고분해능 극저온 전자 단층촬영을 위한 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling을 이용한 시료 전처리

그림 1: 중요한 단계를 선택한 워크플로 요약Figure 1: Summary of the workflow with a selection of critical steps. 전체 프로토콜은 사용된 장비에 따라 플런지 동결, 극저온 형광 현미경, 극저온 집속 이온빔 밀링 및 초저온 전자 현미경을 포함한 시료 전처리의 4단계로 나뉩니다. 각 단계에서 몇 가지 핵심 사항이 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 1. 세포 배양 및 그리드의 급락 동결 선택한 세포를 배양하고 극저온 실험으로 이동하기 전에 실온에서 라벨링 및 처리 전략을 최적화합니다. 관심 대상은 형광 단백질 융합 또는 라이브 염색(예: Halo-Tag, LysoTracker, BODIPY, 라이브 항체 염색 등)을 사용하여 라벨링됩니다. 관심 있는 생물학적 과정을 조사하기 위해 화학적 또는 생물학적 제제(소분자, 특수 배지, siRNA 등)를 사용한 처리가 필요한 경우 라이브 셀 FLM 이미징을 사용하여 조건(예: 시간, 농도)을 최적화합니다.관심 부위가 이후 극저온 조건(예: NA, 노출 시간 등)과 최대한 일치하는 이미징 설정을 사용하여 충분한 수의 세포에서 배경 위에 성공적으로 국한될 수 있는지 확인합니다. 그리드 선택 및 준비사용된 셀 및 기준 마커에 적합한 구멍 크기와 간격이 있는 그리드를 선택합니다(1.3.1단계 참조). 구멍이 없는 연속 필름은 블로팅 후 잔류 버퍼가 너무 많아 유리화 효율이 감소하고 기준 비드의 검출을 방해할 수 있으므로 사용하지 마십시오. 세포와 그리드의 장기간 접촉을 위해, 그리드 지지대와 필름 재료가 생체 적합성인지 확인하십시오. Cryo-EM 그리드를 플라즈마 세척하여 친수성을 높입니다. 부착 세포 배양에 사용하려면 층류 후드에서 20분 동안 UV 방사선으로 플라즈마 세척 후 그리드를 멸균합니다. 임의로, 그리드는 세포 부착을 돕는 화합물, 예를 들어 폴리-L-라이신 또는 콘카나발린 A로 후술하는 바와 같이 전처리될 수 있다.참고 : 일반적으로 다음과 같은 그리드 / 샘플 조합이 상관 cryo-FIB 워크 플로우에서 성공적으로 사용되었습니다 : 효모 : Cu 또는 Au, 200 메쉬, R1 / 4 탄소 또는 SiO2 필름, 선택적으로 concanavalin A로 코팅; 대장균 : Cu 또는 Au, 200 메쉬, R1 / 4 탄소 또는 SiO2 필름; 클라미도모나스 라인하르티: Cu 또는 Au, 200 메쉬, R1/2 또는 R1/4 탄소 또는SiO2 필름; HeLa: Au, 200 메쉬, R1/4SiO2 필름, 폴리-L-라이신으로 코팅됨; HEK293 : Au, 200 메쉬, R1 / 4 SiO2 필름, 폴리 -L- 라이신으로 코팅. 효모 세포의 부착을 개선하기위한 Concanavalin A 코팅 :100μMCaCl2, pH 8.5를 갖는 10mM HEPES 완충액에 콘카나발린 A 1mg/mL의 코팅 용액을 준비합니다. 코팅 용액 한 방울(50μL)과 증류수 두 방울을 파라핀 필름 조각에 별도로 놓습니다. 역력 핀셋으로 플라즈마 세척 그리드를 집어 들고 필름 손상을 방지하기 위해 그리드에 수직인 움직임을 피하면서 코팅 용액 한 방울에 조심스럽게 삽입합니다. ~5초 배양 후 그리드를 비슷한 방식으로 물방울에 삽입하여 두 번 세척합니다. 마지막으로 그리드 뒷면에 여과지를 바르고 그리드를 완전히 건조시킨 후 핀셋에서 분리하여 과도한 액체를 닦아냅니다. 급락 동결을 위해 건조 된 그리드를 사용하십시오. 현탁 배양 및 부착 세포를 위한 Poly-L-lysine 코팅:0.1M 붕산나트륨 완충액, pH 8.5에 폴리-L-라이신 1mg/mL의 코팅 용액을 준비합니다. 혈장 세척 그리드를 세포 배양에 적합한 접시에 넣고 UV 방사선으로 20분 동안 멸균합니다. 모든 그리드를 덮을 수 있을 만큼 충분한 코팅 용액을 부드럽게 추가하고 37°C에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 액체를 흡인하고 세포를 원하는 농도로 파종하기 전에 PBS로 그리드를 두 번 부드럽게 세척합니다. 세포 및 기준 비드의 제조참고 : 기준 비드는 3D 상관 FIB 밀링을 허용하기 위해 FIB / SEM 현미경으로 촬영 한 이미지와 형광 데이터의 3D 등록에 필요합니다.FLM, SEM 및 IB(권장 직경 0.5-1μm)와 같은 모든 이미징 방식에서 인식할 수 있는 비드를 선택하되, 비드와 관심 있는 생물학적 특징을 더 쉽게 구별할 수 있도록 형광 이미징 중에 이러한 비드가 세포 표적 구조보다 더 빛나지 않도록 하십시오. 제조자에 의해 지시된 바에 따라 기준 비드(예를 들어,NaN3)에서 세포독성 보존제를 제거한다.참고: 관심 있는 생물학적 특징과 기준점을 더 쉽게 구분하기 위해 형광 방출 스펙트럼이 부분적으로만 겹쳐서 FLM 채널의 강도 차이에 따라 신호를 구별할 수 있는 경우에 유용합니다. 현탁 배양을 사용하는 경우 세포를 적절한 밀도(예: 효모 OD 600 = 0.8, 대장균 OD600 = 0.8-1.0, C. reinhardtii 1500 cells/μL)로 성장시키고 배지 변경, 화학 물질 첨가, 기아 등과 같은 실험에 필요한 처리를 수행합니다. 플런지 방법(수동/자동)에 따라 플라즈마 세척 그리드를 핀셋에 부착하고 ~1 x 105 beads/μL의 기준 비드 현탁액과 혼합된 세포 현탁액 4μL를 그리드의 필름 면에 적용합니다.참고: 적정 실험에서 세포 및 기준액의 최적 희석을 결정합니다(예: cryo-FLM 또는 FIB/SEM 확인, 아래 참조). 그러나 현탁액에서 성장한 대부분의 세포에 대해 1μm 기준 비드의 최종 농도는 ~1 x 105 beads/μL(재고에서 1:20 희석, 자세한 내용은 재료 표 참조)가 좋은 출발점임이 입증되었습니다. 부착 배양을 사용하는 경우 무균 배양을 위해 UV 방사선을 사용하여 그리드를 플라즈마 세척하고 멸균합니다. 필요한 경우 세포 부착을 돕는 화합물(예: 폴리-l-라이신, 피브로넥틴, 라미닌, 단계 1.2.2 참조)로 그리드를 미리 코팅합니다. 일반 배양 접시 또는 격자에 대한 세분화가 있는 접시의 그리드에 세포를 뿌리고 성장시킵니다. 실험에 필요한 샘플을 처리하고 급락 동결이 될 때까지 세포를 최적의 조건으로 유지합니다(예: HEK/HeLa의 경우 37°C/5% CO2 ). 배양 접시에서 그리드를 조심스럽게 제거하고 급락 핀셋에 부착하십시오. 기준점(1 x 105 beads /μL)과 혼합된 배양액 4 μL을 세포 베어링 측에 적용합니다. 수동 또는 자동 동결 절차를 사용하여 세포를 급락 동결합니다. 가능하면 셀이 기계적으로 손상되는 것을 방지하기 위해 셀 반대쪽에서만 그리드를 블롯합니다(그림 2A). 두 팔 자동 플런지 시스템에서는 셀을 향한 패드에 압지 대신 폴리테트라플루오로에틸렌(예: 테프론) 시트를 놓으면 됩니다. 그리드를 보관 상자로 옮기고 사용할 때까지 액체 질소(lN2)에 보관하십시오.주의 : ln2 및 기타 극저온 물질은 눈과 피부에 심각한 손상을 줄 수 있습니다. 개인 보호 장비(PPE)를 사용하고 위험한 N2 농도가 축적되지 않도록 환기가 잘 되는 공간에서만 작업하십시오.참고: 모든 후속 단계는 다운스트림 처리를 복잡하게 할 수 있으므로 세포 및 라멜라 표면의 오염을 피하기 위해 lN2 의 액상에서 가장 잘 수행되어야 합니다. 항상 깨끗한 액체 질소(예: 떠다니는 얼음을 제거하는 필터)를 사용하고, 불필요한 이송 단계를 제거하고, 가능하면 습도가 조절되는 환경에서 작업하여 떠다니는 얼음 결정과의 접촉을 줄입니다. 후속 극저온 형광 이미징 및 FIB 밀링을 위해 컷아웃과 셀이 위를 향하도록 AutoGrids에 플런지 동결 그리드를 장착하고 클립합니다(그림 2A). TEM에서 시료의 적절한 정렬을 보장하려면 밀링 방향이 Cryo-ET 틸트 축과 직교해야 합니다. 따라서 이 정렬에 도움이 되도록 클리핑하기 전에 AutoGrid에 방향 표시(예: LASER 조각 또는 제거 가능한 마커 점)를 배치합니다(그림 2A). cryo-FLM 및 FIB/SEM에서 그리드 품질(그림 2B)을 스크리닝합니다. 세포 밀도, 블로팅 시간 및 힘을 최적화하여 세포와 비드의 균일한 분포를 얻을 수 있습니다. 극저온 형광 현미경에서 반사광 이미징을 사용하거나 cryo-FIB-SEM을 사용하여 세포와 기준 비드가 모두 명확하게 보이는지 확인합니다(그림 2B, 흰색 화살표). 필요한 경우 더 나은 조건(예: 다양한 세포 농도 및/또는 블로팅 시간)으로 플런징을 반복합니다. 적절한 플런지 매개변수가 발견되면 새로운 실험 라운드마다 그리드 스크리닝을 반복하지 마십시오. 그림 2: SEM 및 IB를 사용한 적합한 그리드 스크리닝 . (A) 방향 표시는 TEM으로의 올바른 로딩을 단순화하기 위해 밀링 방향에 수직인 AutoGrid에 배치해야 합니다. 셀은 조립된 AutoGrid에서 위를 향하도록 장착됩니다. (B) 플런지 동결 후 SEM에서 그리드를 검사하여 플런지 조건을 평가하고 최적화합니다. a) 그리드당 셀이 너무 많아서는 안 됩니다. 예를 들어 HeLa 세포의 경우 1-4개 이상의 세포/정사각형을 사용하지 마십시오. 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae )와 같은 더 작은 세포의 경우(여기에 표시됨) 4-6개의 세포 덩어리가 유용한 것으로 밝혀졌습니다. b) 기준 구슬(흰색 화살표)이 명확하게 보여야 하며 세포 주위에 완충액이 너무 많아서는 안 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 2. 극저온 형광 광학 현미경 각 그리드에 대해 (광시야) 형광 및 미분 간섭 대비(DIC) 또는 반사 모드에서 개요를 수집하고 형광 신호가 있는 적절한 그리드 사각형을 선택합니다. 관심 있는 셀과 충분한 수의 기준 마커를 모두 포함하는 시야를 선택합니다(6-12).세포와 비드가 너무 조밀하지 않고 각 사각형의 중심을 향해 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오. FIB-SEM 및 TEM 기기 모두에 액세스 할 수있는 사각형 만 선택하므로 200 메쉬 그리드의 그리드 가장자리에서 최소 3 개의 사각형이 떨어져 있습니다 (그림 3A, 빨간색 원 내부). 선택된 각 그리드 사각형에서 추후 디콘볼루션에 적합한 초점 단계, 즉 축 분해능 한계의 <1/2인 형광 스택을 획득합니다. 가능하면 높은 개구수(NA) 대물렌즈를 사용하여 광자 수와 위치 정확도를 높입니다.NA 0.9 대물렌즈를 사용하는 컨포칼 현미경에서 300nm 스텝 크기의 스택을 획득하여 나이퀴스트 값을 오버샘플링합니다. 필요한 경우 여러 색상 스택을 기록합니다(그림 2B). 나중에 사용할 때까지 그리드를 lN2 아래에 보관하십시오.참고: 최적의 스텝 크기를 결정하려면 현미경 제어 소프트웨어에서 계산한 값을 선택하거나 온라인 도구9를 사용하십시오. 과도한 블리드스루는 colocalization 실험에 해롭기 때문에 채널 간 신호의 블리드스루를 확인합니다. 그러나 일부는 다중 색상 스택에서 색수차를 수정하는 데 유리할 수 있습니다. 적절한 소프트웨어10,11을 사용하여 스택을 디콘볼루브하고 등방성 픽셀 크기가 필요한 경우 다시 슬라이스합니다.7 디콘볼루션은 실온에서와 마찬가지로 FLM 신호를 정리하고 국위 파악 정확도를 향상시킬 수 있습니다(그림 3C). 그림 3: 디콘볼루션을 통한 FLM 스택 획득 및 데이터 개선을 위한 사각형 선택 . (A) eGFP-Ede1(녹색) 및 mCherry-Atg8(자홍색)을 발현하는 효모 세포로 급락한 그리드의 개요. 구슬과 세포가 잘 분포 된 위치를 선택하되 그리드의 가장자리 (빨간색 음영)는 피하십시오. 상자는 형광 스택을 채취한 세포 분포가 양호한 위치를 나타냅니다. (B) 디콘볼루션 후 노란색 상자 사각형(A에서)에서 촬영한 다중 색상 스택의 최대 강도 투영(MIP). FLM 스택의 디콘볼루션은 원치 않는 배경 신호를 크게 정리하고 디콘볼루션 전(C)과 후의 가우스 피팅(D)에서 알 수 있듯이 z의 비드를 보다 정확하게 현지화하는 데 도움이 됩니다(피팅은 3DCT에서 수행되었으며 1로 표시된 비드에 대해 표시됨). 이미지는 빨간색 채널의 확대된 MIP 보기를 보여줍니다(여기: 552nm, 방출: 585-650nm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 3. 집중 이온빔 밀링 그리드를 cryo-FIB-SEM 기기에로드하고 컷 아웃 및 / 또는 방향 표시를 사용하여 나중에 TEM에 배치 할 수 있도록 적절한 방향을 보장합니다 (그림 2A). 밀링 방향이 TEM의 틸트 축에 수직인지 확인하십시오. 가스 분사 시스템(GIS; CpMePtMe3) FIB-SEM 설정에 의해 미리 정의된 스테이지 위치에서 그리드를 보호 유기 금속 층으로 코팅합니다. 나중에 TEM에서 기준 비드 국소화를 방해할 수 있으므로 너무 많이 적용하지 마십시오. 플라즈마 코팅기를 사용하여 금속 백금을 도포하여 시료 충전을 줄입니다.참고 : GIS 코팅에 대한 설정을 사용할 수없는 경우 짧은 코팅 (~ 2 초)을 연속적으로 수행 한 다음 FIB 밀링을 수행하여 쉽게 찾을 수 있습니다. 라멜라 가장자리 주변의 보호 유기 금속 층의 명백한 프린지 없이 중전류(~100pA)에서 샘플을 성공적으로 절단할 수 있는지 확인하십시오. GIS 바늘의 시간과 거리(샘플과 관련하여)는 모두 고려해야 할 중요한 매개변수입니다. 실온 설정(즉, 45°C)에서 GIS 바늘을 작동하지 말고 균일한 코팅(25-27°C)을 제공하기 위해 가능한 한 차갑게 작동하십시오. SEM 그리드 오버뷰를 기록하고 FLM 뷰와 2D 상관 관계를 수행하여 형광 스택이 기록된 그리드 사각형을 찾습니다. 두 뷰를 수동으로 검사하거나 다양한 소프트웨어 패키지 7,10,12를 사용하여 그리드 사각형을 찾습니다. 여기서는 뷰 간 등방성 스케일링과 함께 3D 강체 변환을 사용하는 3D 상관 관계 도구 상자(3DCT)7에 초점을 맞춥니다. 3DCT 기능에 대한 훌륭한 연습은 온라인에서 사용할 수 있습니다13.FLM 및 SEM 그리드 개요(오른쪽 클릭)에서 서포트 필름의 그리드 바 또는 구멍과 같은 랜드마크와 같은 최소 4개의 해당 위치를 선택하고 표시하고 표시된 지점 간의 변환을 계산합니다(상관 관계). 다음으로, FLM 스택이 획득된 해당 그리드 사각형의 중앙에 마커를 배치하고 SEM 보기에서 마커의 위치를 예측합니다(correlate; 그림 4A). 각 상관 그리드 사각형에 대해 선택한 FIB 밀링 각도 (10 ° 사전 틸트 셔틀의 경우 25 ° -45 °)에서 저전류 (≤ 10pA) 이온 빔 (IB) 이미지를 가져옵니다. 형광 데이터와 일치하는 시야(즉, 위치 및 배율)를 선택합니다. 200 메쉬 그리드의 경우 형광 및 FIB / SEM 데이터를 수집하여 그리드 막대를 포함한 단일 그리드 사각형을 포함합니다 (그림 3A 및 그림 4A 참조).참고: Cryo-ET 동안 상당한 각도 범위를 잃지 않고 충분한 수의 기준 비드를 식별할 수 있도록 가능한 한 얕은 각도로 밀링을 수행해야 합니다. 예를 들어, 스테이지 틸트가 17°, 셔틀 프리틸트가 45°, FIB 빔 틸트가 52°인 경우, 라멜라 프리틸트는 10°이며, 이는 많은 TEM 극저온 홀더의 최대값인 -50°에서 +70°까지 기울임으로써 TEM에서 선호하는 각도 범위인 ±60°를 충족합니다. 동일한 사각형의 SEM 이미지를 촬영하여 형광 및 이온 빔 보기에서 해당 비드를 식별하는 데 도움이 됩니다. 다음 (그림 4B) 단계에 설명된 대로 3DCT를 사용하여 각 위치에 대한 디콘볼루션된 3D FLM 스택 및 2D 이온 빔 뷰를 정합합니다.해당 리슬라이싱된 3D FLM 스택 및 이온 빔(IB) 뷰를 3DCT에 로드합니다.참고: 다색 형광 데이터는 최대 3개의 개별 단일 채널 스택 파일로 로드할 수 있습니다. 형광 데이터에서 4개의 기준 비드를 선택하고 위치 목록을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 x, y, z 신호의 가우스 피팅을 통해 3D 위치를 결정합니다. IB 이미지에서 해당 비드를 선택하고 초기 3D 상관관계(상관관계)를 수행합니다. 형광 이미지에 더 많은 비드를 반복적으로 추가하고, 3D 위치를 구체화하고, IB 보기에서 위치를 예측하여 등록에 더 많은 비드를 빠르게 추가하고 상관 관계의 정확성을 확인할 수 있습니다. 3DCT에서는 상관관계의 일관성을 평가하기 위해 RMSE(root-mean-square error) 값이 제공된다7.RMSE 값이 작고 현지화 정확도(~300nm) 정도인지 확인합니다. 상관 관계의 정확성을 결정하려면 등록 단계에서 의도적으로 형광과 이온 빔 모두에서 명확하게 식별할 수 있는 일부 기준 비드를 생략합니다. 이온 빔 이미지에서 예측된 위치와 실제 위치를 확인하여 이를 수행합니다. 예측 위치가 실제 위치와 크게 다르면 새 기준점 집합으로 초기 상관 관계를 반복합니다.참고: 6-8개의 비드를 상관시키는 것은 FLM 스택 및 IB 보기의 정확한 등록에 충분한 것으로 입증되었습니다. 그러나 광범위한 z 값에 대해 더 많은 기준점(최대 12-15)을 추가하면(예: 그리드 막대 또는 인접한 사각형에서 비드를 선택하여) 상관 관계의 정확도가 향상될 수 있습니다. 표적 셀룰러 신호를 선택하고, FLM 스택에 3D 위치를 맞추고, 변환을 적용하여 IB 보기에서 표적 위치를 예측합니다(그림 4B).참고: IB 목록에 해당 항목이 없는 FLM 위치 목록의 모든 항목은 예측할 신호로 처리됩니다. 각 상관 정사각형에 대해 관심 있는 특징의 예측 위치를 FIB-SEM 기기로 전송하고 라멜라 밀링 패턴을 배치합니다(그림 4C). 수동으로 위치를 이동하거나 (예 : 세포 또는 기준 비드와 같은 가시적 인 랜드 마크까지의 거리를 측정하여) 예를 들어 SerialFIB14에서 구현 된대로 자동화 및 스크립팅을 사용합니다. 셀당 여러 신호가 있는 경우 처리량을 늘리기 위해 동일한 라멜라에 가능한 한 많은 관심 지점(POI)을 포함하도록 패턴을 배치합니다. 먼저 라멜라를 150-250 nm의 최종 두께로 거칠게 분쇄 한 다음 미세 분쇄합니다. 라멜라의 처짐을 유발하여 이전에 획득한 FLM 스택에 대한 실제 관심 피쳐의 이동을 초래하는 단계(예: 응력 제거 컷15)를 피하십시오. 수동3 또는 자동14,16,17,18 FIB 밀링 절차를 사용하십시오. 두 가지 방법 중 하나를 사용하면 위쪽과 아래쪽에서 대칭적으로 얇게 하여 관심 있는 특징이 라멜라의 중앙에 남아 있는지 확인합니다. 각 라멜라에 대한 밀링 정확도를 평가하려면 3.4단계에서와 동일한 등록을 수행합니다. 그러나 이번에는 FIB 밀링 후 최종 IB 이미지를 사용하여 관심있는 특징의 예측 된 위치가 최종 라멜라 내에 포함되어 있는지 확인하십시오. 또는 3DCT의 출력 및 사용자 정의 스크립트(19)에서 얻은 FLM 스택의 회전된 투영을 최종 IB 이미지와 오버레이합니다(그림 4C, 작은 삽입물). 그림 4 : 3D 상관 FIB 밀링 절차. (A) 그리드의 FLM (왼쪽)과 SEM (오른쪽) 개요의 2D-2D 상관 관계는 이전에 형광 스택을 찍은 그리드 사각형을 찾는 데 사용됩니다. (B) 선택된 각 사각형에 대해, 3DCT (컬러 박스)에서 해당 기준 위치의 3D-2D 등록 후, 관심있는 생물학적 특징의 위치가 FLM 데이터에서 선택된다. 이온 빔 이미지(빨간색 원)에서 해당 위치의 예측에 기초하여, 라멜라 준비를 위한 부위가 선택된다. (C) 주사 전자 현미경 (SEM) 및 이온 빔 (IB) 이미지는 밀링 중에 타겟을 중심에 유지하는 데 사용됩니다. 150-250 nm의 최종 두께는 추가 다운스트림 처리에 적합한 것으로 밝혀졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 4. 상관 TEM 그리드를 TEM에 로드하여 라멜라 방향(컷아웃 또는 방향 표시에서 알 수 있음)이 기울기 축에 수직인지 확인합니다.참고: 다양한 제조업체의 현미경은 Tomo5, TOM 또는 SerialEM20과 같은 다양한 소프트웨어를 사용하여 제어할 수 있습니다. 여기서는 후자에 초점을 맞춥니다. 격자 몽타주와 라멜라를 포함하는 각 격자 사각형에 대한 개요를 획득합니다. 배율 및 노출 시간이 총 전자 선량에 크게 추가하지 않고 TEM 이미지에서 기준 비드를 시각화하는 데 적합한지 확인합니다. 각 라멜라의 고해상도 TEM 맵(몽타주)을 획득합니다. 레지스터 및 3D-2D는 FLM 스택을 3DCT의 TEM 그리드 사각형 및 라멜라 개요와 연관시킵니다. 단계 3.6에서 기술된 바와 동일한 절차를 사용하여 형광(x, y, z – 가우시안 핏) 및 투과 전자 현미경 이미지에서 대응하는 비드 위치를 선택한다. 그런 다음 FLM 채널에서 관심 위치를 선택하고 TEM 개요로 전송합니다. 필요한 경우 FLM과 저배율 TEM 간의 첫 번째 상관 관계와 저배율 TEM에서 고배율 TEM의 두 번째 상관 관계로 구성된 2단계 절차를 사용합니다(그림 5). 수동으로(랜드마크까지의 거리 측정), SerialEM20 내에서 사용할 수 있는 등록 및 지도 도구 또는 CorRelator21과 같은 외부 소프트웨어를 사용하여 위치를 전송합니다. 상관된 위치에서 틸트 시리즈를 설정하고 실행합니다. 적절한 배율, 초점 흐림 및 총 선량을 사용하십시오(자세한 내용은 재료 표 및 표 1 참조). 라멜라에 의해 결정된 사전 기울기에서 획득을 시작하고(또한 단계 3.4의 주석 참조) 용량 대칭 기울기 방식22를 사용합니다. 수동 또는 배치 수집을 사용합니다. 그림 5: TEM에서 상관 위치의 위치 파악. 성공적인 3D 상관 FIB 밀링 및 투과 전자 현미경으로의 전송 후, FLM 스택의 기준 비드 (컬러 박스)와 TEM 개요 사이의 각 밀링 된 사각형에 대해 3D-2D 등록이 수행되어 cryo-ET (빨간색 원)의 잠재적 위치를 파악합니다. 그런 다음 더 높은 배율의 라멜라 개요(확대)를 획득하여 단층 촬영을 보다 정확하게 설정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.