Cuantificación de los niveles de alteración morfológica y degeneración de la neurona dopaminérgica en Caenorhabditis elegans
Summary
En este artículo, mostramos cómo usar un sistema de puntuación de siete puntos para cuantificar consistentemente los cambios en la morfología de la dendrita de la neurona dopaminérgica en C. elegans. Este sistema está destinado a análisis de ensayos de neurodegeneración dopaminérgica utilizando modelos genéticos, químicos y basados en la edad de trastornos neurodegenerativos.
Abstract
La pérdida de neuronas dopaminérgica está involucrada en la patología de la enfermedad de Parkinson (EP), un trastorno neurodegenerativo altamente prevalente que afecta a más de 10 millones de personas en todo el mundo. Dado que muchos detalles sobre la etiología de la EP siguen siendo desconocidos, se necesitan estudios que investiguen los contribuyentes genéticos y ambientales a la EP para descubrir métodos de prevención, manejo y tratamiento. La caracterización adecuada de la pérdida neuronal dopaminérgica puede ser relevante no solo para la investigación de la EP, sino también para otros trastornos neurodegenerativos cada vez más prevalentes.
Existen modelos genéticos y químicos establecidos de neurodegeneración dopaminérgica en el sistema modelo Caenorhabditis elegans, con fácil visualización de la neurobiología apoyada en la transparencia de los nematodos y la arquitectura neuronal invariante. En particular, los cambios morfológicos de las neuronas dopaminérgicas de C. elegans se pueden visualizar utilizando cepas con reporteros fluorescentes impulsados por promotores específicos de la célula, como el gen transportador de dopamina dat-1, que se expresa exclusivamente en sus ocho neuronas dopaminérgicas.
Con las capacidades de este sistema modelo y la tecnología adecuada, muchos laboratorios han estudiado la neurodegeneración dopaminérgica. Sin embargo, hay poca consistencia en la forma en que se analizan los datos y gran parte de la literatura actual utiliza análisis de puntuación binaria que capturan la presencia de degeneración, pero no los detalles completos de la progresión de la pérdida de neuronas. Aquí, introducimos un sistema de puntuación universal para evaluar los cambios morfológicos y la degeneración en las dendritas de las neuronas cefálicas de C. elegans. Esta escala de siete puntos permite el análisis a través de una gama completa de morfología de dendritas, que van desde neuronas sanas hasta la pérdida completa de dendritas, y considerando detalles morfológicos que incluyen torceduras, ramificaciones, ampollas y roturas. Con este sistema de puntuación, los investigadores pueden cuantificar cambios sutiles relacionados con la edad, así como cambios más dramáticos inducidos por productos químicos. Finalmente, proporcionamos un conjunto de imágenes de práctica con comentarios que se pueden usar para entrenar, calibrar y evaluar la consistencia de puntuación de los investigadores nuevos en este método. Esto debería mejorar la consistencia dentro y entre el laboratorio, aumentando el rigor y la reproducibilidad.
Introduction
La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa cada vez más común que afecta a hasta 10 millones de personas en todo el mundo1. Los hombres y las personas mayores tienen un mayor riesgo de desarrollar EP; la edad media de inicio de la enfermedad es de 60 años, y la incidencia de EP sube de una incidencia del 0,3% en la población general al 3% en individuos mayores de 80 años1,2. Aunque los detalles de la patología de la EP no se comprenden completamente, este trastorno progresivo implica la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la región de la sustancia negra del mesencéfalo. Los mecanismos hipotizados de esta pérdida neuronal implican disfunción mitocondrial, estrés oxidativo e inflamación2. Las causas y los factores de riesgo de la enfermedad aún se están explorando, pero implican una combinación de factores ambientales y genéticos1. Por ejemplo, los estudios han encontrado asociaciones positivas entre el uso de pesticidas de por vida y la EP, así como la susceptibilidad genética a la EP familiar1,3.
El sistema modelo de C. elegans, desarrollado originalmente en parte para la investigación en neurobiología4,es muy adecuado para evaluar la pérdida de neuronas dopaminérgicas in vivo. Nass y sus colegas fueron pioneros en el usode C. elegans para la neurodegeneración dopaminérgica5,y muchos grupos han adoptado desde entonces el gusano como un modelo exitoso para la EP y la disfunción dopaminérgica6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19,20. C. elegans son buenos modelos de enfermedades neurodegenerativas por muchas de las mismas razones por las que son un organismo modelo tan popular para otras áreas de la biología; su transparencia permite el estudio in vivo de los procesos celulares, la manipulación genética en gusanos es relativamente rápida y fácil, tienen un corto tiempo de generación de unos tres días, y son fáciles de mantener21. La mayoría de los modelos de gusanos de EP se dividen en una de tres categorías: modelos basados en la edad, modelos químicos y modelos genéticos. La capacidad de sincronizar una población de gusanos permite el estudio de la neurodegeneración relacionada con la edad para un modelo basado en la edad de enfermedades neurodegenerativas asociadas con el envejecimiento, como LA EP22. Las exposiciones químicas que inducen defectos neuronales similares a la EP se han establecido utilizando una variedad de productos químicos que incluyen 6-hidroxidopamina (6-OHDA), rotenona y 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP)22. Los gusanos también se utilizan con éxito como modelos genéticos de EP; las cepas con knockouts de genes neurales seleccionados pueden modelar varias enfermedades neurodegenerativas1,4. Las combinaciones de factores genéticos y ambientales, o “interacciones gen-ambiente”, que probablemente juegan unpapel importante en la EP2,17,23,24,25,26,27,28,han sido examinadas por varios grupos que usan C. elegans. Finalmente, también se ha observado neurodegeneración dopaminérgica relacionada conlaedad29,30. Si se utiliza una cepa transgénica neural apropiada en imágenes fluorescentes, cualquiera de estos modelos de gusanos de EP se puede utilizar para estudiar la neurodegeneración dopaminérgica.
Cuantificar los cambios en la morfología neuronal es un componente crítico de la investigación neurodegenerativa. En C. elegans,se han utilizado muchas cepas reporteras fluorescentes para visualizar cambios morfológicos y pérdida de neuronas. Las cepas adecuadas para la obtención de imágenes neuronales presentan una proteína fluorescente asociada con promotores específicos de la célula. Para los ensayos de neurodegeneración dopaminérgica, nuestro laboratorio ha utilizado la cepa BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)], que tiene una etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP) en el gen dat-1, expresada en las neuronas dopaminérgicas. Tenga en cuenta que el fenotipo de rodillo del BY200 tiene una penetrancia muy baja y rara vez se observa. Otras cepas comunes utilizadas para este tipo de imágenes incluyen BY250 [dat-1p::GFP], BY273 [baEx18[dat-1p::GFP+dat-1p::WT α-syn]], BZ555 [egIs1 [dat-1p::GFP]], y varias otras disponibles en el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) o a petición de laboratorios específicos1,21,22,29 . Estas cepas generalmente permiten la visualización de las tres clases de neuronas dopaminérgicas: neuronas cefálicas (CEP), deiridas anteriores (ADE) y postdeiridas (PDE). C. elegans no expresa naturalmente la proteína alfa sinucleína, pero cepas como BY273 han sido diseñadas para expresarla. Sin embargo, observamos que el sistema de puntuación que presentamos fue desarrollado utilizando BY200, que no expresa alfa sinucleína, y necesitaría ser validado con esa cepa (o cualquier otra cepa nueva) antes de su uso. Las neuronas dopaminérgicas adicionales están presentes en los hombres, pero rara vez se consideran porque los hombres normalmente comprenden <1% de una población de C. elegans. Aquí, nos centramos en las cuatro neuronas dopaminérgicas CEP que se encuentran en la región de la cabeza de C. elegans. Este conjunto de neuronas se localiza fácilmente bajo microscopía fluorescente, está presente tanto en gusanos hermafroditas como masculinos, no suele superponerse con otras áreas de autofluorescencia y se informa comúnmente en estudios de gusanos. En particular, aunque estas neuronas no están mielinizadas, las neuronas dorsales CEP (CEPD) están directamente expuestas al líquido corporal pseudocoelómico donde las neuronas ventrales CEP no lo están. Un conjunto saludable de dendritas CEP generalmente se muestra como líneas relativamente rectas e ininterrumpidas. Las dendritas degeneradas pueden mostrar cualquier combinación de irregularidades y signos de daño, incluidos puntos pronunciados llamados ampollas a lo largo de la línea de la dendrita y roturas en la línea de la dendrita. Ejemplos de neuronas CEP en diferentes niveles de degeneración se pueden ver en la Figura 1.
Aunque la neurodegeneración dopaminérgica está siendo estudiada por un número creciente de laboratorios de C. elegans, ha habido una gran variación en los métodos analíticos para cuantificar el daño neuronal dopaminérgico29,31,32,33,34. Muchos estudios publicados han informado sobre la presencia o ausencia de soma CEP con un sistema binario de puntuación de neuronas degenerativas versus típicas o de tipo salvaje31,32. Estos métodos de puntuación pueden identificar ciertos factores estresantes que inducen la neurodegeneración, pero no pueden cuantificar los detalles de la progresión del daño neuronal más sutil, o detectar fácilmente las diferencias entre la neurodegeneración inducida por productos químicos únicos u otras variables. Además, los sistemas de puntuación centrados en los cuerpos celulares pueden no ser sensibles a niveles menos graves de daño o al daño neuronal que afecta solo a una parte de la célula, como la dendrita. Dado que la dendrita parece tener el mayor rango de cambios morfológicos consistentemente detectables en respuesta a factores estresantes químicos, los hemos seleccionado como base para nuestro análisis. El sistema de puntuación que presentamos aquí está modificado a partir de escalas multipunto basadas en la morfología de las dendritas que se han utilizado previamente en nuestro laboratorio29,33. Este sistema expande estas escalas de cinco y seis puntos en una escala de siete puntos para tener en cuenta los cambios morfológicos relacionados con la edad, como un mayor número esperado de torceduras en las dendritas de adultos mayores, y para diferenciar entre el daño severo y la pérdida completa de dendritas. El propósito de introducir este sistema de puntuación es proporcionar la capacidad de capturar una imagen completa de la neurodegeneración en todos los niveles de daño neuronal y proporcionar un sistema universal para apoyar la consistencia en toda la investigación de neurodegeneración dopaminérgica de C. elegan. Debido a que la puntuación es inherentemente subjetiva, es fundamental maximizar la consistencia entre los individuos que anotan, y cegar al anotador a la identidad de las imágenes utilizando el cegamiento manual o un programa de cegamiento automático35. Para mejorar la consistencia, presentamos una serie de imágenes de entrenamiento y utilizamos las capacidades de video de JoVE para demostrar nuestro sistema de puntuación en detalle. Recomendamos utilizar un sistema que permita la puntuación cegada automatizada y permita al anotador cuantificar su consistencia de puntuación al volver a puntuar un subconjunto de imágenes. Esto es particularmente importante cuando se combinan o comparan datos de múltiples científicos, o cuando se capacita a científicos nuevos en la puntuación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo demuestra cómo utilizar la escala de siete puntos desarrollada en nuestro laboratorio para cuantificar los niveles de alteración morfológica y degeneración de la neurona dopaminérgica en C. elegans. Creamos y compartimos esta escala como una herramienta para estandarizar el análisis del trabajo de neurodegeneración dopaminérgica en gusanos. Reconociendo la importancia de estudiar las vías implicadas en enfermedades neurodegenerativas altamente prevalentes, muchos investigadores aprovechan la idoneidad del modelo de C. elegans para la visualización neurobiología para estudiar la neurodegeneración29,31,32,33. Sin embargo, aún no ha habido un esfuerzo para reducir la gran variación en la forma en que se cuantifica el daño neuronal a través de la investigación de neurodegeneración en gusanos. Por lo tanto, el sistema de puntuación que se presenta aquí tiene por objeto promover la coherencia en los análisis y permitir la comparación entre los estudios.
Nuestro sistema de puntuación se puede utilizar para analizar datos derivados de experimentos de C. elegans que utilizan reporteros fluorescentes específicos de la célula que permiten la visualización de neuronas dopaminérgicas, específicamente las dendritas CEP. Específicamente, las cepas marcadas en el gen dat-1 para la visualización GFP de las neuronas dopaminérgicas son compatibles con este protocolo de puntuación, aunque existen muchos otros modelos transgénicos relacionados de EP. Es posible que este sistema de puntuación también sea útil con esos modelos; sin embargo, esto debe validarse antes de usarlos. En particular, es posible (pero no probado hasta donde sabemos) que las cepas con mCherry no sean adecuadas para este protocolo, ya que la agregación de mCherry puede ser indistinguible de las ampollas o provocar estrés celular. En lugar de proporcionar un comentario sobre todos los modelos específicos de EP y trastornos neurodegenerativos relacionados, nos centramos en la puntuación de los datos de neurodegeneración en sí. Además, este protocolo se centra solo en la morfología neuronal y no considera los niveles de fluorescencia del soma. Los ensayos de neurodegeneración se pueden realizar junto con ensayos conductuales relevantes para enfermedades neurodegenerativas, como la locomoción, la esperanza de vida y los experimentos de duración de la salud. Los niveles de degeneración en modelos químicos, genéticos y basados en la edad establecidos de la EP también se pueden confirmar y detallar utilizando este sistema de puntuación. La medición de modelos, contribuyentes y vías asociadas con la EP y otras enfermedades neurodegenerativas puede aumentar el conocimiento científico sobre estos trastornos y apuntar hacia cómo manejar la creciente población de individuos afectados. Tener resultados de neurodegeneración comparables en toda la literatura es clave para apoyar este objetivo.
Para interpretar los resultados derivados de este sistema de puntuación, proponemos considerar cada dendrita puntuada como n=1, ya que diferentes neuronas dentro del mismo gusano a menudo responden de manera diferente al tratamiento. Esto puede ser impulsado por el hecho de que solo las neuronas CEPD están directamente expuestas al fluido corporal pseudoceoómico. Como tal, esto permite que la distribución de la puntuación de los grupos experimentales se muestre como proporciones del número total de dendritas puntuadas en cada grupo. Este método, utilizado para los resultados representativos que se muestran aquí, permite una fácil comparación entre los grupos de tratamiento, tiene en cuenta las respuestas diferenciales dentro del mismo gusano y se analiza fácilmente con una prueba de Chi cuadrado complementada por una corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. Una plantilla de ejemplo para registrar las puntuaciones de las neuronas y calcular los porcentajes se puede encontrar en el Archivo Suplementario 2. Hemos considerado dos métodos alternativos para el análisis de datos e identificamos fallas en cada uno. La primera opción es promediar las puntuaciones de las cuatro neuronas CEP para cada gusano. Esto parametriiza los datos; sin embargo, asume una relación lineal con el aumento de la puntuación y pierde información sobre cualquier variación en la respuesta al tratamiento dentro del mismo gusano. La segunda opción es sumar las puntuaciones de las cuatro neuronas CEP para cada gusano, lo que también parametriliza los datos. Esto todavía asume una relación lineal entre los puntajes, sin embargo, explica más hábilmente las diferencias dentro de cada gusano que los puntajes promedio al expandir los parámetros de los puntajes posibles. Sin embargo, los investigadores individuales deciden mostrar sus datos, los resultados deben considerarse junto con variables experimentales como la cepa y la edad del gusano; por ejemplo, los gusanos más viejos tienen un nivel basal de degeneración esperado más alto.
A medida que se interpretan estos resultados de la puntuación de neurodegeneración, los investigadores también deben ser conscientes de algunas advertencias y limitaciones del método de puntuación. En primer lugar, ciertos requisitos tecnológicos son necesarios para capturar imágenes adecuadas para la puntuación. El microscopio de imagen debe admitir canales de fluorescencia y ajustes de aumento y exposición que permitan una visualización clara de las dendritas CEP. Como se señala en el protocolo, los requisitos tecnológicos pueden reducirse mediante ajustes de protocolo como la puntuación de imágenes en vivo a través del campo microscópico en lugar de capturar imágenes para archivar y calificar en un momento posterior. En segundo lugar, los posibles métodos de análisis estadístico para estos datos son limitados ya que los datos no son paramétricos. Se presume que la escala de puntuación es progresiva, pero no puede considerarse numérica ya que existen opciones de puntuación discretas y los aumentos de puntuación no son necesariamente proporcionales entre sí con respecto a la función biológica. Por estas razones, las pruebas de chi cuadrado para la independencia son las más adecuadas para este tipo de datos, lo que significa que el análisis estadístico depende del observador para determinar la dirección de cualquier significación estadística. En particular, la prueba de chi cuadrado también solo analiza las diferencias en la distribución de la puntuación y no puede proporcionar evidencia de diferencias en categorías de puntuación específicas. Finalmente, aún no se ha estudiado la significación funcional de los cambios morfológicos cuantificados por este sistema de puntuación.
Las direcciones futuras impulsadas por el desarrollo de este sistema de puntuación implican la determinación de bases biológicas y correlaciones con las puntuaciones de las neuronas individuales. El estudio de la importancia funcional (por ejemplo, señalización neuronal, comportamiento de gusanos) de todos los puntos de la escala de puntuación informará cómo traducir mejor los resultados a conclusiones aplicables a la comprensión de las causas y consecuencias de las enfermedades neurodegenerativas y el desarrollo de opciones de prevención y tratamiento. La investigación futura sobre la neurodegeneración en gusanos debe tener como objetivo descubrir conexiones con otra morfología, como la forma y el tamaño del gusano. Además, la investigación de neurodegeneración puede ser apoyada por el estudio de otras cepas reporteras de C. elegans para medir puntos finales como la bioenergética, la producción de especies reactivas de oxígeno y la morfología mitocondrial.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer a Ian T. Ryde, por sus contribuciones al desarrollo de la escala de puntuación y por su apoyo durante la creación de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (T32ES021432 apoyó a KSM, y P42ES010356 a JNM).
Materials
| 96-well plate | VWR | 29442-056 | For imaging in wells |
| Blinder | Solibyte Solutions LLC | Free software that blinds between and within uploaded sets of image files | |
| BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] | Aschner Lab | C. elegans strain suitable for dopaminergic neuron fluorescent imaging. May be subsituted by other strains with a fluorescent reporter driven by cell-specific promotors Available upon request from the Meyer lab |
|
| complete K-medium | 51 mM sodium chloride, 32 mM potassium chloride, 3 mM calcium chloride, 3 mM magnesium sulfate, 13 mM cholesterol | ||
| Coverslips 22x22mm, No.1 glass | VWR VistaVision | 48366-067 | For imaging on slides |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | Solvent for rotenone exposures |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | Sotware for image manipulation |
| Keyence BZ-X All-in-one Fluoresence Microscope | Keyence | Used for fluorescent dopaminergic neuron image capture. May be substituted by other microscopes stuitable for fluorescent, high-resolution imaging | |
| Microscope Slides 3×1" | VWR VistaVision | 16004-420 | For imaging on slides |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Electron transport chain complex I inhibitor |
| Sodium Azide (NaN_3) | Sigma-Aldrich | S2002 | Paralytic |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S2770 | For bleach lysis |
| Sodium Hypochlorite | VWR | RC7495.5-32 | For bleach lysis |
| Tetramisole (Levamisole) Hydrochloride (HCl) | Sigma-Aldrich | L9756 | Paralytic |
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