高分解能クライオ電子線トモグラフィーのための3D相関集束イオンビームミリングによるサンプル調製

図 1: ワークフローの概要と重要なステップの選択。 プロトコル全体は、使用する機器に応じて、プランジ凍結、クライオ蛍光顕微鏡、クライオフォーカスイオンビームミリング、クライオ電子顕微鏡などのサンプル調製の4つの段階に分かれています。各ステップで、いくつかの重要なポイントが強調表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 1.細胞培養とグリッドのプランジ凍結 選択した細胞を培養し、低温実験に移行する前に室温で標識および処理戦略を最適化します。目的のターゲットは、蛍光タンパク質融合またはライブ染色(Halo-Tag、LysoTracker、BODIPY、ライブ抗体染色など)を使用して標識されます。目的の生物学的プロセスを調査するために化学的または生物学的薬剤(低分子、特殊培地、siRNAなど)による処理が必要な場合は、生細胞FLMイメージングを使用して条件(時間、濃度など)を最適化します。後のクライオ条件(NA、露光時間など)に可能な限り一致するイメージング設定を使用して、目的の部位が十分な数の細胞のバックグラウンド上に正常に局在化できることを確認します。 グリッドの選択と準備使用するセルと指標マーカーに適した穴のサイズと間隔を持つグリッドを選択します(手順1.3.1を参照)。穴のない連続フィルムは、ブロッティング後の残留バッファーが多くなりすぎてガラス化効率が低下し、基準ビーズの検出を妨げる可能性があるため、使用しないでください。細胞とグリッドを長時間接触させるには、グリッドサポートとフィルム材料が生体適合性であることを確認してください。 クライオ電子顕微鏡グリッドをプラズマ洗浄して、親水性を高めます。接着細胞培養に使用する場合は、層流フード内でUV照射で20分間プラズマ洗浄した後、グリッドを滅菌します。任意選択で、グリッドは、以下に記載されるように、ポリ−L−リジンまたはコンカナバリンAなどの細胞接着を助ける化合物で前処理されてもよい。注:一般に、次のグリッド/サンプルの組み合わせが、相関クライオFIBワークフローで正常に使用されています:酵母:CuまたはAu、200メッシュ、R1 / 4炭素またはSiO2 フィルム、オプションでコンカナバリンAでコーティング。 大腸菌:CuまたはAu、200メッシュ、R1 / 4炭素またはSiO2 膜; クラミドモナスラインハルティ:CuまたはAu、200メッシュ、R1 / 2またはR1 / 4炭素またはSiO2 フィルム。HeLa:Au、200メッシュ、R1 / 4 SiO2 膜、ポリ-L-リジンでコーティング。HEK293:Au、200メッシュ、R1/4SiO2 膜、ポリ-L-リジンでコーティング。 酵母細胞の付着を改善するためのコンカナバリンAコーティング:100 μM CaCl2、pH 8.5を含む10 mM HEPESバッファー中の1 mg/mLのコンカナバリンAのコーティング溶液を調製します。1滴(50μL)のコーティング溶液と2滴の蒸留水を別々にパラフィンフィルムの上に置きます。 プラズマ洗浄したグリッドを逆力ピンセットで持ち上げ、フィルムの損傷を防ぐためにグリッドに垂直な動きを避けながら、コーティング溶液の滴に慎重に挿入します。 ~5秒のインキュベーション後、同様の方法でグリッドを水滴に挿入して2回洗浄します。最後に、グリッドの背面にろ紙を塗布して余分な液体を吸い取り、グリッドを完全に乾かしてからピンセットから解放します。乾燥したグリッドをプランジ凍結に使用します。 浮遊培養および接着細胞のためのポリ-L-リジンコーティング:ポリ-L-リジン 1 mg/mL のコーティング溶液を 0.1 M ホウ酸ナトリウム緩衝液、pH 8.5 で調製します。 プラズマ洗浄したグリッドを細胞培養に適したディッシュに入れ、UV照射により20分間滅菌します。 すべてのグリッドを覆うのに十分なコーティング溶液を静かに加え、37°Cで少なくとも2時間インキュベートします。液体を吸引し、グリッドをPBSで2回穏やかに洗浄してから、細胞を所望の濃度に播種します。 細胞および基準ビーズの調製注:フィデューシャルビーズは、3D相関FIBミリングを可能にするために、FIB / SEM顕微鏡で撮影された画像との蛍光データの3D登録に必要です。すべてのイメージングモダリティ、すなわちFLM、SEM、IB(推奨直径0.5〜1 μm)で認識可能なビーズを選択しますが、ビーズと目的の生物学的特徴を区別しやすくするために、蛍光イメージング中に細胞標的構造を凌駕しないようにします。製造業者の指示に従って、基準ビーズ(NaN3など)中の細胞傷害性防腐剤を除去します。注:対象となる生物学的特徴と基準を簡単に区別するには、蛍光発光スペクトルが部分的にのみ重なり合って、FLMチャネルの強度差に基づいて信号を区別できるようにすると便利です。 浮遊培養を使用する場合は、細胞を適切な密度(酵母OD600 = 0.8、大腸菌OD 600 = 0.8-1.0、C.ラインハルティ1500細胞/μLなど)に増殖させ、培地の交換、化学薬品の添加、飢餓などの実験に必要な処理を行います。プランジ法(手動/自動)の必要に応じてプラズマ洗浄したグリッドをピンセットに取り付け、4 μLの細胞懸濁液を~1 x 105ビーズ/μLの基準ビーズ懸濁液と混合した溶液をグリッドのフィルム側に塗布します。注:滴定実験における細胞および基準の最適な希釈を決定します(例えば、クライオFLMまたはFIB / SEMをチェックすることにより、以下を参照)。しかし、懸濁液中で増殖したほとんどの細胞では、1 μmの基準ビーズの最終濃度が~1 x 105 ビーズ/μL(ストックから1:20希釈、詳細は 材料表 を参照)が良好な出発点であることが証明されています。 付着培養を使用する場合は、無菌培養のためにUV放射を使用してグリッドをプラズマ洗浄および滅菌します。必要に応じて、細胞接着を助ける化合物(例えば、ポリ-l-リジン、フィブロネクチン、ラミニン;ステップ1.2.2を参照)でグリッドをプレコートする。通常の培養皿またはグリッドの細分化された皿のグリッド上に細胞を播種して成長させます。 実験に必要なサンプルを処理し、急降下凍結するまで細胞を最適な状態に維持します(例:HEK/HeLaの場合は37°C/5%CO2 )。培養皿からグリッドを慎重に取り外し、急落するピンセットに取り付けます。フィデューシャルを混合した培養液4 μL(1 μmフィデューシャルの場合は1 x 105 ビーズ/μL)を細胞担持側に塗布します。 手動または自動凍結手順を使用して細胞を急落凍結します。可能であれば、セルの反対側からグリッドのみを吸い取り、セルの機械的損傷を防ぎます(図2A)。両腕自動プランジシステムでは、セルに面したパッドに吸い取り紙の代わりにポリテトラフルオロエチレン(テフロンなど)シートを配置することでこれを実現します。グリッドを収納ボックスに移し、使用するまで液体窒素(lN2)に保管します。注意: lN2 およびその他の極低温物質は、目や皮膚に深刻な損傷を与える可能性があります。個人用保護具(PPE)を使用し、危険なN2 濃度の蓄積を避けるために、換気の良い場所でのみ作業してください。注:後続のすべてのステップは、下流の処理を複雑にする可能性があるため、セルおよびラメラ表面の汚染を避けるために、lN2 の液相で実行するのが最適です。常にきれいな液体窒素(浮氷を除去するためのフィルターなど)を使用し、不要な移動ステップを排除し、可能であれば湿度が制御された環境で作業することにより、浮遊氷結晶との接触を減らします。 プランジ凍結グリッドをAutoGridsに取り付けてクリップし、カットアウトとセルを上に向けて(図2A)、その後のクライオ蛍光イメージングとFIBミリングを行います。TEM内のサンプルの適切な位置合わせを確保するには、フライス加工方向がクライオETチルト軸に直交している必要があります。したがって、この位置合わせを支援するために、クリッピングする前にオートグリッドにオリエンテーションマーク(レーザー彫刻や取り外し可能なマーカードットなど)を配置します(図2A)。 クライオFLMおよびFIB/SEMでグリッド品質(図2B)をスクリーニングします。 細胞密度、ブロッティング時間、および力を最適化して、細胞とビーズの均一な分布を取得します。クライオ蛍光顕微鏡で反射光イメージングを使用するか、クライオFIB-SEMを使用して、細胞と基準ビーズの両方がはっきりと見えることを確認します(図2B、白い矢印)。 必要に応じて、細胞濃度やブロッティング時間を変化させるなど、より良い条件でプランジを繰り返します。適切なプランジパラメータが見つかったら、新しい実験ラウンドごとにグリッドスクリーニングを繰り返さないでください。 図2:SEMとIBを使用した適切なグリッドのスクリーニング(A)TEMへの正しいロードを簡素化するために、フライス加工方向に垂直なAutoGridにオリエンテーションマークを配置する必要があります。セルは、組み立てられたオートグリッドに上向きに取り付けられます。(B)プランジ凍結後、グリッドはSEMで検査され、プランジ条件を評価および最適化します:a)グリッドあたりのセルが多すぎてはいけません。たとえば、HeLa細胞の場合、1〜4セル/正方形を超えて使用しないでください。サッカロマイセス・セレビシエ(ここに示す)のようなより小さな細胞に対しては、4〜6個の細胞の塊が有用であることが見出されている。b)基準ビーズ(白い矢印)がはっきりと見えるようにし、細胞を取り囲むバッファーが多すぎないようにする必要があります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 2. クライオ蛍光光学顕微鏡 各グリッドについて、(広視野)蛍光および微分干渉コントラスト(DIC)または反射モードで概要を取得し、蛍光信号を含む適切なグリッド正方形を選択します。対象のセルと十分な数の基準マーカー (6-12) の両方を含む視野を選択します。セルとビーズが均等に分布し、密度が高すぎず、各正方形の中心に向かっていることを確認します。FIB-SEMとTEM機器の両方にアクセス可能な正方形のみを選択し、200メッシュグリッドのグリッドエッジから少なくとも3つの正方形を選択します(図3A、赤い円の内側)。 選択したグリッド正方形のそれぞれで、後のデコンボリューションに適したフォーカスステップ、つまり軸方向の分解能限界の<1/2を備えた蛍光スタックを取得します。可能であれば、高開口数(NA)対物レンズを使用して、フォトン数と位置特定の精度を高めます。NA 0.9対物レンズの共焦点顕微鏡で、ナイキスト値をオーバーサンプリングして300 nmステップサイズのスタックを取得します。必要に応じて、複数のカラースタックを記録します(図2B)。グリッドは、さらに使用するまでlN2 の下に保管してください。注意: 最適なステップサイズを決定するには、顕微鏡制御ソフトウェアによって計算された値を選択するか、オンラインツール9を使用します。過度のブリードスルーは共局在実験に有害であるため、チャンネル間の信号のブリードスルーを確認してください。しかしながら、いくつかは、多色スタックにおける色収差を補正するのに有利な場合がある。 適切なソフトウェア10、11を使用してスタックをデコンボリューションし、等方性ピクセルサイズが必要な場合は7つを再スライスします。デコンボリューションは、室温の場合と同様に、FLM信号をクリーンアップし、ローカリゼーションの精度を向上させる可能性があります(図3C)。 図3:FLMスタック取得のための正方形の選択とデコンボリューションによるデータの改善 。 (A)eGFP-Ede1(緑色)およびmCherry-Atg8(マゼンタ)を発現する酵母細胞をプランジしたグリッドの概要。ビーズとセルの分布が良好な位置を選択しますが、グリッドのエッジ(赤の網掛け)は避けてください。ボックスは、蛍光スタックが採取された細胞分布が良好な位置を示しています。(B)デコンボリューション後の黄色の四角形(Aから)で撮影されたマルチカラースタックの最大強度投影(MIP)。FLMスタックのデコンボリューションは、不要なバックグラウンド信号を大幅にクリーンアップし、デコンボリューション前(C)とデコンボリューション後(D)のガウスフィットから明らかなように、z内のビーズをより正確に局在化するのに役立ちます(フィットは3DCTで実行され、1でマークされたビードに対して示されています)。画像は、赤チャンネル(励起:552 nm、発光:585-650 nm)の拡大されたMIPビューを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 3. 集束イオンビームミリング グリッドをクライオFIB-SEM装置にロードし、カットアウトおよび/またはオリエンテーションマークのいずれかを使用して、後でTEMに配置するための適切なオリエンテーションを確保します(図2A)。フライス加工方向がTEMの傾斜軸に垂直であることを確認してください。 ガス噴射システム(GIS;CpMePtMe3)は、FIB-SEMセットアップによって事前に定義されたステージ位置で、グリッドを保護有機金属層でコーティングします。塗布しすぎると、後でTEMでの基準ビーズの局在化が妨げられる可能性があるため、適用しすぎないでください。プラズマコーターを使用して金属白金を塗布し、サンプルの帯電を減らします。注:GISコーティングの設定が利用できない場合は、短いコーティング(~2秒)を連続して実行し、その後にFIBフライス加工を行うことで簡単に見つけることができます。中電流(~100 pA)でも、ラメラエッジ周辺の保護有機金属層に明らかなフリンジがなく、サンプルが正常に切断できることを確認してください。GIS針の時間と距離(サンプルに対する)の両方が考慮すべき重要なパラメータです。GISニードルを室温設定(45°C)で操作するのではなく、できるだけ低温で操作して、均一なコーティング(25〜27°C)を提供します。 SEMグリッドオーバービューを記録し、FLMオーバービューとの2D相関を実行して、蛍光スタックが記録されているグリッド正方形を見つけます。両方のビューを手動で検査するか、さまざまなソフトウェアパッケージ7、10、12を使用してグリッドの正方形を見つけます。ここでは、ビュー間の等方性スケーリングを伴う3D剛体変換を使用する3D相関ツールボックス(3DCT)7に焦点を当てています。3DCT機能の優れたウォークスルーはオンラインで入手できます13。FLMとSEMの両方のグリッド概要(右クリック)で、少なくとも4つの対応する位置、たとえばグリッドバーやサポートフィルムの穴などのランドマークを選択してマークし、マークされたポイント間の変換を計算します(相関)。 次に、FLMスタックが取得された対応するグリッド正方形の中央にマーカーを配置し、SEMビューでの位置を予測します(相関; 図4A)。 相関グリッドの正方形ごとに、選択したFIBミリング角度(10°プレチルトシャトルの場合は25°〜45°)で低電流(≤10 pA)イオンビーム(IB)画像を撮影します。蛍光データに一致する視野(位置と倍率)を選択します。200メッシュグリッドの場合、蛍光およびFIB/SEMデータを取得して、グリッドバーを含む単一のグリッド正方形を含めます(図3Aおよび図4Aを参照)。注:フライス加工は、クライオET中に大きな角度範囲を失うことを避け、十分な数の基準ビーズを識別できるように、できるだけ浅い角度で実行する必要があります。例:ステージチルトが17°、シャトルプリチルトが45°、FIBビームチルトが52°の場合、ラメラプレチルトは10°であり、多くのTEMクライオホルダーの最大である-50°から+70°まで傾けることにより、TEMの好ましい角度範囲±60°をほぼ満たします。 同じ正方形のSEM画像を撮影して、蛍光およびイオンビームビューで対応するビーズの識別に役立てます。 デコンボリューションされた3D FLMスタックと各位置の2Dイオンビームビューの登録を、次の(図4B)手順で説明します。対応するスライスされた3D FLMスタックとイオンビーム(IB)ビューを3DCTでロードします。注:マルチカラー蛍光データは、最大3つの個別のシングルチャンネルスタックファイルとしてロードできます。 蛍光データで4つの基準ビーズを選択し、位置リストを右クリックして、x、y、zの信号のガウスフィッティング を介して 3D位置を決定します。IB画像内の対応するビーズを選択し、初期3D相関(相関)を実行する。 蛍光画像にビーズを繰り返し追加し、3D位置を調整し、IBビューでの位置を予測して、見当合わせにビーズをすばやく追加し、相関の精度を確認します。3DCTでは、相関の一貫性を評価するために二乗平均平方根誤差(RMSE)値が提供されます7。RMSE値が小さく、局在化精度(~300 nm)のオーダーであることを確認してください。相関の精度を判断するには、蛍光ビームとイオンビームの両方で明確に識別できる基準ビーズを意図的に除外します。これを行うには、イオンビーム画像内の予測位置と実際の位置を確認します。予測位置が実際の位置と大きく異なる場合は、新しい指標セットを使用して初期相関を繰り返します。注:6〜8個のビーズを相関させることで、FLMスタックとIBビューを正確に登録するのに十分であることが証明されています。ただし、広範囲のz値に対して指標(最大12〜15)を追加すると(たとえば、グリッドバーまたは隣接する正方形でビーズを選択するなど)、相関の精度が向上する可能性があります。 ターゲットセルラー信号を選択し、FLMスタックに3D位置を適合させ、変換を適用してIBビューでターゲット位置を予測します(図4B)。注:FLMポジションリストのエントリで、IBリストに対応するものがないエントリは、予測されるシグナルとして扱われます。 相関する各正方形について、関心のある特徴の予測位置をFIB-SEM装置に転送し、ラメラミリングパターンを配置します(図4C)。手動で位置を転送するか(たとえば、セルや基準ビーズなどの目に見えるランドマークまでの距離を測定することによって)、またはSerialFIB14などに実装されている自動化とスクリプトを使用します。セルごとに複数の信号がある場合は、スループットを向上させるために、同じラメラにできるだけ多くの関心ポイント(POI)が含まれるようにパターンを配置します。 最初に粗く、次にラメラを最終厚さ150〜250nmに微細に粉砕します。ラメラのたるみを引き起こし、以前に取得したFLMスタックに対して関心のある実際の特徴が移動するステップ(応力緩和カット15など)は避けてください。手動3または自動14,16,17,18 FIBフライス盤手順のいずれかを使用します。どちらの方法でも、ラメラを上下から対称的に薄くすることにより、目的のフィーチャがラメラの中心に残るようにします。 各ラメラのフライス加工の精度を評価するには、手順3.4と同じレジストレーションを実行します。ただし、今回は、FIBミリング後の最終的なIB画像を使用して、関心のある特徴の予測位置が最終ラメラ内に含まれているかどうかを確認します。あるいは、3DCTの出力とカスタムスクリプト19から得られたFLMスタックの回転投影を、最終的なIB画像(図4C、小さなインサート)と重ね合わせる。 図4:3D相関FIBフライス加工手順 。 (A)グリッドのFLM(左)とSEM(右)の概要の2D-2D相関を使用して、蛍光スタックが以前に取得されたグリッドの正方形を特定します。(B)選択した各正方形について、3DCT(色付きのボックス)内の対応する基準位置を3D-2D登録した後、FLMデータで目的の生物学的特徴の位置を選択します。イオンビーム画像(赤い円)における対応する位置の予測に基づいて、ラメラ調製のための部位が選択される。(C)走査型電子顕微鏡(SEM)およびイオンビーム(IB)画像を使用して、フライス加工中にターゲットを中央に保ちます。150〜250nmの最終厚さは、さらなる下流処理に適していることがわかっています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 4. 相関TEM グリッドをTEMにロードし、ラメラの向き(切り欠きまたは向きのマークから明らかなように)が傾斜軸に垂直であることを確認します。注:異なるメーカーの顕微鏡は、Tomo5、TOM、SerialEM20などのさまざまなソフトウェアを使用して制御できます。ここでは、後者に焦点が当てられています。 ラメラを含む各グリッド正方形のグリッドモンタージュと概要を取得します。倍率と露光時間が、総電子線量を大幅に増加させることなく、TEM画像内の基準ビーズを視覚化するのに適していることを確認してください。各ラメラの高解像度TEMマップ(モンタージュ)を取得します。 レジスタと3D-2Dは、FLMスタックをTEMグリッドの正方形および3DCTのラメラオーバービューと相関させます。ステップ3.6で説明したのと同じ手順で、蛍光画像(x、y、z-ガウスフィット)および透過型電子顕微鏡画像内の対応するビード位置を選択します。次に、FLMチャンネルで関心のある位置を選択し、TEM概要に転送します。必要に応じて、FLMと低倍率TEMの間の第1の相関と、低倍率TEMから高倍率TEMへの第2の相関を含む2段階の手順を使用します(図5)。 手動で(ランドマークまでの距離を測定する)、SerialEM20内で利用可能な登録およびマップツール、またはCorRelator21などの外部ソフトウェアのいずれかで位置を転送します。 相関位置でチルトシリーズをセットアップして実行します。適切な倍率、焦点ぼけ、および総線量を使用してください(詳細については、 材料の 表と 表1 を参照してください)。ラメラによって決定されたプレチルトで取得を開始し(ステップ3.4の注記も参照)、用量対称チルトスキーム22を使用する。手動取得またはバッチ取得のいずれかを使用します。 図5:TEMにおける相関位置の局在化。 3D相関FIBミリングと透過型電子顕微鏡への転写が成功した後、FLMスタック内の基準ビーズ(色付きのボックス)とTEMの概要の間の各ミルされた正方形に対して3D-2Dレジストレーションが実行され、クライオET(赤い円)の潜在的なサイトが特定されます。その後、より高い倍率のラメラオーバービュー(ズームイン)を取得して、断層撮影をより正確に設定できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。