyonu, lipid metabolizmasında önemli bir süreçtir ve yağ asidi sentezini ve diyetten alımını dengelemek için katabolik bir yol sağlar. Bu süreç, kalp kası, böbrek korteksi ve oruç tutmuş karaciğer dahil olmak üzere birçok organ için enerji üretir ve diyet, yağ dokusu lipolizi ve iç trigliserit depolarından elde edilen yağ asitlerini kullanır ^1,2.

Yağ asidinin β-oksidasyon yolundan oksidasyonu, yağ açil zincirinin bir seferde iki karbon tarafından sırayla kısalmasına neden olur, asetil-CoA olarak salınır ve bu işlem hem mitokondride hem de peroksizomlarda gerçekleşir. Çoğu yağ asidi sadece β oksidasyona uğrarken, bazıları bu yola girmeden önce farklı karbonlarda oksitlenir. Örneğin, fitanik asit gibi 3-metil ikame edilmiş yağ asitleri, α-oksidasyon yoluna girmeden önce peroksizomlarda β-oksidasyon ile bir karbonun uzaklaştırılmasına uğrar. Benzer şekilde, bazı yağ asitleri ilk önce endoplazmik retikulumdaki terminal metil grubunun (ω-oksidasyon) oksidasyonu ile dikarboksilik yağ asitlerine dönüştürülür ve tercihen peroksizomlarda β-oksidasyon³ ile oksitlenir.

Spesifik organelden bağımsız olarak, bir yağ asidi önce β-oksidasyon yolundan oksitlenmek üzere bir koenzim A (CoA) tiyoesterine veya açil-CoA’ya dönüştürülmelidir. β-Mitokondriyal matriksteki uzun zincirli açil-CoAs’ın oksidasyonu, translokasyonları için karnitin mekiğine ihtiyaç duyar, burada karnitin palmitoyltransferaz 1 (CPT1), açil-CoAs’ın asilkarnitinlere dönüşümünü katalize eder ve bu işlemde hız sınırlayıcı enzimdir⁴. Mitokondriyal matrise aktarıldıktan sonra, açil-CoAs yeniden oluşturulur ve mitokondriyal β-oksidasyon makineleri için substratlar olarak işlev görür. Oruç tutulan durumda, hepatik mitokondride β-oksidasyon yoluyla üretilen asetil-CoA öncelikle ketogeneze kanalize edilir. Peroksizomlar, çok uzun zincirli, dallı zincirli ve dikarboksilik yağ asitlerinin β oksidasyonu için birincil bölge olarak işlev görür. Peroksizomlar, karnitin mekiğinin yağ asidi substratlarını ithal etmesini gerektirmez, bunun yerine ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları ABCD1-3^5’in aktivitesi yoluyla karşılık gelen açil-CoAs’ı ithal eder. Peroksizomlar içinde, açil-CoA’lar daha sonra mitokondriyal yağ asidi β-oksidasyon makinesinden farklı olarak özel bir enzim seti tarafından oksitlenir. Hem mitokondri hem de peroksizomlar, yağlı açil zincirlerini oksitlemek için NAD ⁺ ve serbest CoA tedariki gerektirir. Karaciğerdeki CoA seviyelerinin, açlığa yanıt olarak arttığı ve bu durumda meydana gelen yağ asidi oksidasyon oranının artmasını desteklediği gösterilmiştir⁶. Ayrıca, peroksizomlarda artan CoA bozunumu, peroksizomal yağ asidi oksidasyonunda seçici bir azalmaya neden^{olur 7}. Bu nedenle, hücre içindeki yağ asidi oksidasyon süreci, yağ asitlerinin aktivasyonu, taşınması ve oksidasyonunda yer alan enzimlerin ekspresyon seviyeleri ve aktivitelerinin yanı sıra çoklu hücre altı bölmeler boyunca kofaktörlerin ve diğer metabolitlerin konsantrasyonları ile düzenlenir.

Yağ asidi oksidasyonunu ölçmek için doku homojenatları kullanan prosedürler, bu süreci düzenleyen ve destekleyen hücresel mimariyi tahrip eder ve bu da in vivo metabolizmayı doğru bir şekilde yansıtmayan bir veri toplanmasına yol açar. Kaplanmış primer hepatositleri kullanan teknikler bu sistemi korurken, izole hücrelerin uzun süre kültürlenmesi, hala hayvan içinde yaşarken hücrelerde bulunan in vivo gen ekspresyon profilinin kaybına neden olur ^8,9. Aşağıdaki protokol, primer hepatositleri izole etmek ve [^1-14C] palmitik asit kullanarak, izolasyondan hemen sonra ve süspansiyonda yağ asidi β-oksidasyon kapasitelerini test etmek için bir yöntemi açıklamaktadır. Tahlil, asitte çözünür metabolitler (ASM) veya [1-14 C] palmitik asit^10,11’in β-oksidasyonu ile üretilen asetil-CoA gibi ürünlerle ilişkili radyoaktivitenin ölçümüne ^{dayanmaktadır.}