Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Yetişkin Fare Böbreğinden Çekirdek İzolasyonu
Summary
Burada, medüller böbrek hücresi tiplerinin temsilini geliştiren ve enzimatik doku ayrışmasından kaynaklanan gen ekspresyon artefaktlarını önleyen donmuş fare böbreklerinden yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Böbrekler su, elektrolit ve asit-baz homeostazı gibi çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Böbreğin fizyolojik fonksiyonları, organın kortikomedüller ekseni boyunca karmaşık bir mimaride düzenlenmiş çoklu hücre tipleri tarafından yürütülür. Tek hücreli transkriptomiklerdeki son gelişmeler, böbrek fizyolojisi ve hastalığında hücre tipine özgü gen ekspresyonunun anlaşılmasını hızlandırmıştır. Bununla birlikte, tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) için sıklıkla kullanılan enzim bazlı doku ayrışma protokolleri, çoğunlukla taze (arşivlenmemiş) doku gerektirir, transkripsiyonel stres tepkileri verir ve böbrek korteksinin bol hücre tiplerinin seçimini destekler, bu da medulla hücrelerinin yetersiz temsiline neden olur.
Burada, bu sorunları önleyen bir protokol sunuyoruz. Protokol, donmuş böbrek dokusundan 4 ° C’de çekirdek izolasyonuna dayanmaktadır. Çekirdekler, korteks, dış medulla ve iç medulladan oluşan fare böbreğinin merkezi bir parçasından izole edilir. Bu, medüller hücrelerin yararı için tüm böbrek örnekleri için tipik olan kortikal hücrelerin aşırı temsilini azaltır, böylece veriler tüm kortikomedüller ekseni yeterli miktarda temsil eder. Protokol basit, hızlı ve uyarlanabilir ve böbrek araştırmalarında tek çekirdekli transkriptomiklerin standardizasyonuna yönelik bir adım sağlar.
Introduction
Böbrekler oldukça karmaşık bir doku mimarisi sergiler. Bir kortikomedüller eksen boyunca fonksiyonel ve anatomik olarak farklı segmentlerden oluşurlar ve hücre dışı sıvı hacminin düzenlenmesi, elektrolit dengesi veya asit-baz homeostazı1 gibi biyolojik fonksiyonlara aracılık ederler.
Tek hücreli transkriptomiklerdeki ilerlemeler, kompleks dokuların derinlemesine karakterizasyonunu sağlamış ve renal fizyoloji, gelişim ve hastalıkta segment ve hücre tipine özgü gen ekspresyonunun anlaşılmasını hızlandırmıştır 2,3,4.
Bununla birlikte, scRNA-seq için sıklıkla kullanılan enzim bazlı ayrışma protokolleri çeşitli dezavantajlar ve kısıtlamalar göstermektedir. Protokole bağlı olarak, transkripsiyonel stres yanıtları ve daha kolay ayrışması kolay kortikal hücre tiplerine yönelik doku ayrışma önyargısı üretirler 5,6. Embriyonik böbrekler için soğuk-aktif proteazlar kullanan protokoller strese bağlı transkripsiyonel değişiklikleri hafifletebilse de, kortikal hücrelere yönelik ayrışma yanlılığının üstesinden gelemeyebilir ve farklı hastalıklı böbrek dokularına kolayca adapte olamayabilirler7. Ek olarak, tek hücreli yaklaşımlar dondurulmuş doku örnekleriyle kolayca uyumlu değildir, bu da uygulamalarını çoğunlukla arşivlenmemiş, taze dokularla sınırlandırır, böylece doku toplamayı kısıtlayıcı bir faktör6 haline getirir.
Tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNA-seq) bu sınırlamaları aşabilir 8,9. Burada, dondurulmuş yetişkin fare böbrek dokusunun merkezi bir diliminden çekirdek izolasyonu için bir protokol sunuyoruz (Şekil 1)10. Protokolümüz basittir ve güçlü bölgesel doku değişiklikleri içermeyen deneysel modeller için çeşitli böbrek hücresi tiplerinin dengeli bir temsili ile RNA dizileme kütüphaneleri elde etmek için standartlaştırılmış bir yaklaşım sağlar. İkinci durumda, protokolümüz tüm böbreklerle de gerçekleştirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tek hücreli transkriptomikler, böbrek fizyolojisi ve hastalığında hücre tipine özgü gen ekspresyonunun anlaşılmasını ilerletir. Burada, snRNA-seq için yüksek kaliteli tek çekirdekleri dondurulmuş fare böbrek dokusundan standart bir şekilde izole etmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sağladık.
snRNA-seq için, kütüphane üretimi için girdi olarak yüksek kaliteli çekirdeklerin kullanılması ve doku işleme sırasında RNA bozulmasının önlenmesi çok önemlidir. Bu nedenle, diseksiyondan hemen sonra RNA stabilizasyon çözeltisinde doku parçalarının inkübasyonu, hücresel RNA’yı korumak ve stabilize etmek için gereklidir ve numunelerin süresiz olarak – 80 ° C’de saklanmasına izin verir. Bu protokolü, arşiv materyali gibi RNA stabilizasyon çözeltisi tedavisi olmadan dondurulmuş dokuya uygularken, bir deneme çalışması gereklidir ve RNA stabilizasyon çözeltisinde önceden inkübasyon yapılmadan dondurulmuş dokuda önemli bir RNA bütünlüğü kaybı gözlemlediğimiz için RNA kalitesinin değerlendirilmesi gerekir.
Genel olarak, uygun numune işleme, bozulmamış, tek çekirdeklerin geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için çok önemlidir. Tüm yeniden süspansiyon adımları, kayma stresini ve fiziksel hasarı önlemek için dikkatlice pipetle pipetlenerek gerçekleştirilmelidir. Son çekirdek ressüspansiyonu ve çekirdek ayıklama için tamponlar, çekirdek kaybını ve kümelenmesini önlemek için BSA içermelidir.
Bu protokoldeki tampon hacimleri çok küçük doku örnekleri (~ 15 mg) için optimize edilmiştir. Yüksek kaliteli süspansiyonlar oluşturmak için tam hücre lizisi ve yeterli yıkama sağlamak çok önemlidir. Daha büyük doku blokları veya tüm böbrek örnekleri, kümelenme ve agregasyona, yüksek miktarda ortam RNA’sına ve genel olarak düşük süspansiyon kalitesine yol açan aşırı çekirdek konsantrasyonlarına neden olacaktır. Daha büyük numuneler veya diğer dokular işlenirse, minimum ortam RNA seviyeleri için en uygun tampon hacimlerini belirlemek için deneme çalışmaları yapılması şiddetle tavsiye edilir. Çekirdek ve RNA kalitesi ve konsantrasyonları, aşırı yüklenmenin genel olarak düşük performansa neden olması nedeniyle dikkatlice incelenmelidir.
Ek olarak, tek çekirdeklerle ilişkili olmayan yüksek seviyelerde ortam RNA’sına neden olan büyük miktarda hücre kalıntısı, dizileme sonuçlarını olumsuz yönde etkiler. Çekirdek süspansiyonunun bir sakkaroz yastığı yoluyla santrifüjleme yoluyla açıklığa kavuşturulması bu sorunu bir dereceye kadar hafifletir, ancak aynı zamanda, örneğin bağışıklık hücrelerinde bulunan yoğun, küçük çekirdeklere karşı karşı seçim yaparak hücre tipi temsilinde önyargıya yol açabilir16. Bu endişe vericiyse, sakkaroz gradyanı ihmal edilmelidir. Buna karşılık, DAPI boyamasına dayalı akış sitometrisinin, yüksek kaliteli bir tek çekirdek süspansiyonu üretmek için hücre kalıntıları miktarını azaltmak için kritik olduğunu bulduk.
Tek çekirdeklerin izolasyonu, tek hücreli yaklaşımlara kıyasla önemli avantajlara sahiptir8. Düzgün dondurulmuş doku ile uyumludur, doku koleksiyonunu daha esnek hale getirir ve transkripsiyonelstres yanıtlarını 6,17 getirebilen enzim bazlı doku ayrışması ihtiyacını ortadan kaldırır. Ayrıca, renal korteksin kolayca ayrışabilen hücre tiplerinin seçimini destekleyen ayrışma yanlılığının üstesinden gelir, bu da bazı enzim bazlı yaklaşımlarda medüller hücre tiplerinin yetersiz temsiline yol açabilir 5,6,10.
Tüm böbrek dokusu yerine merkezi bir böbrek parçası kullanmak, kaynakları daha da korur ve daha önce açıklandığı gibi bol miktarda hücre tipinin aşırı temsilini düzeltir10. Bununla birlikte, araştırılan fare modeline veya fenotipe bağlı olarak, tek bir orta dilim yerine bütün böbrek örneklerinin kullanılması faydalı olabilir. Tüm böbrek örnekleri, gerçek hücre oranlarını veya tüm böbrekte meydana gelen değişiklikleri daha iyi temsil edebilirken, kesilmiş bir orta dilim, medüller fenotipler için veya numune materyali sınırlı olduğunda avantajlı olduğunu kanıtlamıştır. Bu nedenle, bu karar son derece kullanıcıya özgüdür ve dikkatlice düşünülmelidir.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Teknik destek için Berlin’deki Helmholtz Derneği’ndeki Max Delbrück Moleküler Tıp Merkezi’ndeki Bilimsel Genomik Platformuna teşekkür ederiz.
JL ve KMSO, Alman Araştırma Vakfı (DFG) Araştırma Eğitim Grubu GRK 2318 ve Araştırma Birimi FOR 2841 tarafından desteklenmiştir. KMSO, Collaborative Research Grant 1365 tarafından desteklenmiştir. AB, NR’ye verilen DFG’nin Gottfried Wilhelm Leibniz Ödülü’nün finansmanıyla desteklendi.
Materials
| Cell sorter | – | – | For fluorescence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter. |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000015 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | Needs to contain DAPI light cube to count nuclei. Alternatively, nuclei can be counted manually under fluorescence microscope. |
| 4′,6-Diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI) | Biotrend | 40043/b | Stock solution prepared with a concentration of 100 µM. Used for nuclei staining in a final concentration of 2 µM. |
| D(+)-Sucrose ≥99.9%, ultrapure DNAse-, RNAse-free | VWR | 0335-500G | |
| DNA LoBind Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22431021 | |
| Ethanol, 70 % | – | – | |
| FACS tubes | pluriSelect | 43-10100-46 | |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma-Aldrich | D8938-1SET | |
| Minisart Syringe Filters 0.2 µm | Sartorius | 16534-GUK | |
| Nuclease-free Water | Invitrogen | AM9937 | |
| Nuclei EZ Prep Nuclei Isolation Kit | Sigma-Aldrich | NUC-101 | Nuclei EZ Lysis Buffer (Product No. N3408) needed for buffer preparation. |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) 1X without calcium or magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Petri dishes, polystyrene 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| pluriStrainer Mini 100 µm | pluriSelect | 43-10100-46 | |
| pluriStrainer Mini 20 µm | pluriSelect | 43-10020-40 | |
| pluriStrainer Mini 40 µm | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| Polystyrene Centrifuge Tube (15 mL) | Falcon | 352099 | |
| Razor blades | – | – | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | EO0384 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | Follow manufacturer's instructions (https://international.neb.com/products/s1402-ribonucleoside-vanadyl-complex#Product%20Information). Upon use the 200 mM stock solution is reconstituted to a green-black clear solution by incubating at 65 °C. |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | |
| RNase AWAY | Fisher Scientific | 11952385 |
Riferimenti
- Thomas, R. S. Kidney modeling and systems physiology. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 1 (2), 172-190 (2009).
- Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
- Park, J., Liu, C. L., Kim, J., Susztak, K. Understanding the kidney one cell at a time. Kidney International. 96 (4), 862-870 (2019).
- Clark, A. R., Greka, A. The power of one: advances in single-cell genomics in the kidney. Nature Reviews Nephrology. 16 (2), 73-74 (2020).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- Muto, Y., et al. Single cell transcriptional and chromatin accessibility profiling redefine cellular heterogeneity in the adult human kidney. Nature Communications. 12 (1), 2190 (2021).
- Hinze, C., et al. Kidney single-cell transcriptomes predict spatial corticomedullary gene expression and tissue osmolality gradients. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (2), 291 (2021).
- Berger, S. L. Isolation of cytoplasmic RNA: ribonucleoside-vanadyl complexes. Methods in Enzymology. 152, 227-234 (1987).
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Park, J., et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease. Science. 360 (6390), 758-763 (2018).
- Kirita, Y., Wu, H., Uchimura, K., Wilson, P. C., Humphreys, B. D. Cell profiling of mouse acute kidney injury reveals conserved cellular responses to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15874-15883 (2020).
- Schneeberger, S., et al. The neuroinflammatory interleukin-12 signaling pathway drives Alzheimer’s disease-like pathology by perturbing oligodendrocyte survival and neuronal homeostasis. bioRxiv. , 441313 (2021).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
