قياس الأحماض الدهنية β الأكسدة في تعليق خلايا الكبد الفئران المعزولة حديثا
Summary
الأحماض الدهنية β الأكسدة هو مسار استقلابي أساسي مسؤول عن توليد الطاقة في العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، بما في ذلك خلايا الكبد. هنا ، نصف طريقة لقياس أكسدة β الأحماض الدهنية في خلايا الكبد الأولية المعزولة حديثا باستخدام 14حمض بالمتيك المسمى C.
Abstract
الأحماض الدهنية β الأكسدة هو مسار استقلابي رئيسي لتلبية متطلبات الطاقة في الكبد وتوفير الركائز والعوامل المساعدة لعمليات إضافية ، مثل تكوين الكيتون وتكوين الجلوكوز ، والتي تعد ضرورية للحفاظ على توازن الجلوكوز في الجسم كله ودعم وظيفة العضو خارج الكبد في حالة الصيام. يحدث أكسدة β الأحماض الدهنية داخل الميتوكوندريا والبيروكسيزومات ويتم تنظيمها من خلال آليات متعددة ، بما في ذلك امتصاص وتنشيط الأحماض الدهنية ، ومستويات التعبير عن الإنزيم ، وتوافر العوامل المساعدة مثل الإنزيم المساعد A و NAD +. في الفحوصات التي تقيس أكسدة الأحماض الدهنية β في متجانسات الكبد ، يخفي تحلل الخلايا والإضافة الشائعة للمستويات فوق الفسيولوجية للعوامل المساعدة آثار هذه الآليات التنظيمية. علاوة على ذلك ، من الصعب التحكم في سلامة العضيات في المتجانسات ويمكن أن تختلف اختلافا كبيرا بين المستحضرات. قياس الأحماض الدهنية β الأكسدة في خلايا الكبد الأولية السليمة يتغلب على المزالق المذكورة أعلاه. يصف هذا البروتوكول طريقة لقياس أكسدة الأحماض الدهنية β في تعليق خلايا الكبد الأولية للفئران المعزولة حديثا والمحتضنة ب 14حمض بالمتيك المسمى C. من خلال تجنب ساعات إلى أيام من الثقافة ، تتمتع هذه الطريقة بميزة الحفاظ بشكل أفضل على مستويات التعبير عن البروتين ونشاط المسار الأيضي للكبد الأصلي ، بما في ذلك تنشيط الأحماض الدهنية β الأكسدة التي لوحظت في خلايا الكبد المعزولة من الفئران الصائمة مقارنة بالفئران التي تم إطعامها.
Introduction
الأحماض الدهنية β الأكسدة هي عملية أساسية في استقلاب الدهون ، مما يوفر مسارا تقويضيا لتحقيق التوازن بين تخليق الأحماض الدهنية وتناولها من النظام الغذائي. تولد هذه العملية الطاقة لأعضاء متعددة ، بما في ذلك عضلة القلب وقشرة الكلى والكبد الصائم ، وتستخدم الأحماض الدهنية التي تم الحصول عليها من النظام الغذائي ، وتحلل الدهون في الأنسجة الدهنية ، ومخازن الدهون الثلاثية الداخلية 1,2.
تؤدي أكسدة الأحماض الدهنية من خلال مسار أكسدة β إلى تقصير متسلسل لسلسلة الأسيل الدهني بواسطة كربونين في وقت واحد ، يتم إطلاقهما على شكل أسيتيل CoA ، وتحدث هذه العملية في كل من الميتوكوندريا والبيروكسيزومات. في حين أن معظم الأحماض الدهنية تخضع فقط β الأكسدة ، فإن بعضها يتأكسد عند كربونات مختلفة قبل الدخول في هذا المسار. على سبيل المثال ، تخضع الأحماض الدهنية التي يستبدلها 3 ميثيل ، مثل حمض الفيتانيك ، لإزالة كربون واحد عن طريق أكسدة α في البيروكسيزومات قبل الدخول في مسار أكسدة β. وبالمثل ، يتم تحويل بعض الأحماض الدهنية أولا إلى أحماض دهنية ثنائية الكربوكسيل عن طريق أكسدة مجموعة الميثيل الطرفية (ω-oxidation) في الشبكة الإندوبلازمية قبل أن تتأكسد بشكل تفضيلي في البيروكسيزومات عن طريق أكسدة β3.
بغض النظر عن العضية المحددة ، يجب أولا تحويل الحمض الدهني إلى ثيوستر مساعد للإنزيم A (CoA) ، أو acyl-CoA ، ليتم أكسدته من خلال مسار أكسدة β. β-أكسدة الأسيل CoAs طويل السلسلة في مصفوفة الميتوكوندريا يتطلب مكوك كارنيتين لنقلها ، حيث يحفز كارنيتين بالميتويل ترانسفيراز 1 (CPT1) تحويل acyl-CoAs إلى acylcarnitines وهو الإنزيم الذي يحد من المعدل في هذه العملية4. بمجرد نقلها إلى مصفوفة الميتوكوندريا ، يتم إعادة تشكيل acyl-CoAs وتعمل كركائز لآلية أكسدة β الميتوكوندريا. في حالة الصيام ، يتم توجيه الأسيتيل CoA الناتج عن طريق أكسدة β في الميتوكوندريا الكبدية في المقام الأول إلى تكوين الكيتون. تعمل البيروكسيزومات كموقع أساسي للأكسدة β للأحماض الدهنية طويلة السلسلة والمتفرعة السلسلة وثنائية الكربوكسيل. لا تتطلب البيروكسيزومات مكوك الكارنيتين لاستيراد ركائز الأحماض الدهنية ، وبدلا من ذلك استيراد المراسل acyl-CoAs من خلال نشاط ناقلات الكاسيت المرتبطة ب ATP (ABC) ABCD1-35. داخل البيروكسيزومات ، يتم بعد ذلك أكسدة acyl-CoAs بواسطة مجموعة مخصصة من الإنزيمات ، متميزة عن الأحماض الدهنية الميتوكوندريا β الأكسدة. تتطلب كل من الميتوكوندريا والبيروكسيزومات أيضا إمدادات من NAD+ و CoA مجانا لأكسدة سلاسل الأسيل الدهنية. وقد ثبت أن مستويات CoA في الكبد تزداد استجابة للصيام ، مما يدعم زيادة معدل أكسدة الأحماض الدهنية التي تحدث في هذه الحالة6. علاوة على ذلك ، تؤدي زيادة تدهور CoA في البيروكسيزومات إلى انخفاض انتقائي في أكسدة الأحماض الدهنية البيروكسيسومية7. لذلك ، يتم تنظيم عملية أكسدة الأحماض الدهنية داخل الخلية من خلال مستويات التعبير وأنشطة الإنزيمات المشاركة في تنشيط ونقل وأكسدة الأحماض الدهنية ، وكذلك تركيزات العوامل المساعدة والمستقلبات الأخرى في جميع أنحاء مقصورات متعددة دون الخلايا.
الإجراءات التي تستخدم متجانسات الأنسجة لقياس أكسدة الأحماض الدهنية تدمر البنية الخلوية التي تنظم وتدعم هذه العملية ، مما يؤدي إلى جمع البيانات التي لا تعكس بدقة عملية التمثيل الغذائي في الجسم الحي. في حين أن التقنيات التي تستخدم خلايا الكبد الأولية المطلية تحافظ على هذا النظام ، فإن زراعة الخلايا المعزولة لفترات طويلة من الزمن تؤدي إلى فقدان ملف التعبير الجيني في الجسم الحي الذي كان موجودا في الخلايا عندما كانت لا تزال تعيش داخل الحيوان 8,9. يصف البروتوكول التالي طريقة لعزل خلايا الكبد الأولية وفحص قدرتها على أكسدة الأحماض الدهنية مباشرة β بعد العزل وفي التعليق ، باستخدام [1-14C] حمض البالمتيك. يعتمد الفحص على قياس النشاط الإشعاعي المرتبط بمستقلبات الحمض القابلة للذوبان (ASM) أو المنتجات ، مثل الأسيتيل CoA ، التي تنتجها الأكسدة β [1-14C] حمض البالمتيك10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
أثناء تروية الكبد ، من الأهمية بمكان تجنب إدخال فقاعات الهواء ، لأنها تمنع الشعيرات الدموية الدقيقة في الكبد ، مما يمنع أو يقيد الدورة الدموية العازلة ويقلل بشكل عام من غلة خلايا الكبد وقابليتها للحياة20,21. يمكن للاحتياطات ، مثل فحص خط المدخل المملوء بالمخز?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R35GM119528 إلى روبرتا ليوناردي.
Materials
| (R)-(+)-Etomoxir sodium salt | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL | American Radiolabeled Chemicals | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, sterile | Corning | 25060CI | |
| 10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips | |||
| 5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes | |||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | CellTreat | 229421 | |
| 70% Perchloric acid | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, fatty acid-free | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 dihydrate | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile | CellTreat | 229707 | |
| Gentamicin sulphate | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
| HDPE, 6.5 mL scintillation vials | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
| Hemocytometer | |||
| Hypodermic needles 22 G, 1.5 in | BD Biosciences | 305156 | |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin |
| M199 medium | MilliporeSigma | M5017 | |
| MgSO4 heptahydrate | MilliporeSigma | M1880 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | 424270010 | |
| Palmitic acid | MilliporeSigma | P0500 | |
| Penicillin/streptomycin (100x) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| Positive displacement pipette MR-10, 10 µL | Mettler Toledo | 17008575 | |
| Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes | Eppendorf | 5810 R | |
| Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD cocktail | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| Shaking water bath, 30 L capacity | New Brunswick Scientific | Model G76 | |
| Sterile cell strainers, 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Thumb Dressing Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Variable-flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 138762 | |
| Water baths, 2–2.5 L capacity |
Riferimenti
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. Triglyceride Metabolism in the Liver. Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).
- Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation. Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).
- Kerner, J., Hoppel, C. Fatty acid import into mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).
- Baker, A., et al. Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PloS One. 5 (6), 11107 (2010).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).
- Richert, L., et al. Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).
- Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture. Clinical Chemistry. 30 (12), 2053-2058 (1984).
- Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures. Biochemical Journal. 323, 119-122 (1997).
- Consitt, L. A., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals. Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).
- Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases. Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs. Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets. Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).
- Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).
- Hakvoort, T. B., et al. Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).
- Sokolovic, M., et al. The transcriptomic signature of fasting murine liver. BMC Genomics. 9, 528 (2008).
- Kersten, S., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting. Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Ng, I. C., et al. Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).
- Bougarne, N., et al. PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
